植物多酚广泛分布于植物的皮、根、茎、叶、果等组织中,是继纤维素、半纤维素及木质素后,又一类天然植物产物[1]。多酚可分为游离态多酚和结合态多酚[2-3]。游离态多酚可直接用水或有机溶剂提取,主要以单体形式存在于植物的细胞液泡中;结合态多酚(bound polyphenol,BP)是通过共价键与食品基质(如细胞壁物质)相结合的多酚,而植物细胞壁的主要成分是纤维素,人体胃肠道中的消化酶不能将其水解,是膳食纤维的一种。大量研究表明,结合态多酚对肠道功能有调节作用,具有保护机械屏障[4]、调控免疫屏障[5]、增强化学屏障[6-7]以及维持生物屏障等功效[8]。

近年来,多酚对肠道菌群的作用备受关注。多酚能够增加有益肠道菌群的数量,降低有害肠道菌群的丰度,调节人体组织器官的生理代谢,从而改善或者维持人体的健康状态[9]。Song 等[10]研究了茶多酚通过调节衰老模型大鼠肠道菌群,抑制肠道菌群失调引起的脑 TLR4/NF-κB炎症信号通路,从而改善大鼠记忆衰退;Lavefve 等[11]指出,浆果多酚增加双歧杆菌、乳酸杆菌和阿克曼氏菌有益菌的数目,具有类似益生元的效果。此外,关于板栗皮中酚类物质的报道越来越多,根据酚类化合物的基本化学结构,板栗皮中的酚类物质可分为3类:酚酸、黄酮类和单宁[12]。本课题组采用蒸馏水和乙醇水溶液对板栗皮中的酚类物质进行了提取,发现板栗皮黄酮对胰脂肪酶有一定的抑制作用[13],并且利用UPLC-ESI-MS/MS分析了板栗皮中的游离态以及结合态多酚的种类和相对含量,结果证明,板栗皮游离态多酚包括95种黄酮、73种黄酮醇、14种黄烷酮、13种黄烷醇、30种单宁、22种原花青素、22种花青素、10种类黄酮糖苷、8种异黄酮、5种查尔酮、5种黄烷醇和1种甲基化黄酮,其中排名前五的包括表儿茶素、天竺葵素-3-O-芸香糖苷、6,7,8-三羟基-5-甲氧基黄酮、原花青素C2和异鼠李素-7-O-葡萄糖苷[14],而结合态多酚包括80种酚酸,54种黄酮,11种木酚素,10种单宁,5种香豆素和5种苯醌[15]。本课题组先前还利用16S rRNA高通量测序技术研究了板栗皮原花青素对大鼠肠道菌群的影响,发现板栗皮原花青素能够改善肠道菌群的组成[16]。值得注意的是,板栗皮提取物的安全性分析显示,板栗皮提取物浓度在10 μg/mL以下时,其对巨噬细胞RAW 264.7的细胞活力并无影响,表明在一定浓度下板栗皮提取物无细胞毒性[17]。然而,目前关于板栗皮结合态多酚对肠道菌群作用的相关报道较少。

本研究构建体外结肠发酵模型,拟采用16S rRNA高通量测序技术[18],初步探究板栗外皮及内皮结合态多酚对 Sprague-Dawley (SD)大鼠肠道菌群的影响,评估肠道菌群的种类及丰度的变化。从调节肠道菌群这一角度分析板栗皮 BP 成为天然活性因子的潜在机制。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

板栗皮,购自湖北罗田。实验用SD大鼠粪便,由武汉金开瑞生物工程有限公司提供。

磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、氯化钠、氢氧化钠、十二烷基硫酸钠 (sodium dodecyl sulfate, SDS)、无水乙醇、浓盐酸、碳酸钠,分析纯,国药集团化学试剂有限公司;NKA-9大孔树脂,郑州和成新材料科技有限公司;HB8470型厌氧培养基,岛高科园海博生物技术有限公司;CTAB 缓冲液、Rnase A 缓冲液,西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司;Phusion® High-Fidelity PCR mix M0531S 试剂盒,纽英伦生物技术(北京)有限公司;AxyPrepTM DNA 凝胶回收试剂盒,AXYGEN康宁生命科学有限公司。

1.2 仪器与设备

JJ124BC型电子天平,常熟市双杰测试仪器厂;TG16-WS型离心机,湖南湘仪实验室仪器开发有限公司;LGJ-60A型真空冷冻干燥器,上海豫明仪器有限公司;THZ-100型恒温培养摇床,上海一恒科学仪器有限公司;SHZ-DⅢ型循环水式多用真空泵,河南省予华仪器有限公司;SW-CJ-1D型超净工作台,苏州智净净化设备有限公司;SPX-Ⅱ型生化培养箱,上海新苗医疗器械制造有限公司; BXM-30R型立式压力蒸汽灭菌锅,上海博讯实业有限公司医疗设备厂;Gene-Q型PCR 基因扩增仪,杭州博日科技有限公司;DYCP-31型电泳仪 北京六一仪器厂;CFX 96型荧光定量 qPCR 仪,美国Bio-Rad公司;QuantiFluorTM -ST型蓝色荧光定量系统,普洛麦格(北京)生物技术有限公司;Qubit® 2.0型荧光计,赛默飞世尔科技有限公司;2100型生物分析仪,安捷伦科技(中国)有限公司;DOC XR+ 型凝胶成像仪,伯乐生命医学产品(上海)有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 板栗皮结合态多酚的制备

