D-阿洛酮糖(D-allulose或D-psicose)是一种低热量稀有糖,是D-果糖的C-3的同分异构体[1-2]。研究显示,在食品工业中,D-阿洛酮糖是蔗糖和果葡糖浆(high fructose corn syrup,HFCS)的理想替代品,其甜味是蔗糖的70%,且几乎不被人体代谢[3-4]。D-阿洛酮糖还具有较多的保健功效,如抗高血脂[5]、抗高血糖[6]、清除活性氧(ROS)[7]、治疗动脉粥样硬化等[8]。此外,该稀有糖还能增强凝胶强度,降低食品加工过程中的氧化程度,改善食品风味[9-11]。2011年,D-阿洛酮糖被美国食品与药品监督管理局(Food and Drug Administration,FDA)确定为普遍公认安全食品(generally regarded as safe,GRAS)[12]。D-阿洛酮糖的风味特点、加工特性和生理活性,使其在食品工业中具有广阔的应用前景[13]。然而,D-阿洛酮糖在自然界含量极低,难以直接提取[14-15]。

利用生物转化法,以D-阿洛酮糖3-差向异构酶(D-allulose 3-epimerase, DAE)催化D-果糖合成D-阿洛酮糖,已在少部分国家实现了D-阿洛酮糖的商业化生产[1,16];但D-果糖的价格较高,导致D-阿洛酮糖的生产成本居高不下,也制约了D-阿洛酮糖的应用推广。因此,寻找以低价格原料制备D-阿洛酮糖的生物转化技术具有重要意义。根据日本香川大学的Izumoring教授提出的策略,通过酮糖差向异构酶、醛糖异构酶、多元醇脱氢酶和醛糖还原酶等多个酶促催化步骤,可实现各种单糖之间的相互转化[17-18]。该策略表明,可以利用多种酶的协同催化作用,实现以其他单糖为底物生产D-阿洛酮糖。

D-葡萄糖异构酶(D-glucose isomerase, GI),也称为D-木糖异构酶,可催化D-葡萄糖与D-果糖的相互转化,已应用于果葡糖浆的工业化生产[19-20]。Li等[20]将来自Thermus thermophilus的GI与来自Agrobacterium tumefaciens的DAE分别固定在酿酒酵母中,两种酶经多次重复催化后,D-葡萄糖生成D-阿洛酮糖的转化率最高为12%。Zhao等[21]将来自Bacillus sp.的GI与来自Dorea sp. CAG317的DAE在枯草芽孢杆菌中进行共表达,通过优化mRNA翻译起始区的5′-非翻译区结构提高DAE活性,优化后最高转化率为13.6%,催化反应达到平衡时D-葡萄糖、D-果糖和D-阿洛酮糖的比例约为3.1∶3.2∶1.0。Men等[22]将来自Bacillus sp.的GI与来自Ruminococcus sp.的DAE分别插入载体的不同表达位点之间,将两种酶进行共表达,催化D-葡萄糖生成D-阿洛酮糖,当反应达到平衡时,可催化10 g/L D-葡萄糖产生1.6 g/L的D-阿洛酮糖,最终D-葡萄糖、D-果糖和D-阿洛酮糖的比例为3.0∶2.7∶1.0。可见,利用GI与DAE共同催化可以实现D-葡萄糖到D-阿洛酮糖的转化,但总的D-阿洛酮糖转化率不高,还有待于进一步优化。

本研究拟通过融合蛋白的方式拉近GI与DAE的催化中心,增强两种酶的协同催化能力,进而提高D-葡萄糖到D-阿洛酮糖的转化率。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

胰蛋白胨、酵母提取物,英国Oxoid公司;D-葡萄糖标准品、D-果糖标准品、异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)、氨苄青霉素钠、Tris 三(羟甲基)氨基甲烷、BCA蛋白质浓度测定试剂盒、彩虹180广谱蛋白Marker,北京索莱宝科技有限公司;D-阿洛酮糖标准品,上海麦克林生化科技股份有限公司;大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,上海昂羽生物技术有限公司;F55果葡糖浆,天津嘉吉食品有限公司。实验所用试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

