纽荷尔脐橙(Newhall naval orange)原产于美国,是由美国华盛顿脐橙(Washington navel orange)芽变选育而得到的品种,为柑橘属甜橙种[1]。我国脐橙种植面积居世界之首,纽荷尔脐橙适应性强,自1978年引入中国以来,在湖北、湖南、广西、重庆、江西和四川等地广泛种植,是目前中国栽培面积最大的脐橙品种[2]。纽荷尔脐橙因果色鲜艳、营养丰富、芳香宜人而成为颇受欢迎的脐橙品种之一。

香气是消费者衡量柑橘及其制品品质的关键指标,而香气化合物是果实成熟过程中形成的次级代谢产物。研究表明,柑橘类水果中萜类化合物是主要的挥发性物质,特别是单萜类化合物是最主要的香气成分[3]。就纽荷尔脐橙果肉的挥发性香气成分而言,Wang等[4]检测了纽荷尔脐橙好氧腐烂过程中有12种单萜烯,但是其他类挥发性风味物质并未见报道。Bi等[5]研究了新鲜纽荷尔脐橙汁、高静压处理的纽荷尔橙汁和巴氏杀菌的纽荷尔脐橙汁的挥发性物质,共发现了44种挥发性化合物,其中33种为萜类化合物。刘韬等[6]研究了纽荷尔脐橙果汁、果酒的香气成分及其苦味物质,在果汁中发现挥发性化合物31种,其中萜类化合物22种,主要物质为D-柠檬烯和巴伦西亚橘烯。Hu等[7]在纽荷尔脐橙冷榨油中检测出了31种挥发性化合物,其中萜类化合物占23种。吴婷等[8]采用预浓缩和气相色谱-质谱联用(gas chromatography-mass spectrometry, GC-MS)技术在纽荷尔脐橙释放的气体中共检测到42种挥发性成分,主要成分为柠檬烯。Zhang等[9]在纽荷尔脐橙果汁中检出了10种挥发性化合物,其中含量比较高的有D-柠檬烯、巴伦西亚橘烯等。总的来说,萜类化合物是纽荷尔脐橙果肉中的主要挥发性物质,单萜类是最重要的芳香物质[3,9]。

柑橘类水果在生长成熟过程中香气会变得越来越浓郁[10]。孙莹等[10]以赣南纽荷尔脐橙为原料,发现随着纽荷尔脐橙果实的成熟,香气物质总含量逐渐增加,但是该研究的材料间隔时间比较短,只有一周。研究水果在不同成熟度风味变化有重要意义。因此,本研究考察成熟前期、成熟期、成熟后期等3个不同成熟期(间隔一个月)纽荷尔脐橙果肉中的挥发性风味物质的种类和含量的变化规律,同时对纽荷尔脐橙果肉中风味活性物质进行香气活度值(odor activity value, OAV)计算与分析,通过香气轮廓雷达图进一步挖掘成熟期与风味的关系。希望研究可为进一步了解纽荷尔脐橙风味在不同成熟度的变化趋势,为纽荷尔脐橙较佳采果期以及品种品质的鉴定提供基础实验数据。

1 材料与方法

1.1 材料和试剂

纽荷尔脐橙采摘于湖北省巴东县东瀼口镇雷家坪社区(海拔358 m,位置E 110°22′,N 31°3′),树龄为6年。前后共进行3次不同成熟度的采摘,以商品果采摘期为成熟期、成熟前期和成熟后期分别为前后5周时间,其具体采摘时间为:2022-10-24(成熟前期)、2022-11-28(成熟期)、2023-1-2(成熟后期)。3次采摘均在相同3棵纽荷尔脐橙果树上平均采摘没有物理损伤和病虫害的水果。采摘当天运回实验室并迅速剥皮后将果肉储存于-80 ℃超低温冰箱直至实验分析。

