随着经济的发展和生活方式的改变,我国居民的饮食结构呈现新的特征,脂肪摄入过多是其中不容忽视的问题。《中国居民营养与慢性病状况报告(2020年)》显示,目前我国居民膳食脂肪的供能比已超过了30%的推荐上限[1]。长期高脂饮食容易引起脂质代谢紊乱,导致肥胖、高血脂等疾病高发。因此,高脂饮食导致的健康风险问题值得关注。

枇杷叶在我国已有数百年的使用历史,根据《中华人民共和国食品安全法》和《新食品原料安全性审查管理办法》,枇杷叶目前已被批准为新食品原料,可应用于食品生产与加工。研究显示,枇杷叶中含有熊果酸、齐墩果酸、山楂酸等三萜酸类物质,绿原酸、槲皮苷、芦丁等多酚类成分以及有机酸和多糖等[2-5]。本课题组前期研究发现,熊果酸具有缓解肌肉衰减综合征的潜力[6];同时其他研究发现,熊果酸可以通过不同途径发挥抗炎或调节机体脂质代谢的作用,如通过调控过氧化物酶增殖体激活受体α(peroxisome proliferation activated receptor-α,PPAR-α)及其下游的固醇调节元件结合蛋白-1c(sterol regulatory element binding protein-1c,SREBP-1c)、硬脂酰辅酶A去饱和酶1(stearoyl-CoA desaturase 1,SCD1)等靶点来影响脂质代谢相关基因蛋白表达,或通过解偶联蛋白3/AMP激活的蛋白激酶(uncoupling protein 3/AMP-activated protein kinase,UCP3/AMPK)信号通路增加肌肉组织脂肪酸吸收以及脂质消耗,进而改善机体脂质沉积等[7]。还有研究基于斑马鱼模型探讨熊果酸对非酒精性脂肪肝病的影响,发现熊果酸可以有效降低斑马鱼体内总胆固醇(total cholesterol,TC)、甘油三酯(triglyceride,TG)的含量,并且通过实时荧光定量PCR(real-time qPCR,RT-qPCR)发现,熊果酸还可以降低雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)、乙酰辅酶A羧化酶(acetyl-coAcarboxylase,ACC1)、脂肪酸合成酶(acid synthase,FASN)和SREBP-1c mRNA的表达量,减少斑马鱼肝脏脂质沉积[8]。还有研究关注了熊果酸对于胰岛素抵抗大鼠脂质代谢的影响,结果显示,熊果酸能够显著降低其血清TG、TC、游离脂肪酸(free fatty acid,FFA)、肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)水平,改善胰岛素抵抗[9]。

运动是有益于维持机体健康的有效生活方式,《中国居民膳食指南(2022)》建议各年龄段人群坚持每天运动,保持“吃动平衡”[10]。此外,目前很多天然食物及其成分被证实具有调节脂质代谢的作用,其与运动联合作用是降低机体健康风险的可行思路。有研究发现,从灵芝中提取的一种甾醇(灵芝马酮)联合有氧运动对高脂血症大鼠的肝脏病理结构、氧化应激水平和脂质代谢异常等方面有积极的改善作用,并且二者联合干预对肝脏中SREBP1c、FASN、羟甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶(HMG-CoA reductase,HMGCR)等基因的表达可产生调节作用[11]。还有研究发现,海藻活性成分岩藻甾醇联合运动可改善肥胖大鼠脂质代谢紊乱和抗氧化系统失衡,并抑制慢性炎症,其机制与调节核因子E2相关因子2(nuclear factor erythroid-2-related actor 2,Nrf2)表达水平和核因子κB(nuclear factor kappa-B,NF-κB)磷酸化水平有关[12]。然而,现有研究尚未关注枇杷叶提取物与运动联合干预对高脂饮食小鼠脂质代谢的影响。本研究重点关注枇杷叶提取物与运动联合干预是否能够更好地调节高脂饮食小鼠的脂质代谢水平,并基于代谢组学解析相关作用机制,以期为枇杷叶在相关功能食品开发中的应用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

枇杷叶,洪雅县瓦屋山药业有限公司;SPF级雄性C57BL/6J小鼠,体重为18～20 g,共50只,北京华阜康生物科技股份有限公司,动物生产许可证号SCXK(京)2019-0008;基础饲料(RD D12450B,脂肪供能比10%)、高脂饲料(RD D12492,脂肪供能比60%),北京科澳协力饲料有限公司。TG、TC、FFA、高密度脂蛋白胆固醇(high density lipoprotein cholesterol,HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(low density lipoprotein cholesterol,LDL-C)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)、过氧化氢酶(catalase,CAT)检测试剂盒,南京建成生物工程研究所;BCA蛋白检测试剂盒,碧云天生物技术有限公司;SDS-PAGE凝胶快速制备试剂盒,上海雅酶生物医药公司;蛋白抗体,爱博泰克生物科技有限公司及Affinity公司。

1.2 仪器与设备

T10型高速组织匀浆机,德国IKA公司;7600型全自动生化分析仪,日本日立公司;Spectra Max i3型酶标仪,美国MD公司;ZS-PT-Ⅲ型小动物跑台、ZS-ZL型小动物握力器,北京众实科技有限公司;7.0T型小动物核磁成像系统,美国Varian公司;Fusion FX7型高端多功能活体成像系统,法国Vilber公司;V-GES型垂直电泳槽、ELITE 300 PLUS型电泳仪,中国威泰克公司;UHPLC-Q Exactive HF-X型超高效液相色谱串联傅里叶变换质谱,美国赛默飞公司;HSS T3型色谱柱,美国Waters公司。

1.3 实验方法

1.3.1 枇杷叶提取物的提取方法

将枇杷叶粗粉用10倍量体积分数为95%的乙醇提取3次,每次120 min,得到乙醇提取液,然后减压回收乙醇,得浸膏;将浸膏依次用石油醚、体积分数为1%的氢氧化钠溶液、水洗脱,再用无水乙醇加热溶解,加活性炭回流脱色,滤过;用热乙醇反复洗涤残渣,最后经过浓缩、结晶,得到枇杷叶提取物(含有质量分数为50%的熊果酸)。

