蓝鳍金枪鱼(Thunnus thynnus)主要分布于大西洋、太平洋、印度洋的温带及热带海域,富含优质蛋白质、维生素等多种对人体有益的物质,素有“金枪鱼之王”的美称[1]。金枪鱼肉的色泽是影响消费者购买欲望的一个主要因素,同样也是衡量其新鲜度的一个重要指标[2]。在低温贮藏过程中,蓝鳍金枪鱼肉色泽的变化与肌红蛋白(myoglobin, Mb)的含量密切相关[3]。一般来说,金枪鱼肉色发生褐变是由于其体内的氧合肌红蛋白(oxymyoglobin, OxyMb)被氧化成棕色的高铁肌红蛋白(metmyoglobin, MetMb)。Suman等[4]研究发现,脂肪氧化能使肌红蛋白的氧化速率加快,进而引发肉色褐变。同样,随着冷冻时间的增加,蓝鳍金枪鱼的MetMb含量增加,脂质氧化程度也有所升高,其肉色褐变明显。

植物多酚作为天然的抗氧化剂,由L-苯丙氨酸和L-酪氨酸通过莽草酸等途径产生,应用到食品中时能有效抑制有毒氧化物的产生并延长保质期[5]。植物多酚可以清除活性氧(reactive oxygen species, ROS)和活性氮(reactive nitrogen species, RNS)等物质,在体外具有很强的抗氧化活性[6]。没食子酸(gallic acid, GA)通常以单宁的形式存在于五倍子等植物中[7-8],具备抗炎、抗氧化等多种生物活性,在食品、医药等方面应用广泛,其抗氧化特性在食品加工方面受到广泛关注。在羟自由基氧化体系中,胡熠等[9]研究发现,添加1.5 g/L的没食子酸能有效抑制海鳗鱼肌原纤维蛋白氧化,改善肌原纤维蛋白的凝胶持水性和微观结构。目前,没食子酸对金枪鱼肉的抗氧化机制尚未见过系统的研究报道。

本研究采用没食子酸作为抗氧化剂,测定其对金枪鱼肌肉的品质特性、脂肪氧化及蛋白质氧化等的影响,分析低温贮藏条件下没食子酸对蓝鳍金枪鱼肉品质变化的影响;采用多光谱技术分析低温贮藏过程中金枪鱼肌红蛋白的变化情况,探究没食子酸对肌红蛋白结构及微环境的影响。本研究旨在探究没食子酸对金枪鱼肉品质的影响,并为探明其对肉色稳定性的保护机制提供理论支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

蓝鳍金枪鱼,山东蓝润集团有限公司,体质量为(50±5) kg、体长(110±10) cm,捕捞后进行快速低温冷冻(-60 ℃),并在加工厂将冷冻的金枪鱼分割成30 cm×15 cm×5 cm大小,全程冷冻运输到实验室置于-80 ℃冰箱备用,贮藏期为1个月。

没食子酸标准品(纯度97.7%),上海源叶生物科技有限公司;磷酸氢二钠、硫酸铜、乙酸乙酯、无水乙醇、氯化钠,均为分析纯,国药集团试剂有限公司;2,4-二硝基苯肼(DNPH)、乙二胺四乙酸(EDTA)、5,5′-二硫代双(2-硝基苯甲酸)、盐酸胍、甘氨酸,均为分析纯,上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.2 仪器与设备

CR-400型色彩色差计,日本Konica-Minol-ta公司;DK-8D型电热恒温水槽,上海一恒科技有限公司;FiveEasy Plus型pH计,上海梅特勒托利多有限公司;K9840型自动凯氏定氮仪,山东海能科学仪器有限公司;BiofugeStratos型台式高速冷冻离心机,美国Thermo公司;UV-2550型紫外可见分光光度计,苏州岛津仪器有限公司;90CRT型荧光分光光度计,上海精密科学仪器有限公司;JA4103型分析天平,上海舜宇恒平科学仪器有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 样品处理

