乳清蛋白(whey protein,WP)是牛乳乳清的主要成分之一。乳清蛋白的营养价值十分丰富,可为人类提供优质的氨基酸,且易于被机体消化吸收,是营养最全面的天然蛋白质之一[1]。此外,乳清蛋白因其出色的营养和功能特性而被广泛应用于食品工业中[2]。然而,乳清蛋白中α-乳白蛋白(α-lactalbumin,ALA)和β-乳球蛋白(β-lactoglobulin,BLG)是牛乳中主要的过敏原,也是造成婴幼儿过敏的主要原因[3],因此如何有效降低乳清蛋白致敏性,同时保证其营养风味是当下研究关注的焦点[4]。酶解是降低蛋白致敏性的一种有效手段,具有较高的效率、温和的反应条件、广泛的蛋白酶来源、反应过程易控制等特点[5],是乳制品加工的理想方式。酶解可以通过蛋白酶的催化作用,达到降低蛋白抗原性的效果,降低蛋白类食品过敏的发生率,将大分子蛋白质转变成小肽,提高蛋白消化、吸收效率[6-8]。

多种蛋白酶已被应用于低致敏水解配方产品的开发,如动物源的胃蛋白酶,胰蛋白酶,胰凝乳蛋白酶和胰酶,植物来源的木瓜蛋白酶,菠萝蛋白酶和微生物来源的碱性蛋白酶,中性蛋白酶,风味蛋白酶等[4]。碱性蛋白酶相比于其他酶解乳蛋白的常用蛋白酶,在降低致敏性方面具有显著的优势。这是因为碱性蛋白酶的酶切位点在疏水性氨基酸的羧基上,而乳清中疏水性氨基酸很多,从而碱性蛋白酶能够大量破坏结合表位[9-10]。然而,当前研究对碱性蛋白酶的乳清酶解产物的抗原性、感官特性及消化吸收性能的系统评估仍不充分,且缺乏与市售低致敏配方产品的多维对比。本研究通过使用碱性蛋白酶酶解浓缩乳清蛋白(whey protein concentrate,WPC)制备低致敏水解乳清粉,以酶解过后乳清蛋白水解度、分子质量分布、抗原性、消化吸收性能、风味等为主要考察指标,将本研究酶解获得的低致敏水解乳清粉与市售深度水解乳清蛋白原料、市售部分水解乳清蛋白原料进行比较,并对不同酶解产物进行感官评价,以期为制备低致敏乳清蛋白产品提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

浓缩乳清蛋白(whey protein concentrate,WPC),澳优乳业(中国)有限公司;碱性蛋白酶(200 U/mg),上海源叶生物公司;辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)标记羊抗兔免疫球蛋白G(immunoglobulin G,IgG)、生物素标记羊抗人免疫球蛋白E(immunoglobulin E,IgE),美国Sigma公司;ECL超敏发光液,北京索莱宝科技有限公司;Western封闭液、一抗稀释液、二抗稀释液,碧云天生物技术公司;兔抗乳清蛋白血清为实验室自制;HRP-亲和素、3,3′,5,5′-四甲基联苯胺(3,3′,5,5′-tetramethylbenzidine,TMB):欣博盛生物科技有限公司;其他常用生化试剂均为分析纯。

10周龄的雌性Balb/c小鼠,江西科瑞斯生物科技有限公司。动物实验伦理编号为RYE2022060501。

1.2 仪器与设备

连续搅拌玻璃反应釜,郑州长城工贸有限公司;ImageQuant LAS500型一体化成像仪,美国GE Healthcare公司;迷你型蛋白电泳仪,美国Bio-RAD 公司;RP-C18液相色谱柱, 美国Column Technology公司; Zorbax 300SB-C18 peptide traps色谱柱,美国Agilent Technologies公司;Q Exactive质谱仪、多功能酶标仪,美国Thermo Fisher Scientific公司;SA402B型电子舌,日本INSENT公司;Vortex Genius 3型涡旋振荡器,德国IKA公司;Ussing Chamber型灌流系统,美国Physiologic Instruments公司;超纯水系统,德国Millipore公司。

1.3 实验方法

1.3.1 低致敏水解乳清粉的制备

采用磷酸盐缓冲液(phosphate buffer solution,PBS)配制100 g/L乳清溶液,调节至碱性蛋白酶最适pH值。加热溶液使温度稳定至50 ℃,加入7.16 g/L碱性蛋白酶,持续搅拌水解5.6 h。水解完成后,加热至100 ℃保持20 min,灭活体系内的蛋白酶。结束后,迅速冷却溶液,将酶解产物进行喷雾干燥,获得低致敏水解乳清粉样品,并装袋密封保存。