1.3.2 动物饲养与分组

雄性C57BL/6小鼠于(24±1)℃、12 h昼夜循环条件下适应性生长7 d,按照体重随机分为5组,每组10只。空白组(normal diet,ND)进行常规饲料喂饲结合质量浓度为5 g/L的羧甲基纤维素钠(sodium carboxymethyl cellulose,CMC-Na)溶液灌胃处理,模型组(high fat diet,HFD)采用高脂饲料喂饲结合质量浓度为5 g/L的CMC-Na溶液灌胃处理,运动组(high fat diet with exercise,Ex)采用高脂饲料喂饲结合运动和质量浓度为5 g/L的CMC-Na溶液灌胃处理,枇杷叶提取物组(high fat diet with loquat leaf extract,LLE)采用高脂饲料喂饲结合枇杷叶提取物混悬液灌胃处理,枇杷叶提取物-运动组(high fat diet with exercise and loquat leaf extract,Ex-LLE)采用高脂饲料喂饲结合运动和枇杷叶提取物混悬液灌胃联合处理。灌胃样品制备时,将枇杷叶提取物混悬于质量浓度为5 g/L的CMC-Na溶液中,含有氯化钠和柠檬酸钠各0.01 mol/L及氯化钾0.005 mol/L。灌胃剂量以1 kg小鼠摄入100 mg枇杷叶提取物表示,单位为100 mg/kg。根据《中华人民共和国食品安全法》和《新食品原料安全性审查管理办法》,目前枇杷叶的每日推荐摄入量不超过10 g。根据体表面积比进行人鼠剂量转换可知,本研究采用剂量在推荐剂量范围内[13]。对于运动小鼠,其运动程序为:实验起始至第3周,每日于跑台上以10 m/min速度匀速跑步30 min;第4周至第6周,每日于跑台上以10 m/min速度匀速跑步20 min, 随后在20 min内匀加速至18 m/min;在此基础上,第7周至第13周训练以18 m/min速度匀速跑步20 min。饲养期间小鼠每天进行灌胃处理,周一至周五连续5 d进行运动训练,自由摄食与饮水,每周称量体重。

本研究已通过中国疾病预防控制中心营养与健康所伦理委员会审批(伦理审批号:2020-NINH-IACUC-011)。

1.3.3 小鼠运动行为测试

在实验第13周,让小鼠于跑台上适应性练习后在坡度为5°,速度为18 m/min条件下跑步至力竭状态,设备显示的运动距离记为力竭运动距离。

在充分休息状态下对小鼠进行前肢握力测试。测试时,抓网水平安装,让小鼠前肢自然握住抓网,在其尾部施加平行于抓网的力使小鼠前肢从抓网脱落,设备显示的数据记为前肢握力。正式测试前,对小鼠进行适应性练习。

1.3.4 小鼠体成分分析

在实验第13周对小鼠进行异氟烷气体麻醉,利用核磁成像系统对小鼠进行体成分分析。扫描所得图像利用Inveon Research Workplace 4.2软件(德国西门子公司)进行脂肪组织与骨骼肌比例分析。

1.3.5 小鼠血清及脏器组织理化指标分析

实验干预满13周后,将小鼠禁食12 h并采血处死。血液于5 600 r/min下离心15 min并分离血清,利用全自动生化分析仪进行血清TG、TC、LDL-C及HDL-C水平分析。解剖分离小鼠肝脏及腓肠肌,匀浆处理后分析组织内TG与FFA含量,以及MDA与CAT水平,结果以每克蛋白中各指标的物质的量表示,单位为μmol/g。

1.3.6 Western-blot分析

随机混合同组小鼠肝脏,用预冷的PBS冲洗干净,与裂解液混合,冰浴下匀浆与裂解,随后在4 ℃条件下将组织匀浆并离心,收集上清液,利用BCA检测试剂盒测试匀浆液蛋白含量。组织匀浆液加入上样缓冲液,随后煮沸,冷却后分装冻存于-80 ℃。

测试时,将样品上样在SDS-PAGE凝胶上。经电泳分离后,将靶向蛋白转移到PVDF膜上,该膜与相应的一抗在4 ℃下孵育过夜,随后与二抗孵育,用Tris盐缓冲液清洗后使用VILBER Fusion FX7成像系统检测蛋白条带。

1.3.7 代谢组学分析

将甲醇与乙腈按体积比为1∶1混合,配制提取液。将血清样本与提取液混合,以L-2-氯苯丙氨酸为内标,涡旋振荡混匀,随后低温超声提取。将提取后的样品静置、离心,吸取上清液,用氮气吹干。将乙腈与水按体积比为1∶1混合,配制复溶解液,在吹干后的样品中加入复溶解液,漩涡混匀后低温超声萃取、离心,吸取上清液待测。

液相分离条件:ACQUITY UPLC HSS T3型色谱柱(100 mm×2.1 mm,1.8 μm),柱温40 ℃,进样量 2 μL。 洗脱条件:流动相A为体积分数95%的水和体积分数5%的乙腈,含有体积分数0.1%的甲酸;流动相B为体积分数47.5%的乙腈、47.5%的异丙醇和5%的水,含有体积分数为0.1%的甲酸。洗脱梯度:0～3.5 min,0～24.5%流动相B,流速0.4 mL/min;3.5～5.0 min,24.5%～65.0%流动相B,流速0.4 mL/min;5.0～5.5 min,65.0%～100.0%流动相B,流速0.4 mL/min;5.5～7.4 min,100.0%流动相B,流速0.4～0.6 mL/min;7.4～7.6 min,100.0%～51.5%流动相B,流速 0.6 mL/min;7.6～7.8 min,51.5%流动相B,流速0.5～0.6 mL/min;7.8～9.0 min,100.0%流动相A,流速0.4～0.5 mL/min;9.0～10.0 min,100.0%流动相A,流速0.4 mL/min。