Agilent 8453型紫外可见分光光度计,1260 infinity Ⅱ型高效液相色谱仪(HPLC),美国安捷伦科技有限公司;ZCZY-CS8型摇床,上海知楚仪器有限公司;DYCZ-24DH型双板垂直电泳仪,北京六一生物科技有限公司;AKTApure型层析仪、HisTrapHP型镍离子亲和层析柱,美国通用电气公司;LS-B50 L型立式蒸汽压力锅,上海华线医用核子仪器有限公司;GB11165 Seven Easy型酸度计,上海梅特勒托利多仪器有限公司;HH-ZK8型恒温水浴锅,巩义市予华仪器有限责任公司;Model-680型酶标仪,美国Bio-Rad公司;GLASS gel 预制胶,上海万生昊天生物技术有限公司;Sugar-Pak Ⅰ型色谱柱,美国沃特世(Waters)公司。

1.3 实验方法

1.3.1 培养基的配制

LB液体培养基:胰蛋白胨10.0 g/L、酵母提取物5.0 g/L、NaCl 10.0 g/L,pH值自然。

LBA液体培养基:LB液体培养基临用前加入氨苄青霉素Ampicillin(Amp)至质量浓度为100 mg/L。

1.3.2 基因克隆与菌株构建

将GI编码基因与DAE编码基因通过连接肽编码基因连接在一起,所选连接肽为刚性α螺旋连接肽(3×EAAAK)和柔性连接肽(3×GGGGS)。构建GE3A、GS3A、AE3G和AS3G融合蛋白(连接方式和连接肽见表1)。

表1 4种融合蛋白连接方式和所用连接肽

Tab.1 Connection method and peptide linkers for four fusion proteins

融合蛋白N端功能连接肽序列C端功能GE3AGIEAAAKEAAAKEAAAKDAEGS3AGIGGGGSGGGGSGGGGSDAEAE3GDAEEAAAKEAAAKEAAAKGIAS3GDAEGGGGSGGGGSGGGGSGI

GE3A、GS3A、AE3G和AS3G的编码基因分别由苏州金唯智生物科技有限公司合成,插入大肠杆菌表达载体pET-22b的NdeI和XhoI酶切位点之间。将4种重组质粒分别转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,获得表达4种融合蛋白的重组菌株。重组菌株接种于LBA液体培养基中过夜培养,按照体积分数为5%的接种量接种到新鲜LBA中,培养至OD600为0.6～0.8,添加终浓度为1 mmol/L的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG),在30 ℃,200 r/min条件下诱导基因表达8 h。诱导培养结束后,在4 ℃,8 000 r/min条件下离心收集菌体,使用50 mmol/L 乙酸钠缓冲液洗涤细胞两次。使用全细胞催化的方法测定GI和DAE的活性。GI活性测定底物为D-葡萄糖(100 g/L),反应温度为80 ℃;DAE活性测定底物为D-果糖(100 g/L),反应温度为55 ℃。其他反应条件均为乙酸钠50 mmoL/L、pH值为7.0、Co2+ 1 mmol/L、重组细胞质量浓度(湿质量)40 g/L。

1.3.3 酶转化率的测定

通过测定D-葡萄糖、D-果糖及D-阿洛酮糖的质量浓度来测定融合蛋白转化率。除非另有说明,反应条件如下:

乙酸钠缓冲液50 mmol/L(pH值为7.0)、D-葡萄糖质量浓度为100 g/L、Co2+浓度为1 mmol/L、重组菌细胞质量浓度40 g/L(湿质量),55 ℃反应15 min。根据实验需要,也可用F55果葡糖浆(果糖体积分数为55%)替代葡萄糖作为底物。F55果葡糖浆添加量为5%(体积分数),反应液中D-葡萄糖和D-果糖的质量浓度分别为34.4、38.8 g/L。

反应结束后沸水浴10 min使酶失活。10 000 r/min离心10 min,取上清液,稀释5倍后用0.22 μm滤膜过滤。所有实验设置3组平行。

HPLC检测条件:色谱柱为Waters Sugar-Pak Ⅰ,使用安捷伦1260 infinity Ⅱ HPLC,检测器为示差折光检测器(RID),流动相为超纯水,流速为0.6 mL/min,进样量10 μL,检测器温度45 ℃,柱温箱温度80 ℃。