实验前将冷冻的金枪鱼肉置于4 ℃冰箱中解冻,解冻完成后将其切成2 cm×2 cm×1 cm的块状,使用不同质量浓度(200、400 mg/kg)的没食子酸溶液涂抹金枪鱼肉样品,使没食子酸均匀覆盖在鱼肉表面,分别记为GA、GA2组。样品放入包装袋中置于4 ℃环境贮藏8 d,每2 d在相同时间点取样测定样品品质特性的变化情况。

1.3.2 没食子酸处理后金枪鱼肉色泽及pH值的测定

1.3.2.1 色差的测定

在室温下将色差仪进行黑白校正后,根据CIELab系统对金枪鱼肉进行亮度值(L*值)、红度值(a*值)和黄度值(b*值)测定。每个样品平行测量3次,用平均值来表示其肉色的变化。

1.3.2.2 pH值的测定

参考GB 5009.237—2016对样品的pH值进行测定[10]。将5 g切碎后的金枪鱼肉样品溶于50 mL去离子水中,并进行均质处理(10 000 r/min,15 s),然后在4 ℃、2 000 r/min条件下离心10 min,使用pH计测定上清液的pH值。测定3次,取平均值。

1.3.3 没食子酸处理后金枪鱼肉氧化特性及新鲜度的测定

1.3.3.1 肌红蛋白质量比及高铁肌红蛋白相对含量的测定

根据Thiansilakul等[11]的方法,测定金枪鱼中的Mb质量比。将2 g金枪鱼肉样品和20 mL磷酸钠缓冲液(40 mmol/L, pH=6.8)混合,并在10 000 r/min条件下使用均质机匀浆30 s,然后将匀浆液在4 ℃条件下离心15 min(10 000 r/min),并在525 nm测定上清液的吸光度(A525)。肌红蛋白质量比及高铁肌红蛋白相对含量计算见式(1)、式(2)。

w(Mb)=A525×7.6×16 000×10;

(1)

MetMb相对含量=-0.010A555-0.057A540+
0.150A500×100%。

(2)

式(1)、式(2)中,w(Mb),肌红蛋白质量比(以样品质量计),mg/kg;MetMb相对含量结果以%表示[12]。

1.3.3.2 硫代巴比妥酸反应物质含量的测定

根据Cai等[13]的方法测定硫代巴比妥酸反应物质(thiobarbituric acid reactive substance, TBARS)的含量(mg/kg,以MDA质量计)。将5 g金枪鱼肉样品与25 mL 0.05 g/mL三氯乙酸(trichloroacetic acid, TCA)溶液在10 000 r/min均质1 min,取等体积的上清液与0.02 mol/L硫代巴比妥酸(thiobarbituric acid, TBA)混合。将所得溶液在80 ℃条件下水浴20 min,冷却至室温后在532 nm处测定吸光度。

1.3.3.3 总挥发性盐基氮含量的测定

根据GB 5009.228—2016《食品安全国家标准 食品中挥发性盐基氮的测定》中的自动凯氏定氮法测定样品的总挥发性盐基氮(total volatile basic nitrogen, TVBN)含量[14]。

1.3.3.4 菌落总数的测定

根据GB 4789.2—2022《食品安全国家标准食品微生物学检验菌落总数测定》测定金枪鱼肉在低温贮藏条件下菌落总数的变化[15]。

1.3.4 没食子酸处理后金枪鱼肉水分变化的测定

1.3.4.1 水分状态分布的测定

采用低场核磁共振(low-field nuclear magnetic resonance, LF-NMR)对金枪鱼贮藏过程中的水分状态分布进行测定。将金枪鱼肉切成1 cm×1 cm×2 cm大小的鱼块并装入核磁管中,采用Carr-Purcell-Meiboom-Gill(CPMG)脉冲序列进行自旋-自旋弛豫时间T2的测定。