板栗外皮结合态多酚(chestnut skin bound polyphenol,CSBP)的制备:参考Yang等[15]的方法处理板栗皮,采用碱水解法提取CSBP。称取1 g处理后的板栗外皮粉末,置于摇床中50 ℃、180 r/min、NaOH浓度1.7 mol/L、液料比为m(皮) ∶V(乙醇)=1 g∶50 mL条件下,振荡提取4.0 h。再使用柱层析纯化。

柱层析纯化条件。柱规格300 mm×10 mm,装填树脂体积10 mL,30 ℃。上样质量浓度0.23 mg/mL,pH=3,流速4 BV/h(每小时流经层析柱的液体体积为柱床体积的4倍),体积26 mL;解吸溶剂为体积分数为70%的乙醇溶液,pH=7,流速为3 BV/h(每小时流经层析柱的液体体积为柱床体积的3倍),解吸液体积为30 mL,最终多酚纯度达到24.08%±0.35%。

板栗内皮结合态多酚(chestnut inner skin bound polyphenol,CISBP)的制备:称取1 g处理后的板栗内皮粉末,置于摇床中50 ℃、转速180 r/min、NaOH浓度2.10 mol/L、液料比为m(皮)∶V(乙醇)=1 g∶31.5 mL条件下,振荡提取3.2 h。再使用柱层析纯化。

柱层析纯化条件。柱规格为300 mm×10 mm,装填树脂体积10 mL,30 ℃。上样浓度为1.30 mg/mL,pH=3,流速0.5 BV/h(每小时流经层析柱的液体体积为柱床体积的0.5倍),体积8 mL;解吸溶剂为体积分数为70%的乙醇溶液,pH=7,流速为3 BV/h(每小时流经层析柱的液体体积为柱床体积的3倍),解吸液体积为30 mL,最终多酚纯度达到30.52%±0.14%。

1.3.2 大鼠肠道菌群的收集及培养

肠道菌液的制备。取3只SD大鼠,每只均给予正常饮食,分别收集粪便10 g,干冰保存3 h内使用。将采集的SD大鼠粪便解冻,在无菌操作的工作环境下,将粪便与生理盐水按m(粪便)∶V(生理盐水)=1 g∶4 mL比例充分混合,而后用5层无菌纱布过滤。取滤液得肠道菌液,将菌液加入厌氧培养基中,比例为1份滤液∶9份培养基,充分混匀,用液体石蜡液封好,置于厌氧袋中,37 ℃下培养24 h。

1.3.3 板栗皮结合态多酚与肠道菌液的体外发酵

将肠道菌群培养液充分震荡摇匀,分别取 9 mL 培养液,置于9只透气无菌培养瓶中,分为3组,CK组中加入1 mL 去离子水, CSBP组中加入 1 mL的4 mg/mL CSBP溶液、CISBP组中1 mL的4 mg/mL CISBP溶液,混合均匀后,于 37 ℃在厌氧袋中厌氧培养48 h,结束后再对肠道菌群的 DNA 物质进行提取。

1.3.4 体外发酵菌液DNA的提取

参照Barbier等[19]的方法,用 CTAB/SDS 法分别提取板栗外皮、内皮 BP 处理组及对照组中肠道菌群的总基因组 DNA。提取后在质量分数为 1%的琼脂糖凝胶上测定 DNA 浓度和纯度。根据 DNA 质量浓度,用无菌水稀释DNA 质量浓度至1 ng/μL。

1.3.5 体外发酵菌液DNA的16S rRNA基因扩增及高通量测序

1.3.5.1 PCR扩增

使用的引物为16S V4-V5:515F-907R、18S V9:1380F-1510R、ITS1:ITS1F-ITS2R,用条形码特异性引物扩增16S/18S rRNA基因。所有PCR反应均在30 μL体系中进行,加入15 μL 的 Phusion® High-Fidelity PCR 反应液,0.2 μmol/L 的正反向引物(各1 μL),10 μL 左右的模板 DNA,剩余体积用无菌水补充。进行PCR扩增的热循环,反应参数见表1。将等体积的1×Loading Buffer(含SYB green荧光染料)与 PCR 产物混合,在质量分数为 2%琼脂糖凝胶上进行电泳检测。选择主带亮度在400～450 bp的样品进行进一步的实验[20]。

1.3.5.2 荧光定量PCR

荧光定量PCR总体系为15 μL,其中包括10 μL MonAmpTM ChemoHS qPCR Mix,正向引物反向引物(10 μmol/L各0.5 μL),2 μL DNA模板以及2 μL无菌水。程序为:预变性,98 ℃下5 min;变性,98 ℃下10 s;退火,50 ℃下30 s;延伸,72 ℃下60 s;72 ℃延伸10 min;溶解曲线,依照仪器默认值步骤2～4循环40次。