1.3.4 D-阿洛酮糖转化率的计算

根据式(1)、式(2)分别计算葡萄糖或果葡糖浆为底物时,融合蛋白将D-葡萄糖或果葡糖浆转化生成D-阿洛酮糖的转化率。

D-葡萄糖生成D-阿洛酮糖的转化率

(1)

果葡糖浆生成D-阿洛酮糖的转化率

(2)

式(1)和式(2)中:Af为反应终止时D-阿洛酮糖质量浓度,g/L;Gi为反应初始时D-葡萄糖质量浓度,g/L。式(2)中:Hi为反应初始时果葡糖浆中葡萄糖与果糖的质量浓度,g/L。

1.3.5 全细胞催化D-葡萄糖转化为D-阿洛酮糖的条件优化

1.3.5.1 温度和pH值的确定

将酶反应体系分别置于 45、50、55、60、65、70、75、80、85 ℃条件下,其余反应参数参照1.3.3中反应体系设置。测定各组的转化率,确定最适反应温度。更换50 mmol/L不同pH值的缓冲液(乙酸钠缓冲液pH值为4.5～6.0,磷酸钠缓冲液pH值为6.0～7.0,Tris-HCl缓冲液pH值为7.0～9.0),确定催化反应的最适pH值。

1.3.5.2 金属离子种类的确定

用含有10 mml/L乙二胺四乙酸(EDTA)的50 mmol/L PBS缓冲液在4 ℃下对湿细胞透析24 h,去除金属离子。用50 mmol/L无EDTA的PBS缓冲液(pH值为7.0)进行透析,去除EDTA,并螯合除去金属离子。

湿细胞中添加不同种类的金属离子[Co2+、Mn2+、Co2+/Mn2+(0.5 mmol/L Co2+和0.5 mmol/L Mn2+)、Mg2+、Ca2+、Cu2+、Fe2+、Ni2+、Zn2+和EDTA]至终浓度为1 mmol/L,在4 ℃下孵育1 h,其余反应参数参照1.3.3中反应体系设置。测定各组的转化率,确定最适金属离子。

1.3.5.3 细胞质量浓度的确定

为研究全细胞催化体系中细胞浓度对酶反应的影响,设置添加细胞的质量浓度为10～100 g/L。反应时间分别为0.5、1.0、2.0 h。

1.4 数据处理

所有实验均重复进行3次,数据以平均值±标准偏差(SD)表示。采用Origin 2021软件绘图。使用SPSS和Duncan方法,对数据进行方差分析和多重测试分析,P<0.05表示数据存在显著差异。

2 结果与分析

2.1 融合蛋白的表达与催化活性分析

GE3A、GS3A、AE3G、AS3G融合蛋白编码基因长度均为2 109 bp,表达翻译后蛋白质的分子质量均为79 kDa。对表达4种融合蛋白的重组细胞进行SDS-PAGE分析(图1),发现经发酵后,所有重组菌株均在79 kDa左右存在条带,说明融合蛋白经诱导发酵后被重组细胞成功表达。

M—Maker,1—GE3A,2—GS3A,3—AE3G,4—AS3G,ck—对照组。

图1 表达4种融合蛋白重组细胞的SDS-PAGE结果
Fig.1 SDS-PAGE results of recombinant cells expressing four fusion proteins

分别以D-葡萄糖和D-果糖作为底物,加入表达融合蛋白的重组E. coli细胞进行催化反应,确定4种融合蛋白中GI和DAE的反应活性,结果如图2。图2(a)表明,当以D-葡萄糖为底物时,4种融合蛋白表达菌株均能够催化产生D-果糖,转化率分别为17.14%、28.92%、21.5%和16.85%,说明重组蛋白中均保留了GI活性。由图2(b)可知,当以D-果糖为底物时,只有AE3G和AS3G能够催化产生D-阿洛酮糖,转化率分别为31.17%和30.6%,而GS3A、GE3A不能催化D-果糖转化为D-阿洛酮糖。说明GI和DAE的融合位置对活性的影响不同,GI融合在蛋白的N端或C端都可以保持较高的催化活性,而DAE只有融合在蛋白的N端时才能保持活性,融合在蛋白的C端则导致活力完全丧失。