1.3.4.2 核磁共振成像分析

采用多自旋回波序列脉冲对金枪鱼肉进行磁共振成像(magnetic resonance imaging, MRI)分析。具体参数:视场FOV为100、采样重复实践TR为2 000 ms、重复扫描次数(NS)为4。

1.3.5 没食子酸处理后金枪鱼肌肉微观结构的观察

将金枪鱼肉样品切成边长1.5～2.0 cm的立方体,用固定液固定在冷冻切片托上后置于-80 ℃冰箱,冷冻30 min后用冷冻切片机将样品切成5～10 μm的薄片并固定在载玻片上,采用苏木精-伊红(hematoxylin-eosin,HE)试剂盒对肌肉组织染色,在光学显微镜下放大40倍观察。

1.3.6 没食子酸处理后金枪鱼肌红蛋白构象变化的测定

1.3.6.1 肌红蛋白的提取

肌红蛋白的提取参照郑娅等[16]的描述并稍加修改。取100 g经不同质量浓度的没食子酸处理后的金枪鱼肉样品,加入300 mL 10 mmol/L的Tris-HCl缓冲液(pH=8.2, 含EDTA)后均质1 min(10 000 r/min)。4 ℃冰箱静置1.5 h后,离心(8 000 r/min)10 min得滤液。在滤液中加入固体硫酸铵至盐析液饱和度为90%,于4 ℃静置30 min后得到肌红蛋白沉淀,用2倍体积的Tris-HCl缓冲液(10 mmol/L,pH=8.5)溶解,置于透析袋中,使用相同缓冲液在0～4 ℃条件下搅拌并透析24 h,期间缓冲液置换10次。将粗提得到的肌红蛋白样品冻干以备后续使用。

1.3.6.2 肌红蛋白二级结构的测定

采用拉曼光谱仪对样品的二级结构进行测定,取适量冻干后的肌红蛋白粉末置于载玻片中央,设置激发波长为532 nm,功率为120 mW,曝光时间为60 s,采用动波长扫描,扫描范围(m/z)为400～4 000 cm-1,使用Alix公式计算肌红蛋白的二级结构。

1.3.6.3 肌红蛋白三级结构的测定

内源荧光光谱的测定:将肌红蛋白溶液的质量浓度调整到0.4 mg/mL,激发波长为283 nm,激发和发射狭缝宽度均为5 nm,数据收集速率为1 200 nm/min,记录肌红蛋白溶液在290～450 nm的发射光谱。

同步荧光光谱的测定:将肌红蛋白溶液稀释至0.4 mg/mL,选择激发波长(λex)为280 nm,激发和发射狭缝宽度均设为5 nm,数据收集速率为1 200 nm/min的条件下测定Mb溶液的荧光强度,反应体系中激发波长和发射波长的间隔(Δλ)分别为15、60 nm,记录肌红蛋白在240～310 nm处的光谱数据。

三维荧光光谱的测定:在298 K条件下记录肌红蛋白与没食子酸复合物的三维荧光光谱。激发波长(λex)为200～340 nm,发射波长为270～550 nm,扫描速率为12 000 nm/min。

1.3.7 没食子酸与金枪鱼肉肌红蛋白相互作用机制的研究

采用Discovery Studio(DS)2017软件,将肌红蛋白的三维结构(PBD ID:1myt)进行优化处理,包括去除水分子、添加氢原子,并在CHARMm立场下对配体进行Minimization能量最小化处理,对接程序采用默认参数。通过LibDock完成肌红蛋白与没食子酸的分子对接,并确定其结合点。根据相互作用能量得到没食子酸与肌红蛋白的最佳对接位置,分析其相互作用机制。

1.4 数据处理

实验数据使用SPSS 19.0进行统计,采用ANOVA和Duncan进行检验分析,Origin 2023软件绘图。每个指标至少测定3次,且每个测试都是独立实验,结果用平均值±标准偏差来表示,显著水平为P<0.05。

