鲜味,作为与酸、甜、苦、咸并列的基本风味之一,对调节食欲、提升饮食体验具有显著作用。自1908年池田菊奈博士从海带中分离得到谷氨酸及其钠盐之后[1],鲜味及其增强剂研究逐步得到广泛关注。一系列结构多样的鲜味剂和鲜味增强剂在市场上出现,包括5’-呈味核苷酸(常见的“I+G”)[2]、鲜味肽、鲜味增强肽等。这些鲜味产品不仅提升了调味品的鲜美滋味,亦赋予加工食品更为天然健康的特质。鲜味肽由于具有小分子结构(150～3 000 Da)能与人味蕾上的鲜味受体(T1R1、T1R3等)精准互作[3-4],赋予了食物浓郁、浑厚的鲜味感。目前已从食用菌[5]、河鲀[6]、火腿[7]、蛋白水解物[8]等多种食品原料中分离鉴定到鲜味肽,这些鲜味肽在风味呈现方面发挥着重要作用。

鲜味肽的挖掘及其鲜味强度的确定一直备受关注,传统的基于感官评定的方法存在主观性强、易受个体差异影响及感官疲劳等局限,难以实现高效、客观的评估。鲜味的感知起始于味觉受体蛋白的精确识别过程,其中鲜味肽作为关键的配体分子,与受体蛋白的相互作用能够迅速反映其独特的鲜味特性,同时对鲜味肽(即配体)与受体蛋白的解离情况深入探讨,可以从侧面有效反映鲜味感受的持久性和强度特征。目前对于配体与受体蛋白相互作用的分析方法包括荧光光谱[9]、等温滴定量热法、表面等离子体共振(surface plasmon resonance,SPR)分子互作[10]等。Zhang等[9]利用荧光光谱建立了一种基于hT1R1受体的新的鲜味肽检测系统,可以实现低阈值和亲和力强的鲜味多肽的快速高效评价。Li等[11]利用等温滴定量热法发现了大球盖菇十肽(KSWDDFFTR)与咸味受体(TRPV1)具有较强的结合能力,在钠盐替代方面具有较大的应用潜力。相较于其他方法,SPR分子互作方法在动力学分析和高通量筛选方面具有明显优势,在临床标志物的筛选和发现、药物靶标相互作用的综合表征、药物代谢和药效动力学等领域[12]已广泛应用,但将该方法用于风味物质的快速筛选鲜有报道。本研究以前期工作中分离鉴定到的5种大球盖菇鲜味肽(EPLCNQ、SGCVNEL、PHEMQ、SEPSHF和ESCAPQL)[13]为研究对象,融合电子舌、SPR分子互作、分子对接技术,对鲜味肽的呈味特征进行评价,并解析其呈鲜的分子机制,即通过电子舌技术减少人为误差,结合分子互作与分子对接技术深入解析鲜味肽与受体间的相互作用机制。希望通过本研究的方法能够提升鲜味肽评价的精准度与效率,为鲜味肽的深入研究与应用开辟路径,也为食品工业中高品质调味品的开发提供有力的技术支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

5种大球盖菇鲜味肽的氨基酸序列分别为Glu-Pro-Leu-Cys-Asn-Gln(EP-6)、Ser-Gly-Cys-Val-Asn-Glu-Leu(SG-7)、Pro-His-Glu-Met-Gln(PH-5)、Ser-Glu-Pro-Ser-His-Phe(SE-6)和Glu-Ser-Cys-Ala-Pro-Gln-Leu(ES-7),通过吉尔生化(上海)有限公司采用固相合成和脱盐处理,其纯度均不低于98%。人源重组鲜味受体蛋白(human taste receptor type 1 member 3,hT1R3-VFD),购自美国Cloud-Clone公司;食品级味精(monosodium glutamate,MSG),购于莲花健康产业集团股份有限公司;CM5芯片和HBS-EP+10X缓冲溶液、1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺、N-羟基琥酰亚胺、乙醇胺等分析纯试剂,购于美国通用电气医疗集团公司;10 mmol/L醋酸钠溶液(pH 值为4.0、4.5、5.0和5.5)、磷酸盐缓冲液(PBS)(0.01 mol/L,pH 值为7.2～7.4)、 50 mmol/L NaOH溶液等分析纯试剂,购于上海朝瑞生物科技有限公司。