图2 以D-葡萄糖和D-果糖为底物时融合蛋白的催化反应结果
Fig.2 Results of catalytic reactions by fusion proteins using D-glucose and D-fructose as substrates

进一步以D-葡萄糖为底物,加入4种融合蛋白重组表达细胞进行催化,利用HPLC测定反应12 h时催化体系中D-葡萄糖、D-果糖和D-阿洛酮糖的质量浓度,结果如图3。图3表明,GE3A和GS3A构型融合蛋白反应体系中只能检测到D-葡萄糖和D-果糖,未检测到D-阿洛酮糖,这与GE3A和GS3A具备GI活性但不具备DAE活性一致(图2)。AE3G和AS3G反应体系中同时检测到D-葡萄糖、D-果糖和D-阿洛酮糖,说明这二者能够以D-葡萄糖为底物,将其同时转化为D-果糖和D-阿洛酮糖。4种融合蛋白重组细胞催化D-葡萄糖转化成D-阿洛酮糖随时间变化情况如图4。图4显示,AE3G和AS3G催化葡萄糖生成D-阿洛酮糖的质量浓度随时间延长不断增加,反应达到平衡时,AE3G和AS3G分别产生4.38 g/L和2.72 g/L的D-阿洛酮糖。AE3G催化生成D-阿洛酮糖的质量浓度在反应6 h后显著高于AS3G,说明刚性α螺旋连接肽相较柔性连接肽更有利于D-葡萄糖到D-阿洛酮糖的转化,其原因可能是刚性连接肽把GI和DAE的催化位点固定在了适当的距离,有助于形成稳定的催化环境,减少中间物D-果糖的传递距离,从而提高了催化活性;而柔性连接肽允许两种酶在更广的空间范围内移动,不利于形成稳定的催化环境。由于GI和DAE的最适温度、最适pH值、最适金属离子的催化特征并不相同,二者融合后的催化条件还有待阐明。

图3 以D-葡萄糖为底物时融合蛋白催化产物的HPLC
Fig.3 HPLC of catalytic reaction by fusion proteins using D-glucose as substrate

图4 反应时间对融合蛋白催化D-葡萄糖生成D-阿洛酮糖的影响
Fig.4 Effect of reaction time on D-allulose catalytic synthesis by fusion proteins from D-glucose

2.2 融合蛋白AE3G催化D-葡萄糖生成D-阿洛酮糖反应条件的优化

2.2.1 温度对AE3G催化D-葡萄糖生成D-阿洛酮糖的影响

在不同温度条件下进行融合蛋白AE3G的催化反应,D-葡萄糖到D-阿洛酮糖的相对活性变化如图5。由图5可知:反应温度从45 ℃逐渐递增至65 ℃时,融合蛋白AE3G的相对活性随温度升高而上升;65 ℃时D-葡萄糖到D-阿洛酮糖的转化活性最高;超过65 ℃时酶的转化能力急剧下降。这可能是因为,GI和DAE的最适温度分别为80 ℃和55 ℃[23-24],此两种异构酶所组成融合蛋白的最适温度在两者最适温度之间,65 ℃恰好接近其二者最适温度的平均值。DAE对高温的耐受性较差,超过70 ℃活性明显降低,因而使得融合蛋白AE3G催化活性在温度提高至75 ℃时下降剧烈。

图5 反应温度对融合蛋白AE3G相对活性的影响
Fig.5 Effect of reaction temperature on relative activity of fusion protein AE3G