2 结果与分析

2.1 没食子酸处理对金枪鱼肉色泽及pH值的影响

2.1.1 色泽的变化分析

鱼肉在贮藏过程中,受内在因素(肌肉pH值等)和外在因素(储存温度等)的影响,会发生明显的色泽变化[17],如红度值降低、白度和黄度略有增加。Ochiai等[18]也指出,对于蓝鳍或黄鳍金枪鱼肉,a*/b*比a*能更恰当反映鱼肉色泽变化。此外,新鲜和冷冻黄鳍金枪鱼片中MetMb的形成与a*/b*的相关系数也高于MetMb和a*,因此,本研究采用a*/b*来表征金枪鱼肉的红度值。图1为金枪鱼在低温贮藏过程中的红度值(a*/b*)和亮度L*的变化。由图1可知,在整个贮藏期内,经没食子酸处理的金枪鱼肉亮度逐渐升高,未处理组样品的亮度在贮藏过程中无显著变化,且低于其他处理组,其中高质量浓度(400 mg/kg)没食子酸处理的样品亮度值最高。a*/b*下降是由于金枪鱼肉中的氧合肌红蛋白被氧化成棕色的高铁肌红蛋白,从而导致金枪鱼肉色逐渐变深,红度值降低。图1中经不同质量浓度没食子酸处理的样品的红度值相比于空白对照组(CK)来说有所差异,2种质量浓度没食子酸处理组均显示出较高的红度值,说明没食子酸在鱼肉贮藏过程中可以较好地保持肉色。

2.1.2 pH值的变化分析

pH值的变化一定程度上可以反映鱼肉的新鲜度。根据相关文献可知,金枪鱼等红肉鱼死后pH值最低为5.0～6.0,在鱼肉变质过程中,内源性酶和微生物酶会促进蛋白质的降解,产生氨基酸、吲哚和氨等碱性物质,导致肌肉的pH值上升[19]。低温贮藏过程中蓝鳍金枪鱼肉pH值变化见图2。由图2可知,各组样品的pH值均呈现先下降后上升的趋势,整体维持在5.8～6.1。原因可能为金枪鱼属于洄游性红肉鱼类,肌肉中的糖原含量较高,宰杀后糖原发生酵解并产生乳酸,使pH值降低,在贮藏后期鱼肉中ATP酶的减少以及磷酸盐和含氮物质的生成导致pH值升高[20]。

2.2 没食子酸处理对金枪鱼肉氧化特性及新鲜度的影响

2.2.1 MetMb相对含量的变化分析

低温贮藏过程中蓝鳍金枪鱼氧化特性及新鲜度的测定结果见图3。MetMb相对含量是表征金枪鱼肉褐变程度的指标。由图3(a)可知,MetMb相对含量在低温贮藏条件下逐渐升高,说明在贮藏过程中OxyMb被氧化为MetMb。在贮藏2～8 d,对照组的MetMb相对含量最高(67.9%),且在第8天时显著高于没食子酸处理组(P<0.05),可能是由于酚羟基作用于自由基,与H+结合从而达到抗氧化的效果[21]。Cao等[22]研究了低含量及高含量没食子酸对猪肉肌原纤维蛋白的双重作用(抗氧化和促氧化),结果显示,对于羰基及TBARS含量来说,高浓度(0.15 mol/L)或低浓度(0.006 mol/L)没食子酸对蛋白质氧化及脂肪氧化无显著差异,这与本研究结果一致。

2.2.2 硫代巴比妥酸反应物质含量的变化分析

在肉类加工过程中,羟基自由基(·OH)已被认为是脂质氧化的一个主要引发者。随着贮藏天数的增加,各处理组的脂肪氧化程度增加,当样品暴露于·OH形成体系时,TBARS值升高[23]。由图3(b)可知,对照组的TBARS值迅速升高,且显著高于没食子酸处理组,原因可能是在脂肪氧化和微生物的作用下,金枪鱼肉的品质发生劣变;低温贮藏8 d时,金枪鱼表面已有变黏迹象,说明微生物已大量繁殖。没食子酸处理后能有效抑制金枪鱼的脂肪氧化,贮藏8 d时,对照组的TBARS值最高,为3.21 mg/kg;而高质量浓度(400 mg/kg)的没食子酸对脂肪氧化的抑制效果最好,TBARS值为0.19 mg/kg,其降低率高达94.1%,说明没食子酸对脂肪氧化具有明显的抑制效果。前期研究报道亦证实,富含酚类化合物的植物提取物能够抑制脂质氧化,例如,由迷迭香油、葡萄籽和松树皮提取物处理的熟牛肉中,脂肪氧化程度明显降低[24]。