质谱条件:样品经电喷雾电离,采用正负离子扫描模式采集质谱信号,喷雾电压±3 500 V,扫描范围m/z 70～1 050,辅助气流速13 arb,鞘气流速 50 arb,加热温度425 ℃,毛细管温度325 ℃,归一化的碰撞能为20-40-60 V循环碰撞能。一级质谱分辨率为60 000,二级质谱分辨率为7 500,采用DDA模式采集数据。

1.4 数据处理

代谢组学分析数据导入Progenesis QI软件进行处理,最终得到数据矩阵。将数据信息导入美吉生物云平台,进行偏最小二乘判别(PLS-DA)分析,以变量权重值(VIP)大于1和Student’s t检验的P值小于0.05为条件筛选组间差异性代谢物。代谢物信息导入Metlin与HMDB数据库进行鉴别,并基于鉴别结果利用KEGG数据库进行差异代谢物的通路分析。

小鼠体重、能量摄入、脂质含量等分析结果以平均值±标准差表示。利用SPSS22.0软件对组间数据进行单因素方差分析及Tukey检验,P<0.05记为显著性差异,有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 枇杷叶提取物联合运动对小鼠体重和脏器指数的影响

枇杷叶提取物联合运动对小鼠体重与脏器指数的影响,实验结果见图1。由图1(a)可知,各组小鼠在实验期间体重呈现上升趋势。由图1(b)和图1(c)可以看出,在实验起始,各组小鼠体重无显著差异,在干预结束后,Ex组、LLE组及Ex-LLE组小鼠体重显著低于HFD组(P<0.05),但进食高脂饮食的小鼠组间能量摄入情况并无显著差异,这表明Ex、LLE及Ex-LLE干预均可以有效控制高脂饮食小鼠的体重增长,且并不影响进食。此外,由图1(d)至图1(f)可知,高脂饮食显著增加了小鼠肝脏、附睾脂肪与腹腔脂肪的脏器指数,但Ex、LLE及Ex-LLE干预均可以显著降低高脂饮食下小鼠脏器指数的升高(P<0.05),其中与HFD组相比,Ex-LLE干预下小鼠肝脏指数降低了8.1%,附睾脂肪指数降低了22.9%,腹腔脂肪指数降低了54.0%。

利用核磁扫描对小鼠体成分进行分析,实验结果见图2。由图2(a)可知,高脂饮食小鼠体内脂肪组织占比为全身扫描成像的16.3%,显著高于ND组(P<0.05)。在Ex、LLE及Ex-LLE干预下,高脂饮食小鼠体内脂肪组织比例较HFD组出现显著下降(P<0.05),其中在Ex-LLE干预下降低了60.9%,与ND组无显著性差异。此外,由图2(b)可知,各组小鼠间体内骨骼肌比例无显著差异,但Ex组及Ex-LLE组小鼠体内骨骼肌比例较其他组呈现上升趋势。

2.2 枇杷叶提取物联合运动对小鼠脂质水平的影响

2.2.1 对小鼠血清脂质水平的影响

枇杷叶提取物联合运动对小鼠血清脂质水平的影响,实验结果见图3。血清TC、TG、LDL-C、HDL-C是衡量体内血脂水平的指标[14]。据报道,HFD可以显著提高小鼠体内TG、TC、LDL-C水平[15]。由图3可知,HFD组小鼠血清TG、TC与LDL-C水平均显著高于ND组,且HDL-C水平显著低于ND组,表明该研究中高脂饮食小鼠出现了血脂异常(P<0.05)。与HFD组相比,Ex、LLE及Ex-LLE干预均可以显著降低血清TG与LDL-C水平,提高HDL-C水平,对TC水平的影响无显著性差异,其中Ex-LLE干预下的血清TG与LDL-C水平分别较HFD组下降了47.1%和28.5%[(图3(a)、图3(d)],HDL-C水平较HFD组提高了26.2%[图3(c)](P<0.05)。

2.2.2 对小鼠肝脏脂质水平的影响

枇杷叶提取物联合运动对小鼠肝脏脂质水平的影响,实验结果见图4。骨骼肌和肝脏等非脂肪组织中过多的脂质沉积称为异位脂肪沉积[16]。本研究中,HFD组小鼠肝脏TG及FFA水平均显著高于正常饮食的ND组(P<0.05),表明高脂饮食小鼠的肝脏出现了脂质沉积。由图4(a)、图4(c)可以看出,Ex、LLE干预及二者联合干预并未显著抑制高脂饮食导致的肝脏TG含量升高,但LLE及Ex-LLE干预可以显著降低高脂饮食小鼠肝脏内FFA水平,其中LLE干预下肝脏FFA水平较HFD组下降28.0%,Ex-LLE干预下肝脏FFA水平较HFD组下降41.0%(P<0.05),表明Ex与LLE联合作用对于降低肝脏脂质水平可以达到更好的效果。

2.2.3 对小鼠骨骼肌脂质水平的影响

枇杷叶提取物联合运动对小鼠骨骼肌脂质水平的影响,实验结果见图5。HFD组小鼠腓肠肌内TG、TC及FFA水平均较常规饮食的ND组出现显著升高,表明本研究中高脂饮食导致小鼠骨骼肌处出现脂质异位沉积。同样由图5可见,与HFD组小鼠相比,Ex组显著降低了小鼠骨骼肌内的FFA水平(P<0.05),LLE饮食干预显著降低了小鼠骨骼肌内TC与FFA水平(P<0.05),而当二者结合时,小鼠骨骼肌内TG水平较HFD组降低了13.4%[图5(a)],TC水平降低了36.4%[图5(b)],FFA水平降低了34.9%[图5(c)],均呈现显著性差异(P<0.05)。本研究结果表明,相比于单独的Ex以及LLE,Ex与LLE结合对于改善小鼠骨骼肌处的脂质异位沉积具有更全面的效果。