1.2 仪器与设备

BIAcore X100型SPR分子互作仪,美国通用电气(GE)医疗集团;SA-402B型电子舌味觉分析系统,日本INSENT公司;KQ-600B型超声清洗器,昆山市超声仪器有限公司;W-80型漩涡混合器,上海精科实业有限公司;ME204型电子分析天平,梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司;ELGA PURELAB Ultra型超纯水仪,威立雅水处理技术(上海)有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 感官评定分析

参考Tang 等[14]的方法,略有改动。感官评估小组由10名实验室成员组成,其中4名男性和6名女性,年龄为22～37岁。经过感官训练,团队成员能够准确识别5种基本的滋味特征,包括酸味、甜味、苦味、咸味和鲜味。标准味觉溶液:质量浓度为0.80 g/L的柠檬酸溶液、10 g/L的蔗糖溶液、2.50 g/L的异亮氨酸溶液、3.5 g/L的氯化钠溶液和3.5 g/L的MSG溶液。在温度为(25±2)℃、湿度为65%的条件下进行感官实验。样本用三位数随机码编号。为了避免味觉疲劳和遗留影响,小组成员用超纯水漱口至少2次,休息2 min。

用去离子水配制质量浓度为0.5 mg/mL的合成多肽溶液,用于感官评定小组成员的感官属性评估。滋味稀释分析(taste dilution analysis,TDA):用去离子水配制质量浓度为1.0 mg/mL的合成多肽溶液,随后用去离子水按照1∶1的体积比进行逐级稀释,小组成员能够准确评估出鲜味的最大稀释浓度被用作多肽的鲜味识别阈值。

1.3.2 电子舌分析

参考陈荣荣等[15]的方法略有改动。利用SA-402B电子舌味觉分析系统对5个多肽样品(质量浓度均为1.0 g/L )和3个MSG溶液(质量浓度分别为0.10、0.50、1.00 g/L)的鲜味(umami)、鲜味回味(richness)、咸味(salt)、酸味(sour)、涩味(astringency)、涩味回味(aftertaste-A)、苦味(bitter)和苦味回味(aftertaste-B)等8种味觉进行分析。参比溶液为氯化钾和酒石酸混合液,8个样本中的每一个都由5个传感器进行了4次重复测量,所得数据用于主成分分析(principal component analysis,PCA)。

1.3.3 合成肽与鲜味受体蛋白相互作用分析

利用SPR分子互作方法,对5种合成肽和鲜味受体蛋白进行相互作用分析,互作过程在表面等离子共振分子互作仪中进行。

1.3.3.1 鲜味受体蛋白工作液制备

使用去离子水对鲜味受体蛋白(hT1R3-VFD)进行溶解,得到质量浓度为1 mg/mL的hT1R3-VFD蛋白母液。分别用pH值为4.0、4.5、5.0、5.5的10 mmol/L醋酸钠偶联缓冲溶液,将hT1R3-VFD蛋白母液稀释至50 μg/mL,作为工作液备用。

1.3.3.2 鲜味受体蛋白芯片预富集和偶联

将T1R3蛋白通过氨基偶联到CM5芯片,利用不同pH值的工作液确定最适蛋白绑定条件。操作流程:按软件工作流程图中“界面芯片表面准备”(sensor surface preparation)模块,选择“蛋白固定pH优化”(find immobilization pH)。按照程序要求步骤,设置反应时间180 s,流速5 μL/min,勾选洗液冲洗流路系统。采用手动偶联的方法,依次进行芯片表面活化,以及hT1R3-VFD蛋白偶联和芯片表面多余羧基的封闭。

1.3.3.3 目标分析物与hT1R3-VFD蛋白相互作用

称取样品加去离子水配制5 mmol/L母液(即目标分析物原液),用1X HBS-EP缓冲溶液对母液进行稀释。稀释50倍,得到浓度为100 μmol/L的分析物。以该浓度为最高浓度,并逐级稀释,分别进样分析。