2.2.3 总挥发性盐基氮含量的变化分析

水产品在贮藏过程中,由于细菌和酶的作用,蛋白质会分解产生氨及胺类等碱性物质[25],因此,TVBN含量是评价食品新鲜度的一个重要指标。GB 2733—2015《食品安全国家标准 鲜、冻动物性水产品》规定,可食用海水鱼的TVBN质量比不应超过30 mg/100 g。图3(c)显示了没食子酸对金枪鱼TVBN含量的影响。在贮藏初期,各处理组的TVBN质量比在20 mg/100 g左右,随着贮藏时间的延长,对照组增长较为迅速,这与TBARS值的趋势基本一致。从贮藏的第2天开始,对照组的TVBN质量比明显比没食子酸处理组高(P<0.05);贮藏第6天时,TVBN质量比超过可接受阈值(25 mg/100 g),说明微生物的生长速度加快,贮藏期间产生的挥发性氮类化合物增多。经不同质量浓度的没食子酸处理后的金枪鱼TVBN质量比显著低于对照组,贮藏8 d时,所有处理组都保持在可接受的阈值以下,说明没食子酸可以延长金枪鱼肉在低温贮藏下的保质期至8 d甚至更长。由图3(c)可知,低质量浓度(200 mg/kg)没食子酸处理组抑制氧化效果更明显。有研究表明,在贮藏期间没食子酸能抑制海鲈鱼TVBN含量的升高,延缓蛋白质发生降解,延长样品的贮藏期[26],这与本研究结果相似。

2.2.4 菌落总数的变化分析

菌落总数(total viable count, TVC)是反映食品腐败变质最直观的指标之一。一般来说,TVC低于4 lg(CFU/g)时表明鱼的食用质量良好,最高安全限量值为5 lg(CFU/g),当TVC达到7 lg(CFU/g)时,海水鱼不能食用[27]。由图3(d)可知,在第0天,未经处理和经没食子酸处理的样品的TVC在1.51～1.58 lg(CFU/g);贮藏6 d时,未处理组样品的TVC显著高于其他处理组,为7.55 lg(CFU/g),这可能是因为没食子酸具有酚羟基和疏水性的苯环,可与蛋白质中的氨基或羧基发生氢结合或疏水结合,可有效抑制细菌的增长[28]。

2.3 没食子酸处理对金枪鱼肉水分状态变化的影响

低温贮藏过程中金枪鱼肉水分状态变化见图4。弛豫时间T2可分为3部分,分别为T21(1～10 ms)、T22(40～60 ms)、T23(100 ms以上),分别反映结合水、不易流动水和自由水[29]。由图4(a)、图4(b)可知,在4 ℃条件下,第0天各组的水分分布状态无明显差别,但贮藏8 d后水分状态发生变化,2个处理组的T22峰变低,说明不易流动水逐渐变多;对照组的结合水含量有所降低,自由水相对含量增多。结合图4(c)、图4(d)发现,在0～8 d,各处理组的T22峰面积略有升高,但无明显变化。对照组的T21峰面积有所减少,而T23的峰面积显著增加,说明对照组结合水减少,自由水含量显著增加。水分分布状态的变化可能与鱼肉蛋白结构的变化及鱼肉组织结构的变化有关,贮藏后期蛋白质结构发生变化、肌肉组织变得不完整,导致鱼肉组织中不易流动水向自由水迁移,流动性更强。