1.3.2 乳清粉分子量分布的测定

采用三(羟甲基)甲基甘氨酸-十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(tricine-sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,Tricine-SDS-PAGE)对低致敏水解乳清粉和2类市售水解乳清粉分子量分布进行鉴定。将不同样品配置成蛋白质量浓度为2.5 mg/mL的溶液;参考何圣发[11]的方法,制备小分子凝胶质量分数分别为16.5%致密胶、10%夹层胶和4%浓缩胶,每孔上样量为15 μL,设定电泳程序在恒压30 V运行1 h,在100 V运行3 h。电泳结束后,凝胶分别用固定液和考马斯亮蓝染液固定15 min、染色15 min,之后进行脱色处理,直至条带清晰为止;用凝胶成像系统对凝胶进行扫描成像。

1.3.3 蛋白质抗原性的测定

使用免疫印迹法测定蛋白质抗原性残留。1)电转。将1.3.2节制备的凝胶,置于1×转运缓冲液(48 mmol/L Tris,39 mmol/L 甘氨酸,体积分数为20%的甲醇水溶液)当中浸泡5 min,将凝胶、聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride,PVDF)、滤纸、海绵垫构建成“三明治”结构,置于蛋白电泳仪中,电转25 min(恒压100 V,400 mA)。2)封阻。取出PVDF膜转入玻璃皿,使用Western封闭液室温下封阻30 min。3)一抗孵育。用Western一抗稀释液稀释兔抗乳清蛋白血清(1∶5 000),4 ℃孵育过夜12 h,使用TBS-T(50 mmol/L Tris-HCl,pH为7.5,150 mmol/L NaCl,0.1% Tween-20)清洗PVDF膜15 min。4)二抗孵育。用Western二抗稀释液稀释HRP标记的羊抗兔IgG(1∶5 000),室温摇床孵育1 h。使用TBS-T清洗PVDF膜3次。5)染色。ECL的A、B液等体积混合,滴加到膜上,使膜全部浸润,荧光成像。

1.3.4 水解度的测定

参考谭斌等[12]的方法,采用的邻苯二甲醛(o-phthalaldehyde,OPA)法测定经体外酶解蛋白质的水解度,并针对乳清蛋白的特性进行修改和调整。首先,利用L-丝氨酸标准溶液(0.1 mg/mL)于λ=340 nm处测定吸光度(OD340 nm),依此绘制标准曲线。再取3 mL制备的OPA溶液与400 μL 0.1 mg/mL酶解乳清蛋白溶液混匀5 s,避光反应2 min,立即放入酶标仪于λ=340 nm处测定吸光度(OD340 nm),做3次平行。以溶液浓度(mmol/L)为横坐标,OD340 nm为纵坐标制作标准曲线。水解度按式(1)至式(3)计算。

(1)

(2)

水解度

(3)

式(1)至式(3)中,W为水解过程中每克蛋白被断裂肽键数,mmol/g;c为样品中所含L-丝氨酸当量,mmol/L,由标准曲线求得;V为样品体积,L;n为样品稀释倍数;m为样品质量,g;ω为样品中蛋白质质量分数,%;h为修正后的水解过程中每克蛋白被断裂肽键数,mmol/g;htot为每克纯蛋白中肽键数,8.2 mmol/g;α、β均为修正因子,分别为1.039和0.383。

1.3.5 残留肽段的测定

样品预先经10 kDa超滤管超滤脱盐备用。以流动相A(体积分数为0.1%甲酸的水溶液)、B(体积分数为0.1%甲酸、84%乙腈的水溶液)对样品进行洗脱。进样前,以体积分数95%的A液对RP-C18液相色谱柱(0.15 mm×150 mm)进行平衡。样品用自动上样器注入Zorbax 300SB-C18 peptide traps色谱柱进行多肽富集,再经过RP-C18液相色谱柱进行多肽分离。洗脱条件:在0～50 min,采用体积分数4%～50% B液进行梯度洗脱;在50 min～54 min,用50%～100% B液进行梯度洗脱;在54～60 min,采用100% B液进行洗脱。用质谱仪对经毛细管高效液相色谱分离后的酶解产物进行分析,利用正离子检测,将多肽和多肽的碎片的质量电荷比进行全扫描后采集10个碎片图谱,检测时长为60 min。质谱测试原始文件用软件MaxQuant 1.5.5.1检索相应的数据库,以得到蛋白质鉴定及定量分析的结果。