氯化钠、乙醇、蔗糖、葡萄糖、果糖、柠檬酸、抗坏血酸、L-丝氨酸、L-天冬氨酸、L-丙氨酸、L-精氨酸、L-谷氨酸、L-脯氨酸,国药集团化学试剂有限公司;C8～C20正构烷烃、用于定性和定量的标准品包括环己酮(98.0%)、D-柠檬烯(99.0%)、芳樟醇(97.0%)、4-萜烯醇(95.0%)、α-松油醇(96.0%)、香芹醇(97.0%)、香茅醇(95.0%)、柠檬醛(96.0%)、胡椒酮(94.0%)、香叶醇(98.0%)、巴伦西亚橘烯(70.0%)、圆柚酮(98.0%)、正己醇(98.0%)、己酸(98.0%)、正辛醛(99.0%)、正辛醇(98.0%)、大马士酮(98.0%)、正壬酸(97.0%)、香芹酚(98.0%)、L-紫苏醛(92.0%),美国Sigma-Aldrich公司;实验中均使用超纯水。

1.2 仪器与设备

6890N/5975MSD型气质联用仪,美国安捷伦公司;50/30 μm DVB/CAR/PDMS型固相微萃取头,美国Supelco公司;CONCEPT多功能样品前处理系统,德国PAS公司;20 mL带隔垫顶空螺纹口样品瓶,美国安捷伦公司;MDF-U50V型-80 ℃超低温冰箱,日本SANYO公司;HR1922型飞利浦榨汁机,中国飞利浦投资有限公司;DS-2型组织捣碎机,中国方科仪器有限公司;BS-124S型电子天平,德国赛多利斯公司;PHSJ-4A型pH计,中国雷磁仪器有限公司;WYT-4型手持式数字折射仪,中国扬特科技仪器有限公司;CR21G型冷冻离心机,日本HITACHI公司;303-1B型电热恒温培养箱,中国尚城仪器制造有限责任公司;KZ-HQ型超纯水器,中国科治环保设备有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 纽荷尔脐橙果肉果汁样品的制备

从-80 ℃超低温冰箱中取出200.0 g不同成熟度纽荷尔脐橙果肉,破碎,用镊子挑出种子。趁冷榨汁,离心后准确量取上清液5.0 mL与内标25.0 μL环己酮[11](1.354 3 g/L的乙醇溶液)和2.0 g氯化钠,一同放进有磁力搅拌子的20 mL顶空样品瓶中,用PTFE硅胶隔膜密封待测。

1.3.2 纽荷尔脐橙品质指标的测定

制备纽荷尔脐橙果肉果汁,榨汁离心后测量上清液体积,计算出汁率,单位为mL/100 g(以果肉质量计);上清液在室温下用手持式数字折射仪测定总可溶性固形物,单位为%;上清液在室温下测定pH值。

1.3.3 挥发性风味物质的萃取

用顶空固相微萃取(headspace solid-phase microextraction, HS-SPME)技术萃取纽荷尔脐橙果肉果汁中的香气物质,将准备好的样品采用前期实验优化的萃取条件[12]。使用多功能顶空自动进样器对样品进行前处理,该自动进样器与气相色谱-质谱联用仪相连。装样的萃取瓶在50 ℃下搅拌平衡30 min,插入50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取头,在50 ℃下萃取40 min[12]。将SPME纤维置于GC的进样口中,在不分流模式250 ℃下解吸附5 min,进行GC-MS分析。

对3种不同成熟度的纽荷尔脐橙果肉果汁分别进行1次独立提取全扫描定性检测,再分别进行3次独立提取,选择离子扫描定量检测,以确保分析的准确性。

1.3.4 挥发性风味物质的GC-MS分析

DB-5MS型毛细管色谱柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)进行分离,使用流速为0.9 mL/min的氦气作为载气。进样口温度250 ℃、离子源温度230 ℃、接口温度(界面温度)280 ℃、四极杆温度150 ℃。

程序升温:从40 ℃(保持4 min)以5 ℃/min速度升温至260 ℃,然后以15 ℃/min速度升温至280 ℃, 保持1 min。在70 eV的电子轰击模式(EI)下,以1 scan/s的扫描速度,扫描质量范围20～400 u。

1.3.5 挥发性风味物质的定性和定量分析

1)定性分析。用3种方法对香气成分进行定性分析,首先根据NIST数据库(http:∥webbook.nist.gov/chemistry)对谱图进行初步检索及质谱分析,其次根据测定的保留指数(retention index, RI)进行验证,最后利用可获得的标准物质进行确认。

2)定量分析。采用内标法和外标法相结合的方法对挥发性物质进行定量分析。用环己酮(1.354 3 g/L的乙醇溶液)作为内标,计算样品中待测化合物与内标的峰面积比率。