水分加权成像是反映水分状态变化的主要方法之一。通常质子密度图像越亮(加权成像倾向于红色)的区域表征更多的氢质子聚集,区域中氢质子的数量与样品中该区域的水量成正比,图像的颜色从蓝色到红色表明水的结合程度增加[30]。由图4(e)可知,第0天时2个处理组的红色区域均分布较广,说明金枪鱼样品在新鲜状态时水分分布较均匀,大部分以结合水的形式存在。贮藏8 d后,样品的水分分布发生了明显的变化。对照组的结合水含量明显低于没食子酸处理组,这说明水分产生了迁移。另外,经低质量浓度(200 mg/kg)没食子酸处理的样品与高质量浓度处理组相比,红色氢质子密度更强,水分状态的保持效果更好,这与T2分布的变化类似。

2.4 没食子酸处理对金枪鱼肌肉微观结构的影响

低温贮藏过程中蓝鳍金枪鱼肌肉微观结构变化见图5。由图5可知,新鲜金枪鱼肉的肌纤维规则完整,肌纤维之间以及肌纤维与结缔组织之间排列紧密。在第0天,经高质量浓度(400 mg/kg)没食子酸处理的鱼肉组织间稍有分离。在4 ℃条件下,随着贮藏时间的延长,第8天时部分处理金枪鱼肉的肌纤维束收缩,间隙变大,肌纤维束产生不同程度的断裂,甚至出现明显的裂痕,从而导致鱼肉质地的软烂。经低质量浓度(200 mg/kg)没食子酸处理的样品在低温贮藏8 d后仍能保持较为完整的肌肉结构,肌纤维束基本保持完整的形态,与水分状态分布结果相呼应。

2.5 没食子酸处理对金枪鱼肉肌红蛋白构象的影响

2.5.1 肌红蛋白二级结构的变化分析

拉曼光谱是一种新兴且强大的光学技术,已被广泛用于识别分子结构以及蛋白质的定性和定量分析[31]。结合前面的品质指标数据看,由于低质量浓度没食子酸处理组具有更高的抗氧化性且能保持较为完整的肌肉结构,因此选择低质量浓度处理组进行研究。低质量浓度没食子酸处理后金枪鱼肌红蛋白二级结构的变化见图6。图6(a)为1 000～1 800 cm-1的拉曼光谱,拉曼带的频率和强度反映了蛋白质的二级结构(α-螺旋、β-折叠、β-转角、无规则卷曲)和蛋白质局部环境的变化。一般来说,酰胺I区(1 600～1 700 cm-1)中蛋白质二级结构的特征条带分别位于1 645～1 660 cm-1(α-螺旋),1 670～1 680 cm-1(β-折叠),1 640～1 645 cm-1、1 680～1 690 cm-1(β-转角),1 660～1 665 cm-1(无规则卷曲)处,酰胺I区范围内主要涉及肽基团的CO伸缩。由图6(b)可知,第0天时,α-螺旋比例最高,其次为β-折叠、β-转角和无规则卷曲,且低质量浓度没食子酸处理组与对照组相比无显著差异。经过8 d的贮藏,各组α-螺旋的比例显著下降(P<0.05),对照组的下降率为39.2%;低质量浓度没食子酸处理组的下降率为35.9%。各组β-折叠、β-转角、无规则卷曲含量也出现了不同程度地增加。α-螺旋的降低表明蛋白质分子展开程度增加,这可能是因为在贮藏过程中肌红蛋白的分子链展开,部分氢键因蛋白质变性而断裂,使α-螺旋逐渐向无规则卷曲转变。研究表明,与对照组相比,低质量浓度没食子酸能够较好地维持蛋白质的二级结构。