1.3.5.3 PCR产物纯化

在凝胶成像仪的紫外模式下对凝胶电泳产物进行回收切胶处理,两个泳道合为一组,尽量少切不含DNA片段的胶,使用AxyPrepTM DNA 凝胶回收试剂盒进行目的DNA的纯化。

1.3.5.4 高通量测序

使用NEB Next®UltraTM DNA Library Prep Kit for Illumina 生成测序文库。使用荧光计和生物分析仪对文库质量进行评估。最后,在 Illumina MiSeq 平台上对文库进行测序,获得250 bp/300 bp的成对阅读片段。

1.4 数据处理

所有实验均重复3次。通过QIIME软件(版本1.9.0)分析从Illumina平台获得的肠道微生物群高通量测序数据。使用UCLUST Usearch(版本 10)在97%的相似性级别定义了操作分类单元(operational taxonomic units,OTU)。通过与 Silva SSU rRNA 数据库进行比较,对每个细菌 OTU 的代表性序列进行注释(www.arb-silva.de),并在此基础上联合rRNA数据库(unite.ut.ee/index.php)使用RDP 分类器(版本2.2)对OTU进行归类。使用R 软件(版本 3.3.1)在 97%的相似性水平上分析 α-多样性(Shannon 指数)以及主成分分析(PCA)评估样本之间的总体差异,并进行物种群落成分分析。Coverage、ACE、Chao指数箱线图的绘制采用GraphPad Prsim 9.5.1。运用 PICRUSt 2 软件,对不同处理后 SD 大鼠肠道菌群的功能进行预测。

2 结果与分析

2.1 CSBP和CISBP对体外发酵液中肠道菌群OTU分布的影响

肠道菌群分别与CSBP和CISBP体外共发酵48 h后,采用16S rRNA(V4-V5区域)高通量测序分析肠道菌群组成,以评估板栗皮BP对肠道菌群的调节作用。从9个样品(CK组、CSBP组和CISBP组)中过滤原始测序数据的质量和嵌合体,结果显示总共生成643 307个读数,平均长度为419 bp。

测定得到的3组样品序列中,具有97%相似度的OTU数量为873个。其中,CK组包含286个,CSBP组包含280个,而CISBP组包含307个。3组样品共有221个共同的OTU。通过对比,可观察到肠道菌群的群落组成在不同处理组之间存在一定的差异。

2.2 CSBP和CISBP对体外发酵液中肠道菌群多样性的影响

在与CSBP以及CISBP体外共发酵48 h后,对16S rRNA(V4～V5区域)高通量测序得到结果的可信性进行分析,相关参数曲线见图1。

由图1(a)可知,肠道菌群的稀释曲线呈现平坦趋势,表明本次测序结果已足够反映当前样本所包含的多样性,增加测序数据量只会产生少量新的OTU[21]。在相同的测序深度下,CSBP组和CISBP组的丰富度高于CK组。表明CSBP与 CISBP 的添加均提高了物种多样性。此外,肠道菌群的多样性指数Shannon 曲线也呈现平坦趋势,见图1(b)。横坐标表示随机抽取的测序数据量,纵坐标是实际观测到的多样性指数,即Shannon 指数。每条曲线对应一个样本,随着样本量的增加,曲线走势趋于平坦,表明测序数据量充足,能够反映3种样本中绝大部分的微生物多样性信息。

丰度等级曲线可有效反映每个样本中不同物种丰度的分布规律,见图1(c)。横坐标表示物种丰富度,纵坐标代表物种在每个样本中的相对丰度值[22]。折线越长,该样本中的OTU数目越多,其中CK组的丰富度最低,CSBP 组和 CISBP 组的丰富度较高。此外,曲线的平缓程度反映群落组成的均匀度,折线越平缓,群落的均匀度越高。CK组和CSBP 组以及CISBP组的平缓程度相近,表明添加CSBP与CISBP均对群落的均匀度没有显著影响。

物种累积曲线可用来判断样本量是否足够并估计群落丰富程度,见图1(d)。横坐标测序数目代表样本量,纵坐标OTU数目代表被检测的物种数,随着样本数量的增加,曲线趋于平缓,表明丰富度不会随着样本数的增加而增加,即样本个数足够,与上述结果相符。

此外,α-多样性指数涵盖了一系列统计学分析指数[23],本研究用Coverage指数、Chao指数、ACE指数和稀释曲线来评估各组的α-多样性。Coverage 指数反映样本中微生物群落的覆盖度[24]。Chao指数和ACE指数均不考虑每个物种的相对丰度,只关注物种总数。二者的算法不同,但趋势相似,两个指数越大,代表对应群落的丰富度越高。而且,每个样本的 Coverage 值均为 0.998 以上,表明测序深度良好[25],覆盖率高,可以反映样本中真实的微生物群落状况,见图2。由图2 可知 ,CSBP 组和 CISBP 组的 Chao指数[图2(a)]及 ACE指数[图2(b)]变化趋势相似,均显著高于对照组(P<0.05),而板栗外皮 BP 组与板栗内皮BP组差异不显著(P>0.05),这表明CSBP和CISBP都能提高肠道菌群的丰富度。