参考文献[13-14]配制模拟柑橘果汁,其具体组成为蔗糖(50.00 g)、葡萄糖(25.00 g)、果糖(25.00 g)、柠檬酸(10.00 g)、抗坏血酸(0.30 g)、L-丝氨酸(0.74 g)、L-天冬氨酸(0.72 g)、L-丙氨酸(0.17 g)、L-精氨酸(0.13 g)、L-谷氨酸(0.08 g)、L-脯氨酸(0.05 g),配制1 000 mL模拟纽荷尔脐橙果汁溶液。将此溶液用1.0 mol/L NaOH调节至pH值为7.0后作为纽荷尔脐橙果汁定量标准曲线的溶剂,用标准物质配制16个浓度梯度,并加入测定纽荷尔脐橙果汁时相同浓度的环己酮(25 μL,1.354 3 g/L的乙醇溶液)作为内标,每个浓度梯度采用与纽荷尔脐橙果汁相同的程序检测,然后用相应的选择离子扫描所得的峰面积,并计算标准物质与内标的峰面积比率,建立每种香气物质的浓度与峰面积比率的标准曲线,且使回归系数大于0.98。没有标准物质的香气化合物用具有相同碳原子数和官能团的化合物来定量。

1.3.6 风味活性物质的分析

对纽荷尔脐橙的风味活性物质进行OAV分析。

OAV是香气化合物的浓度与阈值的比值,可以评估单个挥发性化合物对整体香气的贡献[15]。当OAV≥1时,则表明该物质是关键香气化合物,对纽荷尔脐橙样品的整体香气有重要贡献。根据不同成熟度纽荷尔脐橙中检测到的挥发性物质含量,以及各化合物在水中的气味阈值计算OAV。

通过查找文献得到挥发性风味物质的风味描述,将其归纳为青草香、柑橘香、果香、木香、甜香、花香和不愉悦7类,再根据挥发性风味物质OAV的自然对数绘制香气轮廓雷达图。

1.4 数据处理

每种样品平行提取检测3次,数据以平均值±标准差形式表示。使用SPSS Statistics 17.0对显著性进行分析,通过Origin 8.5绘制折线图和雷达图,热图分析采用Tbtools软件。

2 结果与分析

2.1 不同成熟度纽荷尔脐橙品质指标的差异

纽荷尔脐橙果实品质是一种由多种因素构成的复合体,包括外观品质、风味品质、营养品质、加工品质和贮藏品质等。在诸多品质因子中,外观以色泽最为重要,而内在品质以糖最为重要,不同成熟度纽荷尔脐橙果实及其横切面见图1。

由图1可知,随着纽荷尔脐橙的成熟,果皮及果肉均会变黄,成熟前期-成熟期变化较成熟期-成熟后期更明显。这主要是因为纽荷尔脐橙临近成熟时,叶绿素的合成被抑制,且不断被分解,而与此同时类胡萝卜素的合成在不断增加,使果实显现出黄、橙黄、橙红色[16]。

纽荷尔脐橙果肉出汁率、总可溶性固形物及pH值的具体结果见表1。

研究表明,纽荷尔脐橙果肉中的可溶性固形物主要为糖类(果糖、蔗糖和葡萄糖)[13-14],与其他脐橙品种相比[17],纽荷尔脐橙中可溶性固形物含量较高。成熟度对果实品质有非常重要的影响,可溶性固形物含量、出汁率和pH值随着果实成熟度的增加总体呈上升趋势。

2.2 不同成熟度纽荷尔脐橙挥发性物质变化规律

香气成分是影响纽荷尔脐橙果肉品质非常重要的因素,通过HS-SPME结合GC-MS联用仪检测分析不同成熟度纽荷尔脐橙果肉中挥发性成分。表2为定量离子、定量的标准品和校准曲线方程。当方程线性相关系数R2均大于0.98,有助于纽荷尔脐橙果肉中香气物质的定量。成熟前期、成熟期和成熟后期纽荷尔脐橙果肉中检测到的风味化合物见表3。