1.3.4 分子对接模拟

通过SWISS-MODEL(https:∥swissmodel.expasy.org)在线建模软件对hT1R1/T1R3的味觉活性区域(VFD)进行同源建模[16]。通过BLAST序列比对,hT1R1/T1R3与T1R2a-T1R3(PDB id:5X2P)蛋白序列一致性约为37.74%,因此以5X2P蛋白为模板构建hT1R1/T1R3的3D晶体结构,并验证构建的蛋白用于随后的分子对接实验。

基于Discovery Studio 2019(简称DS)软件中CDOCKER模块实现合成肽与鲜味受体的半柔性分子对接。使用ChemDraw18.0绘制多肽的3D结构,并进行能量最小化处理(能量优化力场:MMFF94)。将合成肽和构建好的鲜味受体蛋白结构导入DS软件,进行去水加氢、引入CHARMM力场操作,以优化结构。在Receptor-Ligand interactions模块中的From Receptor Cavities中分别确定二聚体T1R1/T1R3受体蛋白的活性空腔。根据对接能量评估分子对接效果,保留最佳对接构象,结合软件分析展示合成肽与受体蛋白的成键情况。

1.4 数据处理

采用SPSS统计软件对实验数据进行处理,数据用平均值±标准偏差(standard deviation,SD)表示,实验重复3次;采用单因素方差分析(one-way ANOVA)对不同样品感官评定数据进行差异显著性分析,P<0.05表示存在显著差异。利用生科云(https:∥www.bioincloud.tech/)信息分析云平台进行分析和可视化绘图。

2 结果与分析

2.1 多肽感官评定结果分析

5种多肽感官评定结果见表1。由表1可知,5种多肽均具有明显的鲜味,鲜味评分从高到低依次为EP-6、ES-7、SG-7、PH-5、SE-6。EP-6(6.90)和ES-7(6.70)鲜味评分最高,阈值分别为0.178、0.167 mmol/L二者无显著差异;其次是SG-7(6.50)和PH-5(6.10),SE-6(5.60)得分最低。与MSG溶液的阈值(1.774 mmol/L)相比,5种多肽的阈值均较低,表明合成肽具有较强的鲜味活性。

表1 5种鲜味肽感官评定结果

Tab.1 Sensory evaluation results of five umami peptides

鲜味肽评分酸味甜味苦味鲜味咸味阈值/(mmol·L-1)EP-61.80±0.63b3.00±0.82b3.80±0.92a6.90±0.88a2.60±0.52ab0.178SG-72.20±0.92a2.80±1.03bc3.30±0.95b6.50±0.85b2.60±1.07ab0.174PH-52.10±0.57a3.00±0.94b2.70±1.06c6.10±0.74c2.70±0.82a0.390SE-62.00±0.67a2.60±0.97c2.90±0.99bc5.60±0.70d2.50±0.97b0.356ES-71.40±0.52b3.60±0.84a3.10±1.10b6.70±0.95ab2.60±1.17ab0.167

不同小写字母代表合成肽间滋味存在显著差异(P<0.05)。

2.2 多肽电子舌测定结果分析

利用电子舌对多肽进行测定,PCA结果见图1。由图1可知,前两个主成分(PC1和PC2)的累积贡献率达到91.8%,表明可以有效地区分不同肽段的滋味特征。研究表明,在PCA结果中两个样品的欧氏距离相差较小时,味道被识别为相似[17]。图1中,ES-7和EP-6距离靠近,即味道相似,且二者均更靠近MSG溶液;同理,PH-5和SE-6味道相似,距离MSG较远。以不同浓度的MSG对照溶液为参考,根据电子舌软件滋味强度排序(taste ranking)分析5种多肽的鲜味强度。5种多肽鲜味强度由大到小排序为ES-7、EP-6、SG-7、PH-5、SE-6。

图1 5种多肽电子舌分析结果
Fig.1 PCA analysis results of electronic tongue data for five synthesized peptides

2.3 多肽与T1R3互作结果分析

鲜味味觉受体hT1R1/T1R3是G蛋白偶联受体(GPCR)家族第一个味觉受体家族中的一种异二聚体,T1R3中的捕蝇草结构(T1R3-VFD)是鲜味物质重要的作用靶点[18]。本实验将人源重组T1R3-VFD蛋白预富集到CM5芯片,SPR分子互作分析结果见图2(a)。本实验需要偶联量较高的分析环境[19],因此醋酸钠的pH值在5.0条件下效果最佳,即偶联量为1250RU。随后,基于氨基偶联方式,利用1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺和N-羟基琥酰亚胺按照体积比1∶1进行混合,将T1R3-VFD结构域受体蛋白偶联绑定到CM5芯片。