就β-多样性而言,通过主成分分析(principal component analysis,PCA)比较 CK 、CSBP 和 CISBP 3组每个样本中所有OTU的相对丰度,以评估肠道微生物群落在不同样品之间的总体差异[26],结果见图3。

由图3可知,前两个主成分占总变异的96.67%,足以解释每个样本中肠道微生物群的大部分信息。此外,CK 组与 CSBP 组以及 CK 组与 CISBP 组之间出现了明显的分离。这些结果表明,CSBP 组和 CISBP 组的多样性与CK 组存在明显差异。

2.3 CSBP和CISBP对体外发酵液中优势菌及其相对丰度的影响

CSBP组和CISBP组在门和纲水平上的微生物群组成见图4。由图4(a)可知,在CK(78.56%)、CSBP(58.41%)和CISBP(67.40%)3组中,厚壁菌(Firmicutes)是门水平上最丰富的微生物群落,变形菌(Proteobacteria)在CK(14.10%)、CSBP(32.06%)和CISBP(23.53%)3组中排第2名。然而,加入 CSBP 或 CISBP 后,虽然厚壁菌门(Firmicutes)的占比仍然最大,但拟杆菌门(Bacteroidetes)的相对丰度有所增加,这导致CSBP(0.15) 和 CISBP(0.12) 两组的拟杆菌门与厚壁菌门比值(Bacteroidetes与Firmicutes)对比CK组(0.09)均有上升,有研究报道增加这一比值可以控制肥胖的发生[27],对人体健康产生积极的影响。Zheng等[28]研究了原花青素对高脂饮食诱导的肥胖 C57BL/6J 小鼠的抗肥胖作用,发现原花青素不仅使肥胖C57BL/6J小鼠体重增加减少、血脂状况改善以及能量消耗增加,而且显著降低了拟杆菌门与厚壁菌门(Bacteroidetes与Firmicutes)的比值,说明CSBP 和 CISBP可能具有与原花青素类似的抗肥胖作用。

在纲水平上,梭菌(Clostridia,71.88%)和伽马变形菌(Gammaproteobacteria,13.20%)为CK组中的优势菌,而CSBP组中的优势菌是梭菌(Clostri-dia,33.78%)、伽马变形菌(Gammaproteobacteria,30.89%)和杆菌(Bacilli,23.71%),CISBP组中的优势菌同样是梭菌(Clostridia,47.86%)、伽马变形菌(Gammaproteobacteria,22.93%)和杆菌(Bacilli,18.64%),见图4(b)。与CK组相比,在纲水平上,CSBP 组和 CISBP 组中的梭菌(Clostridia)的相对丰度下降,而伽马变形菌(Gammaproteobacteria)和杆菌(Bacilli,18.64%)的相对丰度提高。梭菌纲(Clostridia)是革兰氏阳性、厌氧、孢子杆菌,可能与人体肉毒杆菌中毒、破伤风、抗生素相关性腹泻和伪膜性结肠炎有关。先前研究表明,小檗碱降低了 2 型糖尿病小鼠肠道菌群中梭菌纲(Clostridia)的水平[29],这与本实验中梭菌纲(Clostridia)相对丰度下降类似。

对照组、添加CSBP和CISBP后肠道菌群相对丰度在属水平上的差异见图4(c)。添加CSBP 和 CISBP后,大肠志贺氏杆菌属(Escherichia-Shigella)、肠球菌属(Enterococcus)、拟杆菌属(Bacteroides)、乳杆菌属(Lactobacillus)、肠单胞菌属(Intestinimonas) 的相对丰度均上升,多尔氏菌属 (Dorea)、Lachnoclostridium、梭菌属 (Clostridiales)的相对丰度均显著下降。乳杆菌属(Lactobacillus)是被广泛认可的益生菌,具有抑制肠道有害菌、增强宿主免疫功能、维持肠道菌群稳定的特性,对人体健康产生积极作用[30]。与本研究结果一致,王伟等[31]证明了葡萄籽多酚能够提高肠道菌群多样性,促进乳酸杆菌属(Lactobacillus)的生长,有利于促进短链脂肪酸的产生,可能具有增强机体免疫的能力。肠单胞菌属(Intestinimonas)具有将糖和氨基酸转化为丁酸的能力,而丁酸不仅为生物体提供能量,还有助于改善宿主免疫功能,增强免疫力,同时稳定肠道菌群结构[32-33]。据报道多尔氏菌属(Dorea)与肥胖的发生呈正相关,早期糖尿病患者身体中该菌属的丰度高于正常人[34]。至于Lachnoclostridium,其所含的m3 基因被认定为结直肠腺瘤或结直肠癌的标志物,其丰度与溃疡性结肠炎癌变也呈正相关[35],而CSBP 和 CISBP能够抑制Lachnoclostridium的生长。因此,CSBP 和 CISBP对肠道菌群组成可能具有调节作用,具体表现为一些有益菌的丰度增加和一些有害菌的丰度下降,从而改善机体健康。