1.3.6 乳清粉IgE和IgG特异性结合能力的测定

采用间接竞争ELISA对4种不同样品进行IgE、IgG结合能力的评估,具体步骤参考袁水林等[13]的方法,并略作修改。将10位牛乳过敏患者的血清等体积混合构建血清池,进行IgE结合能力的检测,10位牛乳过敏患者的相关信息见表1,均签署知情同意书。

血清特异性IgE水平在0.7～3.5 IU/mL,临床意义为对此过敏原有轻度过敏[14]。

测定步骤如下。1)抗原包被。取96孔酶标板,分别包被2.5 μg/mL的α-乳白蛋白、β-乳球蛋白(100 μL/孔),4 ℃过夜;2)封阻。加入3%的明胶进行封阻;3)板外竞争。取一块新的酶标板以同样的方式封阻后,加入60 μL的竞争蛋白和等体积牛乳过敏患者血清池(1∶50稀释)。同时用PBS代替一抗作为空白对照,37 ℃孵育1 h。竞争蛋白的浓度梯度设定为0.1、0.316、1.0、3.16、10 μg/mL;4)二抗孵育。加入1∶5 000稀释的生物素标记的羊抗人IgE,100 μL/孔,37 ℃下孵育1 h;5)亲和素反应。加入1∶60稀释HRP标记的链霉亲和素100 μL/孔,37 ℃反应1 h;6)显色反应。加入100 μL的TMB显色液置于37 ℃恒温培养箱避光孵育15 min,加入50 μL的2 mol/L的浓硫酸终止反应;7)测定。多功能读数仪设定波长为450 nm,测定OD值。

特异性IgG结合能力测定采用兔血清(1∶160 000稀释)为一抗,二抗为HRP标记的羊抗兔IgG二抗(1∶5 000稀释),其余步骤同上。根据OD450 nm,绘制不同样品的竞争抑制性曲线,计算出IC50,用于表征IgG结合能力的变化。抑制率按式(4)计算。

抑制率

(4)

式(4)中,B0为无竞争抗原时的OD450 nm;B为有竞争抗原时对应的OD450 nm。

1.3.7 肠道转运率的测定

采用尤斯灌流系统测定不同样品在小鼠结肠的累积透过量、吸收速率常数和表观渗透系数,参考Aguanno等[15]的方法,并略作修改。

小鼠禁食12 h,自由饮水,脊椎脱臼处死,沿腹中线打开腹腔,取小鼠结肠。生理盐水清洗后,迅速置于Krebs-Ringer溶液(Krebs-Ringer溶液配方为摩尔浓度为118 mmol/L的NaCl,4.7 mmol/L的KCl,2.5 mmol/L的CaCl2,1.2 mmol/L的MgCl2,25 mmol/L的NaHCO3,1.2 mmol/L的KH2PO4,11 mmol/L的葡萄糖的水溶液,pH值为7.4)中冰浴5 min,分别剪取3～4 cm长的肠段部,迅速剥离并去除浆膜侧的浆膜层,将肠黏膜固定在扩散室中。在Ussing室左右两室加入5 mL Krebs-Ringer溶液,待设备数据稳定后加入样品,黏膜侧为给样侧,吸出1 mL Krebs-Ringer溶液,再加入1 mL样品溶液(均为5 mg/mL),使两侧的静水压平衡。Ussing室的两边均通入混合气体(体积分数95% O2、5% CO2),并以水浴维持37 ℃恒温。分别在0、30、60、90 min时,取出20 μL接收液,测定蛋白浓度Cn。根据式(5)～(8)计算药物累积透过量(Q)、吸收速率常数(Ka)和表观渗透系数(Papp)[16-17]。

(5)

(6)

(7)

(8)

式(5)～(8)中,Q为单位小肠面积的累积透过量,μg·cm-2;Cn为第n个取样时间点的蛋白质量浓度(μg·mL-1);常数5和0.02分别为Ussing室中样品体积和取样体积,mL;A为扩散池有效透过面积,0.3 cm2;Ka为吸收速率常数,μg·s-1·cm-2;L为斜率;dQ/dt表示稳态时时间-累积透过量线性回归所得的斜率;C0为加入样品侧初始蛋白质量浓度,μg·mL-1。