2.2.2 金属离子对AE3G催化D-葡萄糖生成D-阿洛酮糖的影响

不同金属离子对融合蛋白AE3G催化活性的影响,实验结果如图6。由图6可知,金属离子对酶的催化活性至关重要,加入EDTA螯合金属离子后酶的催化活性全部丧失;不同二价金属离子对酶的活性有一定影响,0.5 mmol/L的Co2+和Mn2+同时存在时酶的相对活性最大。根据报道,GI和DAE的最适金属离子分别为Mn2+和Co2+[24-25],本研究中,同时添加Mn2+和Co2+时融合蛋白的相对活性最大,这与文献报道一致。

不同小写字母表示组间差异显著(P<0.05)。

图6 添加不同金属离子对AE3G相对活性的影响
Fig.6 Effect of adding different metal ions on relative activity of AE3G

2.2.3 缓冲液及其pH值对AE3G催化D-葡萄糖生成D-阿洛酮糖的影响

不同缓冲液及其pH值对融合蛋白AE3G催化活性的影响,实验结果如图7。由图7可知,AE3G催化D-葡萄糖生成D-阿洛酮糖的过程受不同缓冲液及其pH值影响较大,在乙酸钠缓冲液和磷酸钠缓冲液中AE3G的催化活性远低于在Tris-HCl缓冲液中的活性。在Tris-HCl缓冲液中,pH值为7.5时AE3G的催化活性最高;pH值大于7.5时,随着pH值的升高,AE3G的活性逐步降低。

图7 缓冲液及其pH值对AE3G相对活性的影响
Fig.7 Effect of different buffers and pH on relative activity of AE3G

2.2.4 细胞添加量对AE3G催化D-葡萄糖生成D-阿洛酮糖的影响

不同细胞添加量、不同反应时间对AE3G催化D-葡萄糖生成D-阿洛酮糖浓度的影响,实验结果如图8。由图8可知,当细胞质量浓度为10～75 g/L时,产生D-阿洛酮糖的浓度随细胞添加量的增加而增大。细胞质量浓度为75 g/L和100 g/L时,反应不同时间生成D-阿洛酮糖的浓度没有显著差异。

图8 重组细胞添加量和反应时间对D-葡萄糖转化生成D-阿洛酮糖的影响
Fig.8 Effect of recombinant cell addition and reaction time on production of D-allulose from D-glucose

由此可得,融合蛋白AE3G催化100 g/L D-葡萄糖生成D-阿洛酮糖较佳的反应条件:65 ℃、50 mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH值为7.5)、0.5 mmol/L Co2+和Mn2+,重组菌细胞添加量为75 g/L(湿质量)。

2.3 融合蛋白AE3G催化D-葡萄糖转化为D-阿洛酮糖的过程分析

将融合蛋白AE3G在优化的催化条件(65 ℃、50 mmol/L Tris-HCl缓冲液、pH值7.5、0.5 mmol/L Co2+和Mn2+、75 g/L湿细胞)下以100 g/L D-葡萄糖作为底物进行转化反应,底物、中间产物和终产物的时间过程曲线如图9。图9表明,各组分在前2 h内变化幅度较大,在4～8 h内各组分变化逐渐趋于平缓,在8～12 h时反应基本达到平衡。最终D-阿洛酮糖产量为17.2 g/L,D-葡萄糖到D-阿洛酮糖的转化率为17.2%,反应达到平衡时,D-葡萄糖、D-果糖和D-阿洛酮糖的浓度比为2.5∶2.3∶1.0。Zhao等[21]将GI与DAE以共表达方式催化D-葡萄糖生成D-阿洛酮糖,在最适催化条件下,D-葡萄糖到D-阿洛酮糖的最高转化率为13.6%,平衡时,D-葡萄糖、D-果糖和D-阿洛酮糖的浓度比为3.1∶3.2∶1.0; Li等[20]利用酿酒酵母固定化两种酶,D-葡萄糖到D-阿洛酮糖的最高转化率为12%;Men等[22]将GI与DAE分别插入pCDFDuet-1载体的不同表达位点之间,以大肠杆菌BL21(DE3)进行共表达,终转化率为16%。本研究中,D-葡萄糖到D-阿洛酮糖的转化率为17.2%,D-葡萄糖、D-果糖和D-阿洛酮糖的浓度比为2.5∶2.3∶1.0,均优于文献报道。