图2 T1R3-VFD蛋白固定于CM5芯片pH值优化和5个多肽与T1R3-CM5互作的动力学分析
Fig.2 pH optimization of immobilization of T1R3-VFD protein on CM5 chip and binding kinetics of 5 peptides interacting with T1R3-CM5

利用已绑定T1R3-VFD结构域受体蛋白的芯片分析不同浓度多肽的分子互作响应值变化,分析结果见图2(b)至图2(f)。由图2(b)至(f)可知,5种多肽与T1R3-VFD的结合均是一种快速结合和快速解离的反应方式,形成“快上快下型”结合曲线。通过软件中Affinity方式进行动力学拟合分析,获得5种多肽与鲜味受体蛋白T1R3-VFD的平衡解离常数(KD),分析结果见表2。Chi2值可用于评估实验数据与拟合曲线的平均偏差,由表2可知,所有多肽的偏差均在可接受范围(即小于10%最大响应值)[20],KD值从小到大依次ES-7、EP-6、SG-7、PH-5、SE-6,这个排序与感官评定和电子舌分析结果基本一致,由此可知,通过分子互作分析可以很好地反应多肽的呈鲜强度。

表2 5种多肽与鲜味受体蛋白hT1R3的分子互作结果

Tab.2 Results of molecular interaction for five umami peptides and hT1R3

多肽KD/(mol·L-1)Chi2/(RU)2EP-61.140×10-50.1170SG-71.672×10-50.1710PH-51.774×10-50.0019多肽KD/(mol·L-1)Chi2/(RU)2SE-65.105×10-50.0317ES-71.471×10-60.0166

2.4 多肽与T1R3-VFD分子对接结果分析

目前hT1R1/T1R3-VFD的晶体结构尚未被解析,为了解析鲜味识别的分子机制,通过SWISS-MODEL(https:∥swissmodel.expasy.org)在线建模软件对hT1R1/T1R3进行同源建模(图3),选择构象一致性最高的结果作为模板分子,即T1R2a-T1R3(PDB id:5X2P)蛋白结构,通过在线同源建模获得最终的模拟构象[图3(a)]。通过Ramachandran分析评估同源性模型[图3(b)],由图3(b)可知,91.97%的氨基酸残基在合理范围内,结果表明计算机模拟的同源模型在二面体分布和三维碰撞方面是合理的[21]。

图3 鲜味受体蛋白hT1R3-VFD同源建模结果
Fig.3 Homology modeling results of umami receptor protein hT1R3-VFD

为了进一步研究所鉴定的这些鲜味肽的味觉机制,使用DS软件进行分子对接,以模板蛋白T1R2a-T1R3(PDB id:5X2P)中的配体Glu为参考,以此确定活性空腔位置。有研究表明,T1R1-VFD具有狭窄的结合腔,而T1R3-VFD具有开放结构域,可以与鲜味肽更好地结合[22-23],其空腔半径为20 Å,空腔位置为(108.35、62.16、54.65)。通过分子对接,5种鲜味肽(PH-5、EP-6、SE-6、ES-7和SG-7)与hT1R3-VFD的对接能量分别为-364.51、-436.52、-332.46、-276.98、-397.81 kJ/mol。对接能量值越小,配体与受体的结合亲和力越好。5种鲜味肽最佳对接构象见图4。由图4可知,5种鲜味肽均可进入位于hT1R3-VFD中的结合口袋,且所得结构具有最小的对接能量和对接相互作用能量。将分子对接能量排名与感官评估鲜味强度排序进行比较,发现存在差异。这可能是由hT1R1/T1R3同源性模型与真实受体的晶体结构之间的偏差引起的。尽管如此,总体趋势是一致的,结果证实EP-6和SG-7可以形成稳定的复合物,表现出强烈的鲜味活性,与前文感官评价和电子舌的分析结果相对应。

图4 鲜味肽与鲜味受体hT1R3-VFD分子对接模拟
Fig.4 Molecular docking simulation of umami peptides and hT1R3-VFD