2.4 使用LEfSe分析鉴定的肠道菌群的主要差异

具体来说,LEfSe分析首先使用非参数析因Kruskal-Wallis和秩检验来检测两个或多个数据集之间丰度特征的显著差异。然后,进行线性判别分析(linear discriminant analysis,LDA),以估计每个差异丰度特征的影响大小,并为每个特征生成LDA分数。特定特征的LDA得分越高,表明对数据集的区分影响越大[36]。LEfSe分析进一步确定了受板栗外皮与内皮 BP 影响最大的肠道菌群。体外发酵48 h后,应用LEfSe分析确定CK组与CSBP 组和 CISBP组之间特定分类群的显著差异,分析结果表明CSBP 和 CISBP确实改变了肠道菌群的群落组成,尤其是厚壁菌门(Firmicutes),见图5。与CSBP和CISBP分别共发酵后,肠道菌群中厚壁菌门(Firmicutes)的相对丰度在分别从78.56%降低到58.41%和67.40%。

值得注意的是,与CK组相比,添加CSBP显著提高(P<0.05)了气球菌科(Aerococcaceae)的相对丰度,降低了梭菌目XI科(Family_XI)的相对丰度。气球菌科(Aerococcaceae)为乳杆菌目的革兰氏阳性的球菌,兼性厌氧,可产乳酸,以调节肠道环境,据报道与肺炎炎症因子呈负相关关系[37],被视为能够抑制机体炎症的有益细菌。而梭菌属XI科(Family_XI)为梭菌目的一科细菌,且被报道在与非酒精性脂肪性肝炎患者和肥胖人群的肠道菌群中相对丰度有所提高,不利于肠道健康[38]。因此,CSBP能够通过促进有益菌抑制有害菌来调节肠道健康。

此外,与CK组相比,添加CISBP则显著降低(P<0.05)了消化链球菌科(Peptostreptococcaceae)、瘤胃菌科(Ruminococcaceae)和梭菌目(Clostridiales)中XI科(Family_XI)的相对丰度,而先前研究表明,茯砖茶能够降低有害菌瘤胃菌科(Ruminococcaceae)和消化链球菌科(Peptostreptococcaceae)的相对丰度,减少肥胖和改善代谢紊乱[39]。由此可见,CISBP能够通过抑制有害菌来调节肠道健康。

2.5 使用PICRUSt 2预测CSBP和CISBP对肠道菌群生物功能的影响

使用PICRUSt 2软件,进行CSBP与CISBP对肠道微生物功能影响的预测[40]。预测结果显示,肠道菌群的主要生理活动包括细菌的生长繁殖、次生代谢产物的生物合成、碳水化合物、氨基酸及其他物质的代谢、遗传信息处理以及细菌的运动等。

相比于CK组,添加CSBP后导致了肠道菌群中的运动,糖及其衍生物的代谢,以及部分维生素等物质的代谢均呈上调状态,而对多数氨基酸的代谢则呈下调状态。具体涉及苯丙素生物合成,半乳糖代谢,视黄醇代谢,初、次级胆汁酸合成,磷酸转移酶,抗坏血酸及其盐的代谢,酪氨酸代谢,磷酸及其盐的代谢,多糖降解,氨基糖和核苷酸糖的代谢,鞘糖脂生物合成,鞭毛组装,信号转导,谷胱甘肽代谢以及核黄素代谢等生物学过程均呈上调状态。特别值得注意的是,谷胱甘肽代谢的增加据报道对机体的氧化损伤具有保护作用[41]。

然而,相比于添加CSBP,CISBP对肠道菌群的功能变化较为有限,仅果糖和甘露糖代谢以及苯丙素的生物合成呈增加趋势,可以促进脂肪代谢、血糖调节、神经递质的合成以及蛋白质的构建。添加CSBP或者CISBP提取物后,SD大鼠肠道菌群的生理活动及物质代谢均发生了变化,且CSBP对SD大鼠菌群的生理影响大于CISBP。

3 结 论

研究评估了板栗皮BP 对大鼠肠道菌群的影响。研究发现,CSBP和CISBP能够提高SD 大鼠肠道菌群的丰富度,且CSBP对SD大鼠菌群的影响大于CISBP;而且,CSBP和CISBP提高了乳杆菌属(Lactobacillus)等有益菌的相对丰度,降低了梭菌属(Clostridiales)等有害菌的相对丰度,可能具有类似益生元的效果。此外,CSBP和CISBP能够提高拟杆菌门(Bacteroidetes)与厚壁菌门(Firmicutes)的比值,而这一比例与肥胖呈负相关。功能预测分析结果证明,CSBP和CISBP均对肠道菌群的细胞生理活动及物质代谢起到正向作用。本研究结果在一定程度上揭示了板栗皮 BP对肠道菌群的调节作用,能够为进一步开发板栗资源提供参考依据。

目前得到的板栗皮 BP纯度依然较低,且其功能活性未得到体内实验验证。后续的研究还可以从三个方面进行更深层次的探讨。一是对板栗皮 BP的纯化工艺进行进一步优化,得到纯度更高的板栗皮 BP;二是进行细胞甚至动物实验来验证板栗皮 BP的益生元效果以及抗肥胖作用等功能活性;三是结合蛋白组学、代谢组学、基因组学以及转录组学等多组学技术进一步分析板栗皮 BP发挥功能活性的作用机制。

参考文献：

[1] 王梦丽. 植物多酚结构, 生物学活性研究及其保鲜应用[D]. 厦门: 厦门大学, 2019.WANG M L. Study on structure, biological activity and preservation application of plant polyphenols[D]. Xiamen: Xiamen University, 2019.