2.3 枇杷叶提取物联合运动对小鼠机体氧化应激水平的影响

枇杷叶提取物联合运动对小鼠机体氧化应激水平的影响,实验结果见图6与图7。长期高脂饮食会导致机体内能量过剩,使线粒体代谢加快,产生更多的氧自由基,破坏机体氧化应激的平衡状态[17]。运动可以有效消耗机体内过剩的能量,对于糖脂代谢调节起到积极作用,但不同运动强度与形式对机体氧化应激状态有着不同影响,合理的运动强度可降低机体氧化应激水平,而长期的高强度运动则会引起内源性氧化剂与抗氧化剂的失衡,进而引起全身性氧化应激[18-21]。脂质过氧化标志性产物MDA与可以分解过氧化氢进而降低机体氧化应激损伤的CAT是反映机体氧化应激水平的直观指标[22-24]。前期研究显示,小强度、中等强度与递增强度的跑台运动均可以对高脂饮食大鼠起到抗氧化作用[25]。然而在本研究中,由图6与图7可以看出,Ex组小鼠肝脏与骨骼肌处MDA含量与CAT活性并未较HFD组出现显著变化,推测可能与动物品系和运动训练条件不同有关。此外,如图7所示,在LLE及Ex-LLE干预下,小鼠骨骼肌处MDA水平分别降低28.0%、19.5%,骨骼肌CAT活性分别提高了19.8%、11.5%,呈现显著差异(P<0.05),表明氧化应激状态出现明显改善。有研究也证实,LLE中富含的多酚、黄酮、倍半萜糖苷等是其发挥抗氧化作用的有效物质[26-28]。因此,LLE及Ex-LLE干预具有调节高脂饮食小鼠骨骼肌氧化应激水平的积极作用。

2.4 枇杷叶提取物联合运动对小鼠体内脂质代谢与氧化应激信号通路的影响

枇杷叶提取物联合运动对小鼠脂质代谢与氧化应激信号通路的影响,分析结果见图8。由图8(a)和(b)可知,HFD组小鼠肝脏中p-AMPK/AMPK、PPAR-α与CPT-1的蛋白表达水平均较ND组出现明显下降,而FAS蛋白表达水平出现明显上升,这表明高脂饮食下小鼠肝脏脂质合成水平出现上升,而脂肪酸分解利用情况出现下降。AMPK信号通路是调控糖脂代谢过程的关键通路之一,其通过调节下游PPAR-α的表达与活性进而参与影响脂肪酸的合成与氧化分解[29-31]。研究显示,递增强度跑台运动可以显著提升肥胖小鼠的p-AMPK/AMPK水平[32],但LLE的总三萜酸和总黄酮提取物对肥胖小鼠肝脏AMPK的基因表达水平并无显著影响[33]。本研究中,Ex、LLE及Ex-LLE干预分别可以对小鼠脂质代谢变化产生一定改善作用,其中与HFD组相比,Ex-LLE干预对于提高肝脏p-AMPK/AMPK磷酸化水平,提升PPAR-α与CPT-1蛋白表达水平和降低FAS蛋白表达水平作用最为明显,这表明枇杷叶提取物和运动联合作用能够协同降低小鼠肝脏中的脂质合成水平,并促进脂肪酸β-氧化,从而发挥更好的脂代谢调节作用。

Nrf2是抗氧化信号转导的关键调节因子,参与血红素加氧酶-1(heme oxygenase 1,HO-1)等抗氧化酶的调节和编码[34]。由图8(c)和(d)可以看出,HFD组小鼠肝脏中Nrf2与HO-1蛋白表达水平较ND组出现明显降低,表明其机体抗氧化能力受到影响。Ex对这一改变的影响不大,但LLE及Ex-LLE干预可以明显提升Nrf2与HO-1蛋白表达水平,表明LLE以及Ex-LLE可以有效增强机体抗氧化能力,调节氧化应激水平;并且提示,Nrf2-HO-1是LLE及Ex-LLE干预发挥体内抗氧化作用的关键通路,这一结果与前期报道中有关枇杷叶提取物三萜酸缓解代谢综合征的作用机制一致[35]。

运动、枇杷叶提取物以及二者联合干预对高脂饮食小鼠体内脂质代谢和氧化应激水平的影响结果总结见表1。从表1可以看出:单独Ex作用仅对小鼠血清脂质水平及骨骼肌FFA水平呈现显著差异;单独LLE作用仅对小鼠血清脂质水平,肝脏FFA水平及骨骼肌TC、FFA水平以及氧化应激水平呈现显著差异;二者结合时的作用效果最为全面。

2.5 小鼠血清非靶向代谢组学分析

对生物体内的代谢物进行检测与系统计算可以直接并准确地反映不同干预方式下机体内的应答变化[36]。本研究对不同干预组的小鼠血清进行了非靶向代谢组学分析,从而进一步解析不同干预方式对小鼠体内代谢的影响与作用机制。

2.5.1 多元统计分析

对各组小鼠血清代谢物检测数据进行PLS-DA分析,结果见图9。由图9可以看出,ND组、Ex组、LLE组及Ex-LLE组小鼠的血清代谢轮廓均与HFD组呈现明显区别。PLS-DA模型的R2X,R2Y和Q2值见表2,ND组与HFD组间R2X(cum)为0.519,R2Y(cum)为0.996,Q2(cum)为0.895;Ex组与HFD组间R2X(cum)为0.520,R2Y(cum)为0.999,Q2(cum)为0.745;LLE组与HFD组间R2X(cum)为0.311,R2Y(cum)为0.997,Q2(cum)为0.740;Ex-LLE组与HFD组间R2X(cum)为0.483,R2Y(cum)为0.992,Q2(cum)为0.800。各组数据均具有较好的预测率和解释率,表明模型可靠。

2.5.2 差异性代谢物分析

在PLS-DA分析的基础上,以VIP>1和P<0.05为条件进行组间差异性代谢物的筛选。图10呈现了各组间差异性代谢物的数量。本研究基于HFD组和ND组之间的差异性代谢物,重点挖掘了在Ex、LLE、Ex-LLE干预方式下的差异性代谢物变化呈现显著回调的物质。