2.5.2 肌红蛋白三级结构的变化分析

低质量浓度没食子酸处理对蓝鳍金枪鱼肌红蛋白三级结构的影响见图7。

2.5.2.1 内源色氨酸荧光光谱分析

荧光光谱是研究蛋白质-配体复合物相互作用的有效手段,为了研究低质量浓度没食子酸对肌红蛋白构象的影响,测定了肌红蛋白内源荧光光谱。一般来说,蛋白质因酪氨酸(Tyr)、色氨酸(Trp)和苯丙氨酸(Phe)残基的芳香族基团的存在而具有内源性荧光,Tyr和Trp的荧光信号对微环境的变化更加敏感,可以根据该性质观察蛋白质的三级结构变化[32]。由图7(a)可知,在283 nm的激发波长下,肌红蛋白在334 nm处有一个强发射峰。第0天时,各组的荧光强度没有明显差异;金枪鱼样品贮藏8 d后,可以看出低质量浓度没食子酸的荧光强度明显高于对照组。说明多酚可以使肌红蛋白的荧光性质发生改变,猝灭其内源荧光,并形成复合物[33]。

2.5.2.2 同步荧光光谱分析

同步荧光光谱通常用于揭示小分子对蛋白质和氨基酸微环境的影响,其重复性高、灵敏度好,可以有效降低干扰,是研究蛋白质构象变化的常用方法[34]。当波长间隔(Δλ= λem-λex)设定在15 nm时,同步荧光主要反映酪氨酸残基的情况;当Δλ=60 nm时,主要反映色氨酸周围的光谱特征;当最大发射波长(λem)发生偏移时表示荧光分子周围的极性发生变化。由图7(b)、图7(c)可知,加入低质量浓度没食子酸后,Trp残基(Δλ= 60 nm)的荧光强度明显高于Tyr残基(Δλ=15 nm),这说明肌红蛋白自身的荧光主要来自Trp残基。第0天时,Trp残基和Tyr残基对应的最大发射波长λem没有发生明显变化,说明肌红蛋白Trp残基和Tyr残基周围的微环境变化不大。第8天时,经过低质量浓度没食子酸处理后,Tyr残基对应的最大吸收波长λem发生轻微的红移,表明Tyr残基周围的疏水性减弱;且低质量浓度处理组荧光强度高于对照组,说明肌红蛋白的内源荧光发生猝灭。

2.5.2.3 三维荧光光谱分析

三维荧光光谱能够同时观察蛋白质中酪氨酸和色氨酸残基周围的微环境的变化。由图7(d)～图7(g)可知,面积最大的峰为瑞利散射峰。通过比较图7(f)和图7(g),可以观察到低质量浓度没食子酸处理后的肌红蛋白荧光强度较低,说明肌红蛋白的内源荧光被猝灭,进一步验证了内源荧光光谱的结果。

2.6 没食子酸与金枪鱼肉肌红蛋白相互作用机制分析

本研究在LibDock协议的基础上模拟肌红蛋白与没食子酸之间的结合,二者结合的最低相互作用能为-521 618.68 J/mol,该条件下肌红蛋白-没食子酸复合物最稳定。图8为没食子酸与肌红蛋白的分子对接模拟分析结果。由图8(a)可知,肌红蛋白主要通过氢键与没食子酸相互作用。图8(b)为没食子酸与肌红蛋白对接的2D图,可以看出没食子酸与肌红蛋白上的赖氨酸(Lys)45、亮氨酸(Leu)42、脯氨酸(Pro)44、苯丙氨酸(Phe)43和异亮氨酸(Ile)99发生相互作用,这些氨基酸均是没食子酸与肌红蛋白之间可能的相互作用位点。肌红蛋白与没食子酸之间形成了氢键,包括与Leu 42的常规氢键和与Pro 44、His 42的碳氢键。此外,没食子酸和肌红蛋白的Phe 43和His 97之间还存在传统氢键和π-π堆积。