[2] GORZYNIK-DEBICKA M, PRZYCHODZEN P, CAPPELLO F, et al. Potential health benefits of olive oil and plant polyphenols[J]. International Journal of Molecular Sciences, 2018, 19(3): 686.

[3] PHAN A D T, NETZEL G, WANG D, et al. Binding of dietary polyphenols to cellulose: structural and nutritional aspects[J]. Food Chemistry, 2015, 171: 388-396.

[4] 杨武奇.茯砖茶茶褐素及结合态多酚缓解结肠炎的生化机制研究[D].西安:陕西师范大学,2022.YANG W Q. Study on biochemical mechanism of theophylcin and conjugated polyphenol in Fuzhuan tea alleviating colitis[D]. Xian: Shaanxi Normal University, 2022.

[5] ANDERSEN-CIVIL A I S, ARORA P, WILLIAMS A R. Regulation of enteric infection and immunity by dietary proanthocyanidins[J]. Frontiers in Immunology, 2021, 12: 637603.

[6] 徐瑞屿, 薛沙, 牛鸿艳, 等. 猕猴桃皮多酚对脂多糖应激Caco-2细胞抗氧化能力的影响[J]. 食品科学, 2024, 45(16): 105-112.XU R Y, XUE S, NIU H Y, et al. Effects of kiwis peel polyphenols on antioxidant capacity of Caco-2 cells under lipopolysaccharide stress [J]. Journal of Food Science, 2024, 45(16): 105-112.

[7] 胡福利.甘草酸对鸡慢性呼吸道病及发酵甘草对小鼠溃疡性结肠炎的作用研究[D].武汉:华中农业大学,2023.HU F L. Effects of glycyrrhizic acid on chronic respiratory disease in chicken and fermented liquorice on ulcerative colitis in mice[D]. Wuhan: Huazhong Agricultural University, 2023.

[8] 李高一舟,陈普,杨丽萍,等.小红参改善高胆碱膳食小鼠结肠屏障功能障碍及减轻肠道炎症反应[J].中国医院药学杂志,2023,43(20):2270-2274.LI G Y Z, CHEN P, YANG L P, et al. Little red ginseng improves colon barrier dysfunction and alleviates intestinal inflammation in mice fed high choline diet[J]. Chinese Journal of Hospital Pharmacy, 2023, 43(20): 2270-2274.

[9] HERVERT-HERNNDEZ D, GOI I. Dietary polyphenols and human gut microbiota: a review[J]. Food Reviews International, 2011, 27(2): 154-169.

[10] SONG C, ZHANG Y, CHENG L, et al. Tea polyphenols ameliorates memory decline in aging model rats by inhibiting brain TLR4/NF-κB inflammatory signaling pathway caused by intestinal flora dysbiosis[J]. Experimental Gerontology, 2021, 153: 111476.

[11] LAVEFVE L, HOWARD L R, CARBONERO F. Berry polyphenols metabolism and impact on human gut microbiota and health[J]. Food &Function, 2020, 11(1): 45-65.

[12] HU M Y, YANG X K, CHANG X D. Bioactive phenolic components and potential health effects of chestnut shell: a review[J]. Journal of Food Biochemistry, 2021, 45(4):e13696.

[13] 黄雪薇,雷嗣超,涂芬,等. 板栗壳黄酮结构分析及其对胰脂肪酶活力的抑制作用[J]. 食品科学, 2021, 42(21): 111-118.HUANG X W, LEI S C, TU F, et al. Structure analysis of flavonoids from chestnut shell and its inhibitory effect on pancreatic lipase activity [J]. Food Science, 2021, 42(21): 111-118.

[14] TU F, XIE C Y, LI H N, et al. Effect of in vitro digestion on chestnut outer-skin and inner-skin bioaccessibi-lity: the relationship between biotransformation and antioxidant activity of polyphenols by metabolomics[J]. Food Chemistry, 2021, 363(30): e130277.

[15] YANG F, WEI D, LI J, et al. Chestnut shell represents a rich source of polyphenols: preparation methods, antioxidant activity and composition analysis of extractable and non-extractable polyphenols[J]. European Food Research and Technology, 2023, 249(5): 1273-1285.

[16] XIE C Y, LI J, FANG Y H, et al. Proanthocyanins and anthocyanins in chestnut (Castanea mollissima) shell extracts: biotransformation in the simulated gastrointestinal model and interaction with gut microbiota in vitro[J]. Journal of the Science of Food and Agriculture, 2023,103(7):3659-3673.

[17] 谢辰阳. 板栗壳原花青素及其相关物质调节肠道菌群及免疫活性研究[D]. 武汉: 武汉工程大学, 2022.XIE C Y. Study on regulation of intestinal flora and immune activity by procyanidins of chestnut shell and its related substances [D]. Wuhan: Wuhan Institute of Technology, 2022.