由图10可知,ND组与HFD组和Ex组与HFD组之间有11种共同的差异性代谢物,其中有10种在3组间呈现不同变化趋势。高脂饮食情况下运动干预回调的差异性代谢物分析结果见表3。由表3可知,与ND组小鼠相比,小鼠血清中Glycocholate、Taurochenodeoxycholic acid等4种代谢物含量在高脂饮食情况下显著上升,而Ex干预后显著抑制,8-iso-PGA1等6种代谢物在高脂饮食情况下显著下降,而Ex干预后显著提升。同样,从图10中可以看出,ND组与HFD组和LLE组与HFD组之间有18种共同的差异性代谢物。高脂饮食情况下枇杷叶提取物干预回调的差异性代谢物结果见表4。表4中有11种代谢物在3组间呈现不同变化趋势,即与ND组小鼠相比,Pantothenic acid在高脂饮食情况下显著上升,而LLE干预后显著抑制,其余10种代谢物在高脂饮食情况下均显著下降,而LLE干预后显著上升。与之相似,由图10可以看出,ND组与HFD组和Ex-LLE组与HFD组之间有20种共同的差异性代谢物。高脂饮食情况下枇杷叶提取物联合运动干预回调的差异性代谢物结果见表5。表5中有12种代谢物在3组间呈现不同变化趋势,即与ND组小鼠相比,Hypoxanthine、PA(12:0/16:0)在高脂饮食情况下显著上升,而Ex-LLE干预后出现显著抑制,Methylsuccinic acid等10种代谢物在高脂饮食情况下显著下降,而Ex-LLE干预后显著上升。

2.5.3 代谢通路富集分析

基于各组间的差异性代谢物,本研究进一步进行了KEGG代谢通路的富集分析,以解析关键差异性代谢物所参与的功能途径。代谢通路影响因子见图11。图11中,横轴代表代谢物在通路中的重要性,纵轴代表代谢物参与通路的富集显著性,每个红点代表一条KEGG通路,红点越大且颜色越深表明通路的重要性越大。本研究以重要性影响值大于0.1,P<0.05为条件筛选具有显著意义的代谢通路,并在图11中进行标识。

由图11(a)可以看出,Ex组与HFD组间差异性代谢物所涉及的重要通路有2条,由图11(b)可以看出LLE组与HFD组间差异性代谢物所涉及的重要通路有8条,而Ex组和LLE组均富集了D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代谢与丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢通路。研究表明,D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代谢与丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢是糖尿病与肥胖患者体内出现显著变化的代谢通路[37-38],其可以在运动联合药物、膳食多酚等不同干预下产生显著变化[39-40],氨基酸及其产物可以通过参与三羧酸循环和脂肪酸β氧化,进而参与机体脂质代谢,而氨基酸水平的失调可以通过调控代谢通路加重肝脂质代谢紊乱[41]。与文献[37-41]报道一致,本研究中Ex与LLE可能同样通过这两条代谢途径影响小鼠脂质代谢情况。此外,由图11(c)可以看出Ex-LLE组与HFD组间差异性代谢物所涉及的重要通路有1条,而鞘脂代谢是LLE组与Ex-LLE组共同富集的代谢通路。研究表明,鞘脂代谢与脂质代谢紊乱、炎症等多种生物学过程有关,是动脉粥样硬化小鼠中产生变化的典型代谢通路[42],同时调控鞘脂代谢已成为治疗非酒精性脂肪肝等疾病的潜在靶点[43]。因此,LLE和Ex-LLE有可能也通过影响鞘脂代谢来影响脂质代谢。另外,本研究采用的LLE中含有50%的熊果酸,有研究表明,熊果酸在一定程度上可以改善高脂饮食诱导的胰岛素抵抗大鼠脂代谢异常,有效保护肝细胞,从而避免过量脂质的侵害[44]。此外,绿原酸也是枇杷叶中含有的典型酚酸成分[5],其可以通过激活苯丙氨酸羟化酶的活性来提高苯丙氨酸向酪氨酸的转化水平,进而影响苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸代谢途径等来改善肝脏损伤,影响高脂饮食小鼠的鞘脂代谢[45]。

此外,有研究评估了食物成分与运动联合干预模式对机体健康的影响,如魔芋多糖联合运动干预可以通过降低血清TG、TC水平,提高肝脏SOD水平,降低肝脏MDA水平等,进而明显改善2型糖尿病大鼠的脂代谢紊乱,减少脂质沉积,降低脂质过氧化水平[46];代谢组学分析显示,乳酸菌+菊粉+多聚葡萄糖联合有氧运动均可以降低黄嘌呤、次黄嘌呤、单磷酸腺苷等的含量,增加鞘氨醇等含量,激活AMP活化蛋白激酶,改善高血糖小鼠的鞘脂代谢[47]。因此,本研究中Ex与LLE结合干预可能也是通过与上述研究相似的途径来调节高脂饮食小鼠的脂质代谢水平的。

3 结 论

高脂饮食导致小鼠出现血脂异常、肝脏与骨骼肌处脂质沉积等现象。通过对高脂饮食小鼠分别给予Ex、LLE、Ex-LLE干预,结果发现,Ex-LLE可以显著控制高脂饮食小鼠体重增长,降低小鼠体内脂肪组织比例,调节其血清中TG、HDL-C与LDL-C水平,抑制肝脏中FFA与骨骼肌中TG、TC、FFA的沉积,并改善骨骼肌氧化应激水平,其效果比Ex和LLE单独作用更为全面。这些效果的实现可能是通过调节AMPK与Nrf2-HO-1信号通路和影响D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代谢,丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢及鞘脂代谢实现的。本研究结果旨在为进一步阐述枇杷叶在功能食品研发中的相关应用提供科学依据。

参考文献：

[1] 国家卫生健康委疾病预防控制局. 中国居民营养与慢性病状况报告(2020年)[M]. 北京:人民卫生出版社, 2021: 19-103.

[2] PARK B, NOMURA T, FUKUDOME H, et al. Chemical constituents of the leaves of Eriobotrya japonica[J]. Chemistry of Natural Compounds, 2019, 55(5): 942-944.

[3] FU Y, FENG K L, WEI S Y, et al. Comparison of structural characteristics and bioactivities of polysaccharides from loquat leaves prepared by different drying techniques [J]. International Journal of Biological Macromolecules, 2020, 145: 611-619.