1.3.8 感官评价

利用电子舌对样品进行风味分析。将2.236 5 g KCl、0.045 g L-酒石酸用蒸馏水定容至1 L,作为基准溶液,其各项风味指标设定为0。分别称取1.5 g样品于离心管中,加入30 mL蒸馏水于离心管中,振荡混匀15 min,然后于离心机离心5 min,转速为4 000 g,取上清定容至100 mL,用于电子舌分析。同时,研究招募了16名志愿者组成感官评价小组,对不同样品进行感官评价。

2 结果与分析

2.1 Tricine-SDS-PAGE小分子凝胶电泳分析

乳清粉原样、低致敏水解乳清粉、市售部分水解乳清粉及市售深度水解乳清粉的SDS-PAGE电泳谱见图1。图1中4号泳道为乳清粉原样,在15 k～20 kDa和10 k～15 kDa出现的2条深色较宽条带分别为牛乳主要过敏原β-乳球蛋白和α-乳白蛋白。1、2、3号泳道分别为3种水解乳清样品,其中1号和3号为市售水解乳清产品,2为研究制备的低致敏水解乳清粉。由泳道1、2、3中可以看出,3种不同的水解乳清产品中的2种主要的过敏原蛋白均被不同程度的水解,其中1、2泳道无蛋白残留,表明低致敏水解乳清粉和市售深度水解样品中的主要致敏原蛋白被深度破坏。而泳道3在5 kDa以上不同分子量之间均仍可见蛋白残留,表明市售部分水解乳清粉的过敏原蛋白脱除不彻底,仍存在较高的致敏风险。结果与Morisawa等[18]结果相似,他们认为β-乳球蛋白和α-乳白蛋白对酶有一定的抵抗作用,关键致敏原在短时间内难以被完全破坏,因此市售部分水解乳清粉依旧存在各类蛋白残余的情况。

2.2 免疫印迹分析

不同水解乳清粉免疫印迹结果见图2。由图2可以看到泳道4乳清蛋白粉原样主要在15 k～20 kDa出现深色印迹,说明样品与特异性抗体发生特异性结合,存在较高致敏性。低致敏水解乳清粉在15 k～20 kDa的条带相较泳道3(市售部分水解乳清粉)、泳道4(乳清粉原样)更窄、颜色更浅,说明特异性结合较少,致敏性较低。对比Tricine-SDS-PAGE结果发现,泳道2于40 kDa处出现较浅的条带,而在凝胶电泳中未呈现该高分子条带,验证了WB的高灵敏性。高分子量条带可能由低分子量致敏肽聚合而成。Stanic等[19]在研究消化乳清蛋白的过程中同样发现,水解产物中出现了高分子量的聚合物,他们认为水解酶的结构能够在一定程度上交联蛋白质,部分肽段聚集形成新形态的致敏性表位,该理论与WB实验结果相符。

2.3 水解乳清粉水解度分析

水解度是直观评估蛋白质水解程度的重要指标之一,其意义为水解过程中蛋白质内肽键的断裂程度[20-21]。各水解乳清粉的水解度测定结果见图3。由图3可知,市售深度水解乳清粉的水解度为55.63%±2.99%,其相对于市售部分水解乳清粉以及低致敏水解乳清粉的水解度存在极显著差异(P<0.01),而低致敏水解乳清粉与市售部分水解乳清粉的水解度差异性较小,且市售部分水解乳清粉的水解度更高,其原因可能在于市售水解乳清粉产品在进行深度水解以及部分水解过程中,只是追求乳清蛋白更多的变成肽段和游离氨基酸[22],而非仅仅破坏致敏性表位,因此水解度较高;而碱性蛋白酶的酶切位点较特异,酶解程度更轻,更多地破坏了各类致敏性表位,而保留大部分肽键,因此水解程度更低。

2.4 氨基酸肽段组分的分析

利用液相-质谱联用对低致敏水解乳清粉中小分子肽段进行进一步的鉴定,获得残存肽段序列后分别与牛乳α-乳白蛋白、β-乳球蛋白的线性模拟表位序列进行对比,以包含或者长于表位序列判断为残留表位,表位残留结果见表2和表3[23]。结果发现,市售深度水解乳清粉与低致敏水解乳清粉在α-乳白蛋白各类型表位均被酶解,而市售部分水解乳清粉依旧残留有部分IgE以及IgG表位,说明本产品低致敏水解乳清粉在水解过程中能够高效地将α-乳白蛋白关键表位破坏达到与深度水解相近的成效。