[18] MEDVEDEV P. Theoretical analysis of sequencing bioinformatics algorithms and beyond[J]. Communications of the ACM, 2023, 66(7): 118-125.

[19] BARBIER F F, CHABIKWA T G, AHSAN M U, et al. A phenol/chloroform-free method to extract nucleic acids from recalcitrant, woody tropical species for gene expression and sequencing[J]. Plant Methods, 2019, 15: 1-13.

[20] XU J, TANG M, LIU Y, et al. Safety assessment of monosodium glutamate based on intestinal function and flora in mice[J]. Food Science and Human Wellness, 2022, 11(1): 155-164.

[21] 武明月, 孔祥丽, 张天阳, 等. 菊粉和大豆膳食纤维对牛肉饮食的小鼠肠道菌群及其代谢产物的改善作用[J]. 食品科学, 2022, 43(5): 158-167. WU M Y, KONG X L, ZHANG T Y, et al. Effects of inulin and soybean dietary fiber on intestinal microflora and its metabolites in mice fed beef[J]. Food Science, 2022, 43(5): 158-167.

[22] 李明亮, 严建刚, 朱艳, 等. 乳清蛋白和豌豆蛋白对抗生素致肠道菌群紊乱小鼠的调节作用[J]. 中国食品学报, 2021, 21(11): 86-95. LI M L, YAN J G, ZHU Y, et al. Effects of whey protein and pea protein on intestinal flora disturbance induced by antibiotics in mice[J]. Chinese Journal of Food Science, 2021, 21(11): 86-95.

[23] YANG Y, MISRA B B, LIANG L, et al. Integrated microbiome and metabolome analysis reveals a novel interplay between commensal bacteria and metabo-lites in colorectal cancer[J]. Theranostics, 2019, 9(14): 4101-4114.

[24] QIAN X B, CHEN T, XU Y P, et al. A guide to human microbiome research: study design, sample collection, and bioinformatics analysis[J]. Chinese Medical Journal, 2020, 133(15): 1844-1855.

[25] 白路平, 乔向宇, 海勒, 等. 骆驼乳对慢性酒精性肝损伤小鼠肠道菌群的影响[J]. 中国食品学报, 2022, 22(1): 78-87. BAI L P, QIAO X Y, HAI L, et al. Effects of camel milk on intestinal flora in mice with chronic alcoholic liver injury[J]. Chinese Journal of Food Science, 2022, 22(1): 78-87.

[26] GURCAN F, CAGILTAY N E. Exploratory analysis of topic interests and their evolution in bioinformatics research using semantic text mining and probabilistic topic modeling[J]. IEEE Access, 2022, 10: 31480-31493.

[27] 单天昊, 麻微微. 饮食通过调节肠道微生态对肥胖的影响[J]. 食物与营养, 2020, 26(9): 5-8. SHAN T H, MA W W. Effects of diet on obesity by regulating intestinal microecology[J]. Food and Nutrition, 2020, 26(9): 5-8.

[28] ZHENG S, HUANG K, ZHAO C, et al. Procyanidin attenuates weight gain and modifies the gut microbiota in high fat diet induced obese mice[J]. Journal of Functional Foods, 2018, 49: 362-368.

[29] ZHAO J D, LI Y, SUN M, et al. Effect of berberine on hyperglycaemia and gut microbiota composition in type 2 diabetic Goto-Kakizaki rats [J]. World Journal of Gastroenterology, 2021, 27(8): 708-724.

[30] 任大勇. 益生乳酸杆菌的黏附及免疫调节作用研究[D]. 长春: 吉林大学, 2013. REN D Y. Study on adhesion and immunomodulatory effects of probiotic Lactobacillus[D]. Changchun: Jilin University, 2013.

[31] 王伟, 布丽根·加冷别克, 祖丽普努尔·麦提赛伊迪, 等. 葡萄籽多酚对免疫抑制小鼠肠道菌群的影响[J]. 保鲜与加工, 2021, 21(7): 116-124. WANG W, BRIGAN G, ZULIPNUR M, et al. Effects of grape seed polyphenols on intestinal flora in immunosuppressed mice [J]. Preservation and Processing, 2019, 21(7): 116-124.

[32] BUI T P N, SHETTY S A, LAGKOUVARDOS I, et al. Comparative genomics and physiology of the butyrate-producing bacterium Intestinimonas butyriciproducens[J]. Environmental Microbiology Reports, 2016, 8(6): 1024-1037.

[33] 袁晓慧.德尔卑沙门菌和肠道菌群互作机制的研究[D]. 扬州:扬州大学,2020. YUAN X H. Study on interaction mechanism between Salmonella delpis and intestinal flora[D]. Yangzhou: Yangzhou University, 2020.

[34] GAO J, GUO X, WEI W, et al. The association of fried meat consumption with the gut microbiota and fecal metabolites and its impact on glucose homoeostasis, intestinal endotoxin levels, and systemic inflammation: a randomized controlled-feeding trial[J]. Diabetes Care, 2021, 44(9): 1970-1979.

[35] GONG J, SHEN G, ZHU M, et al. 16S rRNA gene sequencing analysis on changes in the intestinal flora of Procambarus clarkii with “black may” disease[J]. Journal of Oceanology and Limnology, 2022, 40(5): 2068-2079.