由表3可知,在纽荷尔脐橙果肉中共检测到19种挥发性化合物,其中有16种挥发性萜类化合物,主要为12种单萜类,3种倍半萜类和1种类萜(大马士酮)。纽荷尔脐橙果肉中挥发性化合物种类在不同时期无差异,含量变化较大。正己醇、正辛醇、香叶醛、大马士酮的含量在成熟前期-成熟期呈上升趋势,但在成熟期-成熟后期开始下降,在成熟期含量达到最大值;其余挥发性化合物在3个不同成熟度呈上升趋势,在成熟后期含量达到峰值。这也致使每个时期的纽荷尔脐橙存在独特的香气。3个不同成熟度纽荷尔脐橙果肉中萜类化合物的含量均占总挥发性物质含量的95%以上,所以萜类化合物是纽荷尔脐橙果肉中的重要成分,应特别关注。通过Tbtools软件制作不同成熟度的纽荷尔脐橙果肉中各挥发性物质的含量变化热图(颜色越接近黄色表明该化合物在此时期含量越高),见图2。

由表3可知,萜类化合物是纽荷尔脐橙果肉中主要的香气物质,随着纽荷尔脐橙的成熟,各类挥发性物质含量均有上升,但在成熟前期到成熟期各类挥发性物质含量变化较小,成熟后期,总挥发性物质含量和萜类化合物含量较前两个生长期有较大增长,达到最大值。

萜类物质是柑橘汁挥发性化合物的主要类别[18],其在柑橘中通过2-甲基-D-赤藓糖醇-4-磷酸 (2-methy-derythrito-4-phosphate, MEP)途径和甲羟戊酸(mevalonic acid, MVA)途径发生一系列反应,合成牻牛儿基焦磷酸(geranyl pyrophosphate, GPP)、法尼基焦磷酸(farnesyl pyrophosphate, FPP)2个前体物质。随后2种前体物质进一步形成不同萜类化合物的核心结构,这些核心结构在不同生物体中,经过一系列的后修饰,产生具有广泛化学多样性的最终萜类化合物[19-21]。另外,由于萜类化合物化学性质不稳定,在成熟过程中容易氧化分解,进一步转化为醇类、醛类及酮酸类等含氧萜类化合物,对果汁品质有重要贡献。

由表3可知,纽荷尔脐橙中检出D-柠檬烯、佛术烯、巴伦西亚橘烯3种萜类物质,佛术烯含量在成熟前期下降,成熟后期上升,D-柠檬烯和巴伦西亚橘烯含量在成熟前期-成熟期-成熟后期均呈上升趋势。D-柠檬烯是纽荷尔脐橙果肉中含量最高的化合物,与刘韬等[6]、吴婷等[8]、Xie等[22]研究报道的结果相似。随着纽荷尔脐橙的成熟,D-柠檬烯含量增加,这表明果实中D-柠檬烯含量明显受到成熟度的影响,其中含量最高的为成熟后期,达5 464.94 μg/L。佛术烯、巴伦西亚橘烯互为对映异构体,由图2可知,佛术烯在成熟前期含量最高,巴伦西亚橘烯含量在成熟期和成熟后期更高,随着纽荷尔脐橙成熟度的增加,佛术烯可以转化为巴伦西亚橘烯。

醇类物质是常见的水果挥发性化合物[18],其来源可能是纽荷尔脐橙中的萜类化合物在酸性条件和酶作用下发生一系列氧化水合脱水反应,生成醇类化合物[23]。正己醇、正辛醇、芳樟醇、4-萜烯醇、α-松油醇、(E)-香芹醇、橙花醇、香茅醇、香叶醇9种醇类物质在纽荷尔脐橙果肉中被检出,其相关变化趋势见图3。其中正辛醇为非萜醇类化合物,Feng等[24]研究发现正辛醇是甜橙中的重要香气化合物。Bi等[5]报道称D-柠檬烯可以在纽荷尔脐橙酶或酸催化下转化为4-萜烯醇和α-松油醇,其转化过程可能是D-柠檬烯在酸或酶催化下首先形成α-松油醇阳离子,再水化脱质子就形成了α-松油醇,而α-松油醇阳离子经重排,再水化脱质子就形成了4-萜烯醇。GPP在单萜合酶的作用下可形成香叶醇、α-松油醇、芳樟醇[25],由表3可知,纽荷尔脐橙中醇类化合物含量最高的为芳樟醇,α-松油醇次之,因此它们应该也可以由GPP直接形成。芳樟醇可以转化为α-松油醇[5],芳樟基阳离子1,6-环合形成α-松油基阳离子[26],α-松油基阳离子俘获水直接形成α-松油醇。与此转化原理相似,芳樟基阳离子后续可形成(E)-香芹醇、橙花醇和香茅醇。α-松油醇还可以在酶催化下转化为香芹醇[27],其可能是α-松油基阳离子脱质子形成柠檬烯,再经酶催化氧化羟基化形成香芹醇。