对比低致敏水解乳清粉与市售部分水解乳清粉发现,碱性蛋白酶酶解能够有效消减β-乳球蛋白的部分关键致敏表位,尤其在IgG表位消除方面尤为显著,如AA85-96、AA95-109。但是可能由于β-乳球蛋白于Trp19-Arg124附近的外表面、β-桶型结构形成表面疏水袋[24],酶切位点难以完全覆盖,因此依旧残留部分致敏性表位。有研究发现,部分水解乳清粉相较于完全水解乳清粉其中β-乳球蛋白的表位残基含量差异甚至可以达到几个数量级的差异[25]。AA17-33这个表位在所有蛋白酶解产物中一致存在,这说明β-乳球蛋白能够在酶解体系下保持一定的稳定性,同时表明碱性蛋白酶的酶切位点难以将这个表位肽段切割破坏,但由于其肽段较短、分子量较低,因此在Tricine-SDS-PAGE与WB实验中难以发现。

2.5 乳清粉IgE和IgG特异性结合分析

牛乳过敏患者血清被广泛应用于牛乳过敏原蛋白表位定位、致敏性评估等相关研究中。牛乳过敏患者血清中含有针对牛乳过敏原的特异性IgE,能够更真实地反映牛乳蛋白的致敏性高低[7, 26-27]。筛选10名牛乳过敏患者的血清对不同的样品蛋白进行IgE和IgG(兔血清)的结合能力的评估,结果见图4。在间接竞争ELISA实验中,常用IC50值(半抑制浓度)来表征抗原抗体结合能力的强弱,当IC50值越大,说明达到半抑制率所需要的竞争抗原的浓度越大,竞争抗原与抗体的结合能力越弱[28]。

对图4的结果进行非线性回归,得到不同蛋白的IC50值,见表4。由图4可知,低致敏水解乳清粉α-乳白蛋白、β-乳球蛋白的特异性IgG和IgE结合的IC50值均在设定范围内未取到,表明样品的潜在致敏性极低。不同水解乳清粉的IC50值见表4。由表4的结果可知,低致敏水解乳清粉的IC50值均大于市售部分水解乳清粉的IC50值,说明低致敏水解乳清粉与抗体结合能力相较市售部分水解乳清粉的结合能力更弱,且低致敏水解乳清粉的IC50值为乳清粉原样IC50值的22～138倍,与乳清粉原样相比,低致敏水解乳清粉与IgE/IgG的结合能力均显著下降。相比于其他酶解乳蛋白的常用蛋白酶,如胰蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶等,碱性蛋白酶在降低致敏性方面具有显著的优势。沈小琴等[9]研究了 7种生物酶水解乳清蛋白,发现碱性蛋白酶酶解乳清后,抗原性降低最大,这是因为碱性蛋白酶的酶切位点在疏水性氨基酸的羧基上,而乳清中疏水性氨基酸很多,从而碱性蛋白酶能够大量破坏结合表位。熊鼎[10]对比了碱性蛋白酶、风味蛋白酶、复合蛋白酶、木瓜蛋白酶4种酶用于酶解乳清蛋白,研究表明采用碱性蛋白酶解过后的乳清蛋白的致敏性降低最显著。

2.6 转运率的测定结果

应用Ussing Chamber技术能够较好地模拟胃肠生理环境,其常用于肠吸收、转运机制及保护肠道屏障功能机制等方面的研究[29]。当肠黏膜保持良好的活性,才能维持膜的完整性[30],这样得到的成分渗透性数据才能可信,在实际研究中,监测电压电流计算得到阻抗,可以快速评估组织质量的好坏。

本研究选用小鼠结肠进行不同样品的膜渗透性研究,不同样品在小鼠结肠的吸收速率常数(Ka)见表5,不同乳清粉样品在小鼠结肠的累计透过量见图5。由表5可知4种样品的吸收速率常数Ka由大到小依次为市售深度水解乳清粉、低致敏水解乳清粉、市售部分水解乳清粉、乳清粉原样。