[4] WU Y X, JIAN T Y, LV H, et al. Antitussive and expectorant properties of growing and fallen leaves of loquat (Eriobotrya japonica) [J]. Revista Brasileira de Farmacognosia, 2018, 28(2): 239-242.

[5] NAWROT-HADZIK I, GRANICA S, ABEL R, et al. Analysis of antioxidant polyphenols in loquat leaves using HPLC-based activity profiling [J]. Natural Product Communications, 2017, 12(2): 163-166.

[6] 王婧. D-半乳糖对肌肉衰减综合征的诱导效应和抗肌肉衰减因子研究[D]. 北京: 中国疾病预防控制中心营养与健康所, 2019.WANG J. Study of the induction effect of D-galactose on muscle wasting syndrome and anti-muscle wasting factors [D]. Beijing: National Institute for Nutrition and Health, Chinese Center for Diseases Control and Prevention, 2019.

[7] 朱英国. 熊果酸调控脂肪细胞炎症和脂质代谢及其机制研究[D]. 雅安: 四川农业大学, 2019.ZHU Y G. The effects and mechanism of ursolic acid on inflammation and lipid metabolism in adipocytes [D]. Ya’an: Sichuan Agricultural University, 2019.

[8] 范福玲, 陈月琴, 赵美, 等. 基于斑马鱼模型的熊果酸治疗非酒精性脂肪肝病的作用及其机制研究[J]. 天然产物研究与开发, 2020, 32(4): 645-651.FAN F L, CHEN Y Q, ZHAO M, et al. Effect and mechanism of ursolic acid in non-alcoholic fatty liver disease based on zebrafish model [J]. Natural Product Research and Development, 2020, 32(4): 645-651.

[9] 张杰, 吴淑艳, 王琳, 等. 熊果酸对高脂饮食诱导胰岛素抵抗大鼠脂质代谢的影响[J]. 中华中医药学刊, 2010, 28(5): 975-978.ZHANG J, WU S Y, WANG L, et al. Effects of ursolic acid on fat metabolism in high-fat-fed induced insulin resistance rats [J]. Chinese Archives of Traditional Chinese Medicine, 2010, 28(5): 975-978.

[10] 中国营养学会. 中国居民膳食指南(2022)[M]. 北京: 人民卫生出版社, 2022:65.

[11] 孙晃. 灵芝马酮联合有氧运动对高脂血症大鼠脂质代谢基因的影响[J]. 分子植物育种, 2023, 21(18): 6171-6177.SUN H. Effects of ganodermanontriol combined with aero-bic exercise on lipid metabolic genes in hyperlipidemia rats [J]. Molecular Plant Breeding, 2023, 21(18): 6171-6177.

[12] 岑凤. 海藻活性成分岩藻甾醇联合运动改善肥胖大鼠脂质代谢[J]. 分子植物育种, 2023, 21(12): 4124-4130.CEN F. Algae active ingredient fucosterol combined with exercise improves lipid metabolism in obese rats [J]. Molecular Plant Breeding, 2023, 21(12): 4124-4130.

[13] REAGAN-SHAW S, NIHAL M, AHMAD N. Dose translation from animal to human studies revisited [J]. The FASEB Journal, 2008, 22(3): 659-661.

[14] 苏新, 李钰, 李芳芳, 等. 榆干离褶伞溶栓酶对高脂血症大鼠血管内皮的保护作用[J]. 食品科学技术学报, 41(1): 56-66.SU X, LI Y, LI F F, et al. Lipid lowering effect of Agaricus blazei polysaccharide extract on hyperlipidemia rats [J]. Journal of Food Science and Technology, 41(1): 56-66.

[15] XU X, DAI M, LAO F, et al. Effect of glucoraphanin from broccoli seeds on lipid levels and gut microbiota in high-fat diet-fed mice [J]. Journal of Functional Foods, 2020, 68: 103858.

[16] SALLES J, TARDIF N, LANDRIER J F, et al. TNFα gene knockout differentially affects lipid deposition in liver and skeletal muscle of high-fat-diet mice [J]. Journal of Nutritional Biochemistry, 2012, 23(12): 1685-1693.

[17] 刘敏, 张岚, 王丹, 等. 紫苏籽多糖对高脂饮食小鼠脂代谢和抗氧化作用的影响[J]. 食品研究与开发, 2022, 43(18): 70-77.LIU M, ZHANG L, WANG D, et al. Effects of perilla frutescens seeds polysaccharide on lipid metabolism and antioxidants in mice fed high-fat diet [J]. Food Research and Development, 2022, 43(18): 70-77.

[18] NOCELLA C, CAMMISOTTO V, PIGOZZI F, et al. Impairment between oxidant and antioxidant systems: short- and long-term implications for athletes’ health [J]. Nutrients, 2019, 11(6): 1353.

[19] KOZAKIEWICZ M, ROWISKI R, KORNATOWSKI M, et al. Relation of moderate physical activity to blood markers of oxidative stress and antioxidant defense in the elderly [J]. Oxidative Medicine and Cellular Longevity, 2019: 5123628.

[20] WANG F, WANG X, LIU Y, et al. Effects of exercise-induced ROS on the pathophysiological functions of skele-tal muscle [J]. Oxidative Medicine And Cellular Longevity, 2021: 3846122.

[21] DE GONZALO-CALVO D, FERNáNDEZ-GARCíA B, DE LUXáN-DELGADO B, et al. Chronic training increases blood oxidative damage but promotes health in elderly men[J]. Age, 2013, 35(2): 407-417.

[22] SHAMS G, ALLAH S A, EZZAT R, et al. Ameliorative effects of berberine and selenium against paracetamol-induced hepatic toxicity in rats [J]. Open Veterinary Journal, 2024, 14(1): 292-303.

[23] CHEN S Y, HUANG Y N, LIN J A, et al. Effect of indian gooseberry extract on improving methylglyoxal-associated leptin resistance in peripheral tissues of high-fat diet-fed rats [J]. Journal of Food and Drug Analysis, 2024, 32(1): 54-64.