纽荷尔脐橙果肉中醛类主要为正辛醛、橙花醛、香叶醛和L-紫苏醛。由图2可知,发现香叶醛在成熟期含量最高,其余3种醛类均在成熟后期含量最高。酮类物质是氧化反应的最终产物,在不同成熟度的纽荷尔脐橙中检测到香芹酮、大马士酮和圆柚酮3种酮类化合物。研究发现,通过相关酶作用,可以将巴伦西亚橘烯转化为圆柚酮[28]。

2.3 不同成熟度纽荷尔脐橙果肉中风味活性物质变化规律

挥发性物质是否对纽荷尔脐橙果肉的风味有贡献,这不仅与挥发性物质含量有关,还与其阈值有关。纽荷尔脐橙果肉中共有19种挥发性化合物,为确定纽荷尔脐橙果肉的关键香气成分,根据挥发性物质的含量及感觉阈值,计算出OAV。其对应的香气类型描述和OAV见表4。其中OAV≥1的化合物,OAV由大到小依次为D-柠檬烯、正己醇、大马士酮、正辛醛、芳樟醇、香芹酮、橙花醛、香叶醛、香茅醇、L-紫苏醛10种化合物,它们对纽荷尔脐橙果肉的香气具有重要贡献。正辛醇、4-萜烯醇、α-松油醇、(E)-香芹醇、橙花醇、香叶醇、佛术烯、巴伦西亚橘烯和圆柚酮的OAV<1,说明这些挥发性化合物对纽荷尔脐橙果肉的香气有修饰作用。相关研究[29-31]发现,D-柠檬烯、4-萜烯醇、巴伦西亚橘烯和芳樟醇是甜橙的特征香气物质,本研究中巴伦西亚橘烯OAV<1,可能是不同的甜橙品种存在差异,也可能在纽荷尔脐橙果肉中,巴伦西亚橘烯转化为了其异构体佛术烯。

挥发性物质中含量占比最高的D-柠檬烯、芳樟醇和气味阈值较低的大马士酮,是纽荷尔脐橙果肉中果香味的主要贡献者。在纽荷尔脐橙果汁中,D-柠檬烯具有柑橘类果实香气、芳樟醇具有花的香气、L-紫苏醛具有草的香气[32]、香叶醛具有花香和柑橘味香气;正辛醛、香茅醇和香芹酮等化合物感觉阈值,赋予纽荷尔脐橙青草香,其结果与Feng等[24]研究结论相似;大马士酮阈值低,具有花香和水果甜香的香气特征[33]。这些萜类化合物对于赋予纽荷尔脐橙果肉香气具有重要意义,特别是D-柠檬烯赋予纽荷尔脐橙果肉特征柑橘类果实香气。根据相关化合物香气描述,并将其分为青草香、柑橘香、果香、木香、甜香、花香和不愉悦7类。同时根据香气化合物OAV大小的自然对数值构建香气轮廓雷达图,见图4。

由图4可知,纽荷尔脐橙果肉以柑橘香和果香为主,伴随着较浓郁的青草香、花香、甜香和极低的木香和不愉悦气味,在成熟后期柑橘香和果香最为显著。嗅闻纽荷尔脐橙果肉感知最强烈的也是柑橘香和果香,伴随青草香、花香等香味,新鲜果实不愉悦气味较弱,本研究实验检测分析结果与评香人员实际感知相符。柑橘香和果香主要来源于D-柠檬烯,随着D-柠檬烯在成熟后期含量增加,这两种香型相较于其他时期更加明显。这可能是由于纽荷尔脐橙属于后熟食用水果,在一定周期内,随着时间延长,其成熟度增加,风味也越发浓郁。