[36] MASUMOTO S, TERAO A, YAMAMOTO Y, et al. Non-absorbable apple procyanidins prevent obesity associated with gut microbial and metabolomic changes[J]. Scientific Reports, 2016, 6(1): 31208.

[37] WANG J M, REN C, JIN L L, et al. Seabuckthorn Wuwei Pulvis attenuates chronic obstructive pulmonary disease in rat through gut microbiota-short chain fatty acids axis[J]. Journal of Ethnopharmacology, 2023, 314: 116591.

[38] ZHANG N, MOU D, LI T, et al. Integrated analysis reveals important differences in the gut and oropharyngeal microbiota between children with mild and severe hand, foot, and mouth disease[J]. Emerging Microbes &Infections, Emerging Microbes &Infections, 2023, 12(1): 2192819.

[39] 傅冬和, 朱洺志, 刘仲华. 安化黑茶调理肠胃功效及作用机理[J]. 中国茶叶, 2023, 45(3): 1-7.FU D H, ZHU M Z, LIU Z H. Effect and mechanism of Anhua black tea in regulating gastrointestinal tract[J]. China Tea, 2023, 45(3): 1-7.

[40] CHEN C, CHEN K, HUANG Z, et al. Identification of intestinal microbiome associated with lymph-vascular invasion in colorectal cancer patients and predictive label construction[J]. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology, 2023, 13: 444.

[41] MINICH D M, BROWN B I. A review of dietary (phyto) nutrients for glutathione support[J]. Nutrients, 2019, 11(9): 2073.

Effect of Bound Polyphenols in Chestnut Skin on Intestinal Microbiota

XIE Chenyang1,2, ZHANG Wen1,2, LI Jie1,2, YANG Fang1,2,*, ZHANG Mei2,*(1.School of Environmental Ecology and Biological Engineering, Wuhan Institute of Technology,Wuhan 430205, China;2.Key Laboratory of Green Chemical Process of Ministry of Education

(Wuhan Institute of Technology)/ Engineering Research Center of Phosphorus Resources Development and Utilization of Ministry of Education/ Hubei key Laboratory of Novel Reactor and Green Chemical Technology, Wuhan 430205, China)

Abstract： In order to explore the effects of chestnut skin and inner skin bound polyphenols on the intestinal microbiota of SD rats, an in vitro colonic fermentation model was constructed, which was divided into chestnut skin bound polyphenols (CSBP) group, chestnut inner skin bound polyphenols (CISBP) group and control (CK) group, and the microbial diversity analysis of the three groups was determined by 16S rRNA high-throughput sequencing technology. The results showed that compared with the CK group, the relative abundance of intestinal microbiota in the CSBP group and CISBP group increased overall, the ratio of Bacteroidetes to Firmicutes increased, and the relative abundance of beneficial bacteria such as Lactobacillus and Intestinimonas significantly increased. However, the relative abundance of harmful bacteria such as Dorea and Clostridiales significantly decreased. In addition, the function prediction showed that CSBP had the effects of promoting cell growth and reconstruction, maintaining the normal function of tissues and organs, scavenging free radicals and toxic substances, and reducing cell damage and inflammation. CISBP could promote fat metabolism, blood sugar regulation, neurotransmitter synthesis, and protein construction. It could be concluded that CSBP and CISBP had an effect on the intestinal microbiota, promoting beneficial bacteria and inhibiting harmful bacteria by increasing the abundance of intestinal microbiota, and the intestinal microbiota of SD rats developed towards a healthier composition. This study aimed to provide a reference for further development of chestnut resources and the research and development of functional foods that could regulate intestinal microbiota.

Keywords： chestnut skin; bound polyphenols; in vitro anaerobic fermentation; intestinal microbiota; 16S rRNA high-throughput sequencing

文章编号：2095-6002(2025)03-0067-11

doi：10.12301/spxb202400148

引用格式：谢辰阳,张文,李杰,等.板栗皮结合态多酚对肠道菌群的影响[J]. 食品科学技术学报,2025,43(3):67-77. XIE Chenyang, ZHANG Wen, LI Jie, et al. Effect of bound polyphenols in chestnut skin on intestinal microbiota[J]. Journal of Food Science and Technology, 2025,43(3):67-77.

中图分类号： TS255.1

文献标志码： A

收稿日期： 2024-03-08

基金项目： 国家自然科学基金青年基金项目(31701604);湖北省大学生创新创业训练计划资助项目(S202310490021);武汉工程大学校长基金资助项目(XZJJ2023049)。

Foundation: National Natural Science Foundation of China (31701604); Innovation and Entrepreneurship Training Program for College Students in Hubei Province (S202310490021); Project Supported by President’s Fund of Wuhan Institute of Technology (XZJJ2023049).

第一作者： 谢辰阳,女,博士研究生,研究方向为天然产物与功能因子。

*通信作者： 杨 芳,女,教授,博士,主要从事天然产物与功能因子方面的研究;张 美,女,高级实验师,主要从事食品分析与加工方面的研究。

(责任编辑：李 宁)