图9 AE3G催化D-葡萄糖生成D-阿洛酮糖的过程
Fig.9 Process of D-allulose production from D-glucose catalyzed by AE3G

果葡糖浆是一种常用于食品加工的D-葡萄糖和D-果糖混合液体,与结晶果糖相比具有明显的价格优势。本研究尝试了利用融合蛋白AE3G的E.coli重组表达菌株催化果葡糖浆生成D-阿洛酮糖的可行性。在65 ℃、50 mmol/L Tris-HCl(pH值为7.5)、0.5 mmol/L Co2+和Mn2+,细胞质量浓度为75 g/L的条件下,以体积分数为5%的F55果葡糖浆替代D-葡萄糖作为底物生产D-阿洛酮糖,过程曲线如图10。图10显示,催化体系初始的D-葡萄糖和D-果糖质量浓度为34.4 g/L和38.8 g/L。在反应前2 h内,D-阿洛酮糖和D-果糖含量迅速变化,有大量D-阿洛酮糖生成,D-葡萄糖小幅降低。反应进行到4 h时趋于稳定,最终在12 h时D-葡萄糖、D-果糖和D-阿洛酮糖的浓度比为2.5∶2.3∶1.0,这一比例与2.3中D-葡萄糖作为底物时的各组分平衡比例相同。以F55果葡糖浆为底物,在表达融合蛋白AE3G的重组菌株催化下,D-阿洛酮糖生成量为12.5 g/L,果葡糖浆到D-阿洛酮糖的转化率为17.1%,与以葡萄糖为底物时的转化率相近。

图10 AE3G催化F55果葡糖浆生成D-阿洛酮糖的过程
Fig.10 Process of D-allulose production from F55 HFCS catalyzed by AE3G

3 结 论

本研究将GI和DAE以不同顺序、刚性或柔性连接肽进行连接,构建了4种构型的融合蛋白(分别命名GE3A、GS3A、AE3G和AS3G),并以E.coli为宿主进行表达。研究发现,GI活性不受融合位置的影响,而DAE的活性受融合位置的影响,DAE融合在多肽C端时活性完全丧失,而融合在N端对DAE活性影响不大。以D-葡萄糖为底物时,融合蛋白AE3G和AS3G可将D-葡萄糖转化为D-阿洛酮糖,其中带有刚性连接肽的AE3G活性优于柔性连接肽的AS3G。

对融合蛋白的反应条件进行优化后,AE3G表达细胞能够将100 g/L D-葡萄糖转化为17.2 g/L的D-阿洛酮糖,平衡时D-葡萄糖、D-果糖、D-阿洛酮糖的浓度比为2.5∶2.3∶1.0。当以体积分数为5%的F55果葡糖浆为底物时,D-阿洛酮糖质量浓度达到12.5 g/L,各组分平衡比例与以葡萄糖为底物时的比例一致。本研究旨在为利用低价格原料生物法转化生产D-阿洛酮糖提供新思路。

参考文献：

[1] ZHANG W, CHEN D, CHEN J, et al. D-allulose, a versatile rare sugar: recent biotechnological advances and challenges[J]. Critical Reviews in Food Science and Nutrition,2023, 63(22): 5661-5679.

[2] JIANG S, XIAO W, ZHU X, et al. Review on D-allulose: in vivo metabolism, catalytic mechanism, engineering strain construction, bio-production technology[J]. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology, 2020, 8: 26.

[3] DANIEL H, HAUNER H, HORNEF M, et al. Allulose in human diet: the knowns and the unknowns[J]. British Journal of Nutrition, 2022, 128(2): 172-178.

[4] 黄月园,徐铮,徐虹. 生物法生产D-阿洛酮糖的研究进展[J]. 生物加工过程, 2021, 19(6): 581-588.
HUANG Y Y, XU Z, XU H. Research progress in biological production of D-allulose [J]. Chinese Journal of Bioprocess Engineering, 2021, 19(6): 581-588.

[5] HOSSAIN A, YAMAGUCHI F, MATSUO T, et al. Rare sugar D-allulose:potential role and therapeutic monitoring in maintaining obesity and type 2 diabetes mellitus[J]. Pharmacology &Therapeutics, 2015, 155: 49-59.