[24] 安玉红, 朱德星, 胡文森, 等. 刺梨渣多酚对高脂膳食小鼠脂代谢及其诱发的氧化应激的影响[J]. 食品研究与开发, 2022, 43(10): 77-84.AN Y H, ZHU D X, HU W S, et al. Effect of polyphenol in Rosa roxburghii residue on the lipid metabolism and oxidative stress in high-fat diet mice [J]. Food Research and Development, 2022, 43(10): 77-84.

[25] 阮凌. 不同强度运动对老年脂肪肝大鼠脂代谢异常及氧化应激的影响[J]. 中国老年学杂志, 2019, 39(14): 3489-3493.RUAN L. Effects of exercise of different intensities on abnormalities of lipid metabolism and oxidative stress in aged rats with fatty liver disease [J]. Chinese Journal of Gerontology, 2019, 39(14): 3489-3493.

[26] 廖圆圆, 王燕新, 郭晓农, 等. 枇杷叶总黄酮提取及体外抗氧化的研究[J]. 西北民族大学学报: 自然科学版, 2020, 41(1): 60-64.LIAO Y Y, WANG Y X, GUO X N, et al. Study on extraction and antioxidant of total flavonoids from loquat leaves [J]. Journal of Northwest University for Nationali-ties (Natural Science), 2020, 41(1): 60-64.

[27] CHEN J, DING X, WU R, et al. Novel sesquiterpene glycoside from loquat leaf alleviates type 2 diabetes mellitus combined with nonalcoholic fatty liver disease by improving insulin resistance, oxidative stress, inflammation, and gut microbiota composition [J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2021, 69(47): 14176-14191.

[28] LÜ H, LEE R P, HUANG J, et al. A new HPLC-UV method for the quantification of terpenoids and antioxidant activity of commercial loquat leaf tea and preparation [J]. Journal of Food Measurement and Characteri-zation, 2020, 14(2): 1085-1091.

[29] WANG M Y, ZHANG S S, AN M F, et al. Neferine ameliorates nonalcoholic steatohepatitis through regulating AMPK pathway [J]. Phytomedicine, 2023, 114: 154798.

[30] LIU Y, SUN Z, DONG R, et al. Rutin ameliorated lipid metabolism dysfunction of diabetic NAFLD via AMPK/SREBP1 pathway [J]. Phytomedicine, 2024, 126: 155437.

[31] 张晓云, 梅晓宏. 板栗壳色素通过AMPK信号通路改善肥胖小鼠的脂代谢紊乱[J]. 中国食品学报, 2023, 23(7): 177-186.ZHANG X Y, MEI X H. Chestnut shells pigment ame-liorated lipid metabolism disorder in obese mice through AMPK signaling pathway [J]. Journal of Chinese Institute of Food Science and Technology, 2023, 23(7): 177-186.

[32] 高照, 杨杏萍, 徐勤, 等. 基于SIRT6/AMPK通路的人参皂苷Rc结合递增强度运动对高脂饮食诱导小鼠脂质代谢紊乱的改善作用及机制[J]. 中国运动医学杂志, 2023, 42(5): 377-388.GAO Z, YANG X P, XU Q, et al. Protective effects of ginsenoside rc combined with increasing intensity exercise on lipid metabolism disorder induced by high fat diet in mice and its regulating mechanism through SIRT6/AMPK pathway [J]. Chinese Journal of Sports Medicine, 2023, 42(5): 377-388.

[33] 李锋.枇杷叶三萜酸和黄酮组分的制备及改善代谢综合征作用研究[D]. 福州: 福州大学, 2018.LI F. Preparation of triterpene acids and flavonoids from Eriobotrya japonica leaves and the effects on improving metabolic syndrome[D]. Fuzhou: Fuzhou University, 2018.

[34] XIA Y, ZHAI X, QIU Y, et al. The Nrf2 in obesity: a friend or foe? [J]. Antioxidants, 2022, 11(10): 2067.

[35] LI F, LI Y, LI Q, et al. Eriobotrya japonica leaf triterpenoid acids ameliorate metabolic syndrome in C57BL/6J mice fed with high-fat diet [J]. Biomed Pharmaco-ther, 2020, 132: 110866.

[36] 吴瑞, 张立实, 陈锦瑶, 等. 代谢组学技术在营养学的应用[J]. 营养学报, 2021, 43(6): 609-614.WU R, ZHANG L S, CHEN J Y, et al. Application of metabolomics in nutrition [J]. Acta Nutrimenta Sinica, 2021, 43(6): 609-614.

[37] 夏惠. 枸杞多糖对健康和2型糖尿病人群的代谢组学研究[D]. 南京: 东南大学, 2019.XIA H. The metabolic effects of lycium barbarum polysaccharides on healthy and type 2 diabetic population [D]. Nanjing: Southeast University, 2019.

[38] 张艳涛, 陈黎, 朱一冰, 等. 基于气相色谱-质谱联用技术的肥胖儿童血清代谢组学研究[J]. 中国医院药学杂志, 2021, 41(24): 2530-2535.ZHANG Y T, CHEN L, ZHU Y B, et al. Serum metabolomics of obese children based upon gas chromatography-mass spectrometry[J]. Chinese Journal of Hospital Pharmacy, 2021, 41(24): 2530-2535.

[39] 刘强. 海葡萄多酚生物活性物质检测及其在小鼠体内代谢组学分析[D]. 新乡: 河南科技学院, 2023.LIU Q. Detection of bioactive substances from Caulerpa lentillifera polyphenols and their metabolomic analysis in mice[D]. Xinxiang: Henan Institute of Science and Technology, 2023.

[40] 李治. 基于血清代谢组学研究有氧运动联合二甲双胍对T2D小鼠糖/乳酸代谢的影响[D]. 十堰: 湖北医药学院, 2023.LI Z. Study the effects of aerobic exercise combined with metformin on glucose/lactate metabolism in T2D mice based on serum metabolomics [D]. Shiyan: Hubei University of Medicine, 2023.