3 结 论

研究采用HS-SPME与GC-MS联用技术,对纽荷尔脐橙果肉中的挥发性物质进行了提取、定性和定量分析。结果表明,纽荷尔脐橙果肉中各香气化合物的含量均受到成熟度的显著影响。随着成熟度的增加,果肉中香气化合物的含量在成熟期和成熟后期显著高于成熟前期,尤其是主导香气成分萜类化合物和D-柠檬烯的含量随成熟度增加而显著上升。这些化合物的协同作用赋予纽荷尔脐橙强烈的水果香和柑橘香特征,其中芳樟醇对花香贡献最大,而大马士酮则为其增添了甜香味。此外,研究还初步探讨了纽荷尔脐橙果肉中香气化合物的形成与转化机理,后续可通过相关实证反应和量化模拟进一步揭示其具体机制。研究结果旨在为纽荷尔脐橙的最适采摘成熟度、香气物质形成与转化机制的深入研究提供重要的数据支持和理论参考。

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Study on Mechanism of Aroma Components Variation in Pulp of Newhall Navel Oranges at Different Maturities

XIE Yating, YAN Wenyi, YANG Yan*, LI Jieyu, YANG Xiaohong, YU Ainong*

(School of Chemistry &Environmental Engineering, Hubei Minzu University, Enshi 445000, China)

Abstract： Newhall navel oranges exhibiting various degrees of maturities were selected as the research object. A sophisticated technique, involving headspace solid-phase microextraction coupled with gas chromatography-mass spectrometry, was employed to meticulously analyze the key flavor-active substances in the pulp and to track the evolving trends of these compounds at different maturities. This research revealed that the a total of 19 aroma compounds were detected in the pulp of Newhall navel oranges at 3 different maturities, including pre-mature, mature, and post-mature. The types of aroma compounds in the pulp of Newhall navel oranges showed no significant differences across various maturities. However, their concentrations exhibited notable fluctuations with changes in maturity. The terpenoids were the main aroma compounds in the pulp of Newhall navel oranges. Specifically, the concentrations of hexan-1-ol, octan-1-ol, geranial, and damascenone displayed an ascending trend from the pre-mature to the mature stage, followed by a decline from the mature to the post-mature stage, peaking during the mature stage. The contents of remaining compounds exhibited a gradual increase across three distinct maturity levels, with their concentrations peaking in the post-mature stage. The odor activity value (OAV) method was used to analyze the flavor-active substances in Newhall navel oranges. It was found that among the compounds with OAV>1, the OAV values ranked in descending order as follows, D-limonene, hexan-1-ol, damascenone, octanal-1-ol, linalool, carvone, neral, geranial, citronellol, and L-perilla aldehyde. Through aroma profile radar chart analysis, it was determined that the pulp of Newhall navel oranges was primarily characterized by citrus and fruity aromas, accompanied by prominent grassy, floral, and sweet aromas, along with minimal woody and unpleasant odors. The citrus and fruity aromas were most pronounced at the post-mature stage. This research was expected to provide an experimental foundation for further studies and development of Newhall navel orange pulp.

Keywords： Newhall navel orange; citrus; maturity; flavor-active substances; terpene

文章编号：2095-6002(2025)03-0125-10

doi：10.12301/spxb202400329

引用格式：谢雅婷,严文怡,杨艳,等.不同成熟度纽荷尔脐橙果肉中香气成分变化规律研究[J]. 食品科学技术学报,2025,43(3):125-134. XIE Yating, YAN Wenyi, YANG Yan, et al. Study on mechanism of aroma components variation in pulp of Newhall navel oranges at different maturities[J]. Journal of Food Science and Technology, 2025,43(3):125-134.

中图分类号： TS255.1

文献标志码： A

收稿日期： 2024-05-16

基金项目： 国家自然科学基金面上项目(32272456);2023年湖北省大学生创新创业训练计划项目(S202310517019)。

Foundation: National Natural Science Foundation of China (32272456); Project of Hubei Provincial College Student Innovation and Entrepreneurship Training Program in 2023 (S202310517019).

第一作者： 谢雅婷,女,硕士研究生,研究方向为食品风味化学。

*通信作者： 杨 艳,女,副教授,博士,主要从事食品风味化学方面的研究;余爱农,男,教授,博士,主要从事食品化学和天然产物化学方面的研究。

(责任编辑：李 宁)