[6] YUMA T, TOKUDA M, NISHIMOTO N, et al. Allulose for the attenuation of postprandial blood glucose levels in healthy humans:a systematic review and meta-analysis[J]. PLoS One, 2023, 18(4): e0281150.

[7] PRATCHAYASAKUL W, JINAWONG K, PONGKAN W, et al. Not only metformin, but also D-allulose, alleviates metabolic disturbance and cognitive decline in prediabetic rats[J]. Nutritional Neuroscience, 2022, 25(6): 1115-1127.

[8] KANASAKI A, IIDA T, MURAO K, et al. D-allulose enhances uptake of HDL-cholesterol into rat’s primary hepatocyte via SR-B1[J]. Cytotechnology, 2020, 72: 295-301.

[9] O’CHAROEN S, HAYAKAWA S, OGAWA M, et al. Food properties of egg white protein modified by rare ketohexoses through Maillard reaction[J]. International Journal of Food Science and Technology, 2015, 50(1): 194-202.

[10] KIMURA T, KANASAKI A, HAYASHI N, et al.D-allulose enhances postprandial fat oxidation in healthy humans[J]. Nutrition, 2017, 43: 16-20.

[11] ILHAN E, POCAN P, OGAWA M, et al. Role of “D-allulose” in a starch based composite gel matrix[J]. Carbohydrate Polymers, 2020, 228: 115373.

[12] MU W, ZHANG W, FENG Y, et al. Recent advances on applications and biotechnological production of D-psicose[J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 2012, 94(6): 1461-1467.

[13] 熊小兰,李珍珍,栾庆民,等. D-阿洛酮糖功能特性、制备方法及产业化应用研究[J]. 精细与专用化学品, 2023, 31(1): 1-5.
XIONG X L, LI Z Z, LUAN Q M,et al. Study on the functional characteristics, preparation methods and industrialization application of D-allulose [J]. Fine and Specialty Chemicals, 2023, 31(1): 1-5.

[14] CHEN Z, GAO X, LI Z. Recent advances regarding the physiological functions and biosynthesis of D-allulose[J]. Frontiers in Microbiology, 2022, 13: 881037.

[15] HU M, LI M, JIANG B, et al.Bioproduction of D-allulose: properties, applications, purification, and future perspectives[J]. Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety, 2021, 20(6): 6012-6026.

[16] GRANSTRM T B, TAKATA G, TOKUDA M, et al. Izumoring:anovel and complete strategy for bioproduction of rare sugars[J]. Journal of Bioscience and Bioengineering, 2004, 97(2): 89-94.

[17] IZUMORI K, IZUMORI K. Izumoring: a strategy for bioproduction of all hexoses[J]. Journal of Biotechno-logy, 2006, 124(4): 717-722.

[18] NAM K H. Glucose isomerase: functions, structures, and applications[J]. Applied Sciences, 2022, 12(1): 428.

[19] MIYAMOTO R Y, DE MELO R R, DE MESQUITA SAMPAIO I L, et al. Paradigm shift in xylose isomerase usage: a novel scenario with distinct applications[J]. Critical Reviews in Biotechnology, 2022, 42(5): 693-712.

[20] LI Z, LI Y, DUAN S, et al. Bioconversion of D-glucose to D-psicose with immobilized D-xylose isomerase and D-psicose 3-epimerase on Saccharomyces cerevisiae spores[J]. Journal of Industrial Microbiology &Biotechnology, 2015, 42(8): 1117-28.

[21] ZHAO J, WEI H, CHEN J, et al. Efficient biosynthesis of D-allulose in Bacillus subtilis through D-psicose 3-epimerase translation modification[J]. International Journal of Biological Macromolecules, 2021, 187: 1-8.

[22] MEN Y, ZHU Y, ZENG Y, et al. Co-expression of D-glucose isomerase and D-psicose 3-epimerase: deve-lopment of an efficient one-step production of D-psicose[J]. Enzyme and Microbial Technology, 2014, 64: 1-5.