由图4可知,PH-5、EP-6、SE-6、ES-7和SG-7与hT1R3-VFD结合方式主要包括氢键、疏水相互作用、范德华力、π-烷基相互作用(Pi-Alkyl)等。5种鲜味肽与hT1R3-VFD氨基酸残基的成键数量统计结果见表3。由表3可知,hT1R3-VFD的结合位点主要包括GLU45、ASN68、HIS145、SER146、ASP216、VAL277、HIS278和ALA302,它们通过氢键或疏水相互作用形成稳定复合物。对于氢键相互作用,ASN68最常出现在所有对接中,其次是GLU45、HIS278和GLN389。这一结果表明,ASN68、GLU45、HIS278和GLN389是在鲜味肽和hT1R3-VFD之间相互作用中起主要作用的结合位点。Yang等[24]研究发现,鲜味肽与鲜味受体T1R3结合的主要残基是VAL277、GLU301、ALA302、THR305和SER306,且所报道的多肽三维结构刚性较强,成键不易弯曲致使其位于VFD空腔外部,推测该多肽鲜味感知较为短暂。高度保守的氨基酸结合位点可以促进鲜味的产生,而不同的氨基酸残基赋予了多肽独特的风味。GLU(E)、GLU-SER(ES)被认为在鲜味肽与T1R1/T1R3的结合中起重要作用[25];另外,本研究中肽的含硫氨基酸(Cys和Met)比例很高,有研究表明,Cys侧链上的巯基(—SH)可在舌头上引起轻微的收敛感,从而显著增加厚味感(kokumi),延长鲜味感知[26-27],该结果与本实验结果相互印证,感受度较高的3个多肽ES-7、EP-6和SG-7均含有Cys。

表3 鲜味肽和hT1R3-VFD分子对接关键氨基酸残基、成键数量和对接能量

Tab.3 Key amino acid residues, bonding quantity and docking energy in umami peptides and hT1R3-VFD molecular docking

受体残基成键数量/个PH-5EP-6SE-6ES-7SG-7PRO42+GLU45+++++++++++ALA46++ARG64+PHE65+SER66++ASN68++++++++SER104+++HIS145++++++SER146+++++++GLU148+TYR167+GLY168++ASP216+++++++TYR218+LEU245+PRO246++++ARG247+++SER276+++VAL277++++HIS278++++++++GLU301++++++ALA302++++++++THR305+++SER306++++LEU308+GLN326++HIS388++++GLN389+++对接能量/(kJ·mol-1)-364.51-436.52-332.46-276.98-397.81

+代表hT1R3-VFD结合空腔中氨基酸与多肽形成了化学键,+的数量为氨基酸残基与多肽形成化学键的数量。

3 结 论

本研究通过电子舌、分子互作与分子对接联用技术,系统解析了大球盖菇中5种鲜味肽(EP-6、SG-7、PH-5、SE-6、ES-7)的呈味特征及其与鲜味受体T1R3的作用机制。感官评价与电子舌分析表明,EP-6和ES-7鲜味强度最高(阈值分别为0.178、0.167 mmol/L),其味觉特征与味精高度相似,而SE-6和PH-5鲜味较弱且短暂。SPR动力学实验显示,鲜味肽与T1R3-VFD呈“快速结合-解离”模式,平衡解离常数(KD)排序(ES-7KD值可作为鲜味强度的量化指标。分子对接结果进一步揭示,鲜味肽通过氢键(ASN68、GLU45、HIS278)、疏水作用(VAL277、ALA302)及Pi-Alkyl作用与受体结合,其中EP-6和ES-7因多重氢键形成表现出更高亲和力(对接能量分别为-436.52、-397.81 kJ/mol),而ASN68被确认为关键结合残基,可为受体互作机制解析提供分子线索。然而,基于同源模板(T1R2a-T1R3,序列一致性37.74%)的分子模型可能导致部分偏差,如SE-6的鲜味评分与对接能量不符,且SE-6的高阈值(0.356 mmol/L)与弱KD值(5.105×10-5 mol/L)间的结构-活性关系仍需深入探究。未来需结合冷冻电镜解析人源T1R1/T1R3的真实构象,并探索含硫氨基酸(Cys等)对“厚味感”的协同机制。本研究建立的“感官-分子互作-结构”综合评价体系旨在为高效筛选天然鲜味肽提供新策略,含EP-6和ES-7鲜味肽的基料作为潜在天然增鲜剂可替代化学添加剂,而多肽与鲜味受体结合机制的解析可为靶向肽设计和调控奠定理论基础。