[41] 张慧, 谭明, 程胜桃, 等. 氨基酸代谢在非酒精性脂肪性肝病中的作用机制[J]. 临床肝胆病杂志, 2024, 40(4): 810-815.ZHANG H, TAN M, CHENG S T, et al. Mechanism of amino acid metabolism in nonalcoholic fatty liver disease [J]. Journal of Clinical Hepatology 2024, 40(4): 810-815.

[42] 赵亚茹, 韩怡, 朴婧羽, 等. 基于UPLC-MS技术探究糖脂代谢病的血清代谢谱特征[J]. 中国比较医学杂志, 2023, 33(5): 24-35.ZHAO Y R, HAN Y, PIAO J Y, et al. Characteristics of the serum metabolic spectrum of glucolipid metabolic disease by UPLC-MS [J]. Chinese Journal of Comparative Medicine, 2023, 33(5): 24-35.

[43] 梁晨, 白丽, 郑素军. 鞘脂代谢在非酒精性脂肪性肝病中的作用及机制研究[J]. 胃肠病学和肝病学杂志, 2022, 31(10): 1081-1085.LIANG C, BAI L,ZHENG S J. Research on the role and possible mechanism of sphingolipids metabolism in nonalcoholic fatty liver disease [J]. Chinese Journal of Gastroenterology and Hepatology, 2022, 31(10): 1081-1085.

[44] 吴淑艳. 熊果酸对胰岛素抵抗大鼠糖、脂代谢及肝脏葡萄糖激酶的影响[D]. 上海: 第二军医大学, 2010.WU S Y. Effect of ursolic acid on glucose metabolism and expression of glucokinase in the liver of Insulin resistance rats [D]. Shanghai: Naval Medical University, 2010.

[45] 虞雨娟. 绿原酸对非酒精性脂肪肝的保护作用及机制研究[D]. 南昌: 南昌大学, 2023.YU Y J. Protective effect and mechanism of chlorogenic acid on non-alcoholic fatty liver [D]. Nanchang: Nanchang University, 2023.

[46] 阮凌. 运动和魔芋多糖对2型糖尿病大鼠糖、脂代谢及抗氧化功能的影响[J]. 安康学院学报, 2018, 30(1): 102-106.RUAN L. Effects on exercise and konjac polysaccharide on sugar, lipid metabolism and antioxidant function in type 2 diabetic rats [J]. Journal of Ankang University, 2018, 30(1): 102-106.

[47] LI P, TONG T, SHAO X, et al. The synergism of lactobacillaceae, inulin, polyglucose, and aerobic exercise ameliorates hyperglycemia by modulating the gut microbiota community and the metabolic profiles in db/db mice [J]. Food Function, 2024, 15(9): 4832-4851.

Effect and Mechanism of Loquat Leaf Extract Combined with Exercise on Lipid Metabolism in High-Fat Diet Induced Mice

REN Yijing1, HUANG Jian2, ZHAO Lei1, ZHAO Liang1, WANG Ou2,*, DING Gangqiang2,*

(1.School of Food and Health, Beijing Technology and Business University, Beijing 100048, China;2.National Institute for Nutrition and Health, Chinese Center for Disease Control and Prevention/ NHC Key Laboratory of Public Nutrition and Health, Beijing 100050, China)

Abstract： In order to study the effect of loquat leaf extract (LLE) combined with exercise (Ex) on lipid metabolism, mice were divided into normal diet group, high-fat diet group, Ex intervention group, LLE intervention group and LLE-Ex intervention group. After 13 weeks, the body weight changes, organ indices, serum and organ lipid levels, oxidative stress status, protein expression of lipid metabolism and oxidative stress signaling pathways, and serum metabolomic differences of mice were analyzed. The results showed that LLE-Ex could significantly inhibit the body weight gain, lower the adipose tissue proportion in the body, which decreased the index of liver by 8.1%, that of epididymal fat by 22.9%, and that of abdominal fat by 54.0%. It significantly regulated the serum TG, HDL-C and LDL-C levels, and decreased the levels of serum TG and LDL-C by 47.1% and 28.5% respectively, and increased HDL-C levels by 26.2%. It also significantly prevented the deposition of hepatic free fatty acid (FFA) and muscular TG, TC, FFA, and decreased the levels of hepatic FFA and muscular TG, TC and FFA by 41.0%, 13.4%, 36.4%, and 34.9%, respectively. It also improved the level of oxidative stress status in skeletal muscle by decreasing MDA levels at skeletal muscle by 19.5% and increasing CAT activity by 11.5%. The observed effects of LLE-Ex were more comprehensive and marked than LLE or Ex alone, and probably achieved by modulating the AMPK and Nrf2-HO1 signaling pathways and affecting D-glutamine and D-glutamate metabolism, alanine, aspartate and glutamate metabolism and sphingolipid metabolism.

Keywords： loquat leaf extract; exercise; high-fat diet; lipid level; lipid metabolism

doi：10.12301/spxb202400292

文章编号：2095-6002(2025)04-0035-15

引用格式：任以静, 黄建, 赵磊, 等. 枇杷叶提取物联合运动对高脂饮食小鼠脂质代谢的影响与机制分析[J]. 食品科学技术学报,2025,43(4):35-49.

REN Yijing, HUANG Jian, ZHAO Lei, et al. Effect and mechanism of loquat leaf extract combined with exercise on lipid metabolism in high-fat diet induced mice[J]. Journal of Food Science and Technology, 2025,43(4):35-49.

收稿日期： 2024-04-30

基金项目： 北京工商大学食品科学与工程“双一流”学科建设培育项目开放课题(BTBUKF202201)。

Foundation: Open Project for Cultivation Project of Double First-Class Disciplines of Food Science and Engineering of Beijing Technology and Business University(BTBUKF202201).

第一作者： 任以静,女,硕士研究生,研究方向为天然产物与营养干预。

*通信作者：

王 鸥,女,副研究员,博士,主要从事天然产物与人群营养干预方面的研究;

丁钢强,男,主任医师,博士,主要从事营养与健康方面的研究。

中图分类号： TS201.4

文献标志码： A

(责任编辑：叶红波)