3 结 论

本研究探究了低温贮藏过程中没食子酸对蓝鳍金枪鱼肌肉品质变化的影响,并通过多光谱技术对肌红蛋白的构象变化进行了分析。结果表明,在4 ℃贮藏期间,经没食子酸处理后的样品表现出良好的品质特性,可有效延长冷藏金枪鱼的保质期2 d以上。与对照组相比,处理组红度值升高,脂肪氧化被明显抑制(MetMb相对含量、TBARS值降低),TVBN值和菌落总数也呈下降趋势。水分加权成像及微观结构观察结果也反映出没食子酸处理后的金枪鱼肉能更好地保持水分状态和肌肉的完整结构。拉曼光谱分析显示,对照组及没食子酸处理组的α-螺旋比例的下降率分别为39.2%和35.9%,说明没食子酸能够较好地稳定肌红蛋白的二级结构。本研究旨在为理解蛋白质与植物多酚的结合和相互作用模式,开发新型抗氧化剂以改善低温贮藏条件下蓝鳍金枪鱼肉品质提供一定的理论依据和新的思路。

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Effect of Gallic Acid on Muscle Quality and Myoglobin Conformation in Bluefin Tuna

BU Ying1,2, ZHOU Yang1, HAN Menglin1, ZHU Wenhui1,*, LI Xuepeng1, ZHANG Yi2, LI Jiangrong1,*

(1.College of Food Science and Technology/National &Local Joint Engineering Research Center of Storage, Processing and Safety Control Technology for Fresh Agricultural and Aquatic Products, Bohai University, Jinzhou 121013,China;2.College of Food Science, Fujian Agriculture and Forestry University/Engineering Research Centre of Fujian-Taiwan Special Marine Food Processing and Nutrition, Ministry of Education, Fuzhou 350002,China)

Abstract：In order to study the effects of gallic acid (GA) on muscle quality and myoglobin conformation of bluefin tuna during refrigerated storage (4 ℃), different concentrations of GA (200 mg/kg and 400 mg/kg) were used to treat bluefin tuna and analyzed the changes in its quality characteristics. The effects of GA on the structure and microenvironment of myoglobin were further investigated by multispectral technique. The binding sites of the two proteins were determined by molecular docking. Results showed that during storage at 4 ℃, the quality characteristics of tuna meat exhibited varying degrees of deterioration, including a noticeable browning effect and a decrease in redness value. Compared with GA treatment group, lipid oxidation, metmyoglobin relative content, total volatile basic nitrogen and the total number of colonies in control group showed a significant upward trend. Additionally, there was a decrease in bound water content and an observed migration of water. Furthermore, varying degrees of muscle fiber bundle disruption were also noted. In conclusion, low concentration (200 mg/kg) of GA could effectively alleviate the deterioration of quality of bluefin tuna. By multispectral analysis, low concentration of GA could stabilize the secondary structure of myoglobin well and had fluorescence quenching effect on myoglobin. Molecular docking results showed that myoglobin formed hydrogen bonds with GA through Leu 42, Pro 44 and His 42. This experiment provided basis and strategy for improving the quality of thawed bluefin tuna.

Keywords：bluefin tuna; gallic acid; myoglobin; color; stabilization mechanism

doi：10.12301/spxb202300335

文章编号：2095-6002(2024)06-0079-12

引用格式：步营,周洋,韩梦琳,等.没食子酸对蓝鳍金枪鱼肌肉品质及肌红蛋白构象的影响[J]. 食品科学技术学报,2024,42(6):79-90.

BU Ying, ZHOU Yang, HAN Menglin, et al. Effect of gallic acid on muscle quality and myoglobin conformation in bluefin tuna[J]. Journal of Food Science and Technology, 2024,42(6):79-90.

中图分类号：TS254.4

文献标志码：A

收稿日期：2023-06-03

基金项目：辽宁省教育厅项目(LJKMZ20221486)。

Foundation： Liaoning Provincial Department of Education Project (LJKMZ20221486).

第一作者：步 营,男,副教授,主要从事水产品加工及贮藏方面的研究。

*通信作者：朱文慧,女,副教授,博士,主要从事水产品加工及贮藏方面的研究;

励建荣,男,教授,博士,主要从事水产品、果蔬加工及贮藏方面的研究。

(责任编辑：张逸群)