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Taste Characteristic Evaluation and Molecular Mechanism Analysis of Umami Peptides Based on Combination of ‘Electronic Tongue-Molecular Interaction-Molecular Docking’ Technology

CHEN Wanchao, LI Wen, WU Di, ZHANG Zhong, LI Jialin, YANG Yan*

(Institute of Edible Fungi, Shanghai Academy of Agricultural Sciences/Key Laboratory of Edible Fungi Resources and Utilization (South), Ministry of Agriculture and Rural Affairs/National Engineering Research Center of Edible Fungi,Shanghai 201403,China)

Abstract： To investigate taste characteristics of the umami properties and their interaction mechanisms with umami receptors, five Stropharia rugosoannulata umami peptides (EP-6, SG-7, PH-5, SE-6, ES-7) were taken as the research objects, and the combined technology of sensory evaluation, electronic tongue analysis, surface plasmon resonance (SPR) molecular interaction technology, and molecular docking were used to systematically evaluate the umami intensity of the five umami peptides and analyze the molecular action mechanism with umami receptors. Sensory scoring (0-10) and taste dilution analysis revealed that EP-6 and ES-7 exhibited the highest umami intensity (6.90±0.88 and 6.70±0.95, respectively), with detection thresholds of 0.178 mmol/L and 0.167 mmol/L, significantly lower than the threshold (1.774 mmol/L) of 0.3 mg/mL monosodium glutamate (MSG). Principal component analysis of electronic tongue data (cumulative contribution rate reached 91.8% for first two components) demonstrated that the umami strength of EP-6 and ES-7 was comparable to 0.1% MSG, consistent with sensory evaluation. SPR kinetic analysis indicated that ES-7 showed the strongest binding affinity with T1R3-VFD receptor (KD=1.471×10-6 mol/L), characterized by binding and dissociation rates of fast on and fast off. Molecular docking revealed that EP-6 and SG-7 achieved the lowest docking energies (-436.52 kJ/mol and -397.81 kJ/mol, respectively), stabilized by hydrogen bonds and hydrophobic interactions with key residues (ASN68, GLU45, HIS278). Notably, sulfur-containing amino acids Cys prolonged umami perception through thiol-mediated interactions, corroborating the kokumi features observed in sensory evaluation. This study established a comprehensive and rapid evaluation system for umami peptides through combination of electronic tongue-molecular interaction-molecular docking technology, overcoming the subjective limitations of traditional sensory methods. The identification of core binding sites in umami receptor domains and elucidation of sulfur-containing amino acids’ regulatory role in taste persistence provided molecular insights for rational design and high-value application of natural umami enhancers. These findings advanced the development of precision flavor modulation technologies with significant implications for food science applications.

Keywords： umami peptide; molecular interaction; surface plasmon resonance; molecular docking; umami receptor; T1R3

文章编号：2095-6002(2025)03-0102-10

doi：10.12301/spxb202400521

引用格式：陈万超, 李文, 吴迪, 等. 基于电子舌、分子互作与分子对接联用技术的鲜味肽呈味特征评价及分子机制解析[J]. 食品科学技术学报,2025,43(3):102-111. CHEN Wanchao, LI Wen, WU Di, et al. Taste characteristic evaluation and molecular mechanism analysis of umami peptides based on combination of ‘Electronic tongue-molecular interaction-molecular docking’ technology[J]. Journal of Food Science and Technology, 2025,43(3):102-111.

中图分类号： TS202.3

文献标志码： A

收稿日期： 2024-08-09

基金项目： 上海市农业科技创新项目(2023-02-08-00-12-F04591)。

Foundation: Shanghai Agricultural Science and Technology Innovation Project (2023-02-08-00-12-F04591)．

第一作者： 陈万超,男,副研究员,博士,主要从事食用菌风味成分分析及产生机制研究。

*通信作者： 杨 焱,女,研究员,博士,主要从事食药用菌高值化利用研究。

(责任编辑：叶红波)