[23] WALFRIDSSON M, BAO X M, ANDERLUND M, et al. Ethanolic fermentation of xylose with Saccharomyces cerevisiae harboring the Thermus thermophilus xylA gene, which expresses an active xylose (glucose) isomerase[J]. Applied and Environmental Microbiology, 1996, 62(12): 4648-4651.

[24] JIA M, MU W, CHU F, et al. A D-psicose 3-epimerase with neutral pH optimum from Clostridium bolteae for D-psicose production: cloning, expression, purification, and characterization[J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 2014, 98: 717-725.

Study on Synthesis of D-Allulose from D-Glucose Catalyzed by Fusion Proteins

ZHANG Jiahe1, FENG Jingjie1, LIU Weiwei1, CHANG Chuting1, GUO Qingbin1,2, DING Wentao1,2,*, WANG Changlu1,2,*

(1.College of Food Science and Engineering, Tianjin University of Science and Technology, Tianjin 300457,China;2.State Key Laboratory of Food Nutrition and Safety, Tianjin University of Science and Technology, Tianjin 300457, China)

Abstract：D-allulose is a novel functional sugar substitute primarily produced from the high-cost substrate D-fructose, using D-allulose 3-epimerase to achieve the conversion. Identifying low-cost raw material alternatives to D-fructose for D-allulose production is crucial for its industrialization. In this study, glucose isomerase and D-allulose 3-epimerase were linked with either flexible or rigid peptide linkers in different sequential orientations, constructing four configurations of fusion proteins. The fusion protein configuration, exhibiting the best catalytic performance, was selected and optimized to catalyze D-allulose from the lower-cost substrate D-glucose. The results showed that fusion proteins AE3G and AS3G possessed both glucose isomerase and D-allulose 3-epimerase activities, converting D-glucose to D-fructose and D-allulose. AE3G, connected with a rigid peptide linker, demonstrated higher activity than AS3G, which connected with a flexible linker. The optimized catalytic conditions for AE3G were temperature of 65 ℃, Tris-HCl buffer of 50 mmol/L, pH of 7.5, Co2+ concentration of 0.5 mmol/L, Mn2+ concentration of 0.5 mmol/L, and wet cell concentration of 75 g/L. Under these conditions, using 100 g/L D-glucose or volume fraction 5% F55 high-fructose corn syrup as substrates, the fusion protein produced 17.2 g/L and 12.5 g/L D-allulose, respectively, with a mass ratio of D-glucose, D-fructose, and D-allulose in the reaction mixture of 2.5∶2.3∶1.0. This study aimed to verify the feasibility of using fusion proteins to catalyze the conversion of D-glucose to D-allulose, and the results indicated that the equilibrium concentration of D-allulose was higher than reported values, providing a theoretical basis for low-cost D-allulose production.

Keywords：fusion protein; glucose isomerase; D-allulose 3-epimerase; D-allulose; high-fructose corn syrup; D-glucose

doi：10.12301/spxb202300318

文章编号：2095-6002(2024)06-0113-08

引用格式：张家赫,冯敬杰,刘微微,等. 融合蛋白催化D-葡萄糖合成D-阿洛酮糖的研究[J]. 食品科学技术学报,2024,42(6):113-120.

ZHANG Jiahe,FENG Jingjie,LIU Weiwei, et al. Study on the synthesis of D-allulose from D-glucose gatalyzed by fusion proteins[J]. Journal of Food Science and Technology, 2024,42(6):113-120.

中图分类号：TS201.2

文献标志码：A

收稿日期：2023-05-25

基金项目：国家自然科学基金项目(31501041、32272277);中国博士后科学基金项目(2019M650450)。

Foundation： National Natural Science Foundation of China (31501041、32272277); China Postdoctoral Science Foundation (2019M650450).

第一作者：张家赫,男,硕士研究生,研究方向为发酵食品新资源开发。

*通信作者： 王昌禄,男,教授,博士生导师,主要从事发酵食品新资源开发方面的研究。

丁文涛,男,助理研究员,博士,主要从事食品生物技术和合成生物技术方面的研究。

(责任编辑：叶红波)