不同样品在小鼠结肠的表观渗透系数(Papp)见表6。由表6可知,不同样品在小鼠结肠的表观渗透系数Papp范围在28.31×10-6～52.51×10-6 cm·s-1,表观渗透系数由大到小依次为市售深度水解乳清粉、低致敏水解乳清粉、市售部分水解乳清粉、乳清粉原样。

参考关于药物吸收难易的判定标准[31]可知,Papp<1.0×10-6 cm·s-1为吸收不良,吸收率一般在 0%～20%;Papp在1.0×10-6～10×10-6 cm·s-1为吸收中等,吸收率在20%～70%;Papp >10×10-6 cm·s-1为吸收良好,吸收率在70%～100%。本研究4种样品Papp均大于10×10-6 cm·s-1,说明吸收效果良好。

2.7 样品感官及风味分析结果

分别对乳清粉原样、市售深度水解乳清粉、低致敏水解乳清粉、市售部分水解乳清粉进行外观评价,结果见图6。由图6可知,市售部分水解乳清粉与乳清粉原样的颗粒较粗,而市售深度乳清粉与低致敏水解乳清粉颗粒较细腻;水样对比发现,市售深度水解乳清粉最为澄澈,低致敏水解乳清粉能够保持一定淡黄色,市售部分水解乳清粉最浑浊。这可能是由于水解程度的不同而直接导致颗粒大小的显著差异,造成的感官差异明显。

蛋白酶水解乳清蛋白成为小分子肽或氨基酸, 会产生一些苦味肽的成分, 对于消费者来说, 控制乳清蛋白酶解产物的苦味情况非常重要[32]。利用电子舌对4种样品的苦味、酸味、涩味等8种风味进行分析,结果见图7。由图7可知,在苦味上低致敏乳清粉、市售部分水解乳清粉及乳清粉原样苦味明显低于市售深度水解乳清粉的苦味。16人的感官评定小组对4种样品的苦味等3种风味进行验证,结果见图8。

由图8可知,乳清粉原样、低致敏水解乳清粉及2种市售水解乳粉原料均存在苦味,其中市售深度水解乳清粉具有最强的苦味,这一结果与电子舌的苦味分析相一致。而感官评价小组对低致敏乳清粉的苦味评分较高,这与电子舌的苦味分析存在一定差异。分析其中原因可能为在酶解过程中,酶解产物会产生不同风味的寡聚肽或氨基酸并且会产生少量盐和脂肪,这可能会对电子舌传感器产生影响[33]。乳清蛋白在酶解体系中降解,使其疏水性氨基酸位于肽段两端,当接触到味蕾细胞时,人可以通过神经传递可以感知到苦味[34],而电子舌苦味电极可能在复杂的混合体系下受到干扰,而造成结果与感官小组存在差异。

3 结 论

研究采用碱性蛋白酶酶解制备低致敏水解乳清粉,并将之与市售部分水解乳清粉、市售深度水解乳清粉比较。通过牛乳过敏患者血清评估样品致敏性,结果显示低致敏水解乳清粉的致敏性相比于乳清粉原样显著降低,与市售深度水解乳清粉大致相当,远低于市售部分水解乳清粉,证明低致敏水解乳清粉脱敏效果良好。质谱分析残留表位发现,低致敏水解乳清粉中的α-乳白蛋白各表位均被酶解,而β-乳球蛋白仍有数个表位残基未被破坏,其中AA17-33存在于所有水解乳清粉样品中。通过电子舌及感官评价小组对苦味值等的鉴定表明低致敏水解乳清粉样品风味较市售深度水解乳清粉样品得到了改善。但苦味仍旧存在,可在后续产品中通过复配得到优化。经过蛋白酶水解、喷雾干燥形成低致敏水解乳清粉,可作为水解配方奶粉的重要原料,具有较好的应用潜力。关于低致敏水解乳清粉的残留表位肽AA17-33的理化特性、风味优化研究仍有待进一步探索。

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Preparation and Allergenicity Assessment of Hypoallergenic Hydrolyzed Whey Powder

TAN Hongkai1,2, QIU Yu1,2, CHEN Siyi1,2, XIONG Ziyi1,2, PAN Lina3, ZHANG Min3, GAO Yu3, PENG Xiaoyu3, LI Xin1,2,4,*, CHEN Hongbing1,4,5
(1.State Key Laboratory of Food Science and Technology, Nanchang University, Nanchang 330047, China;2.School of Food Science and Technology, Nanchang University, Nanchang 330047, China;3.Ausnutria Dairy (China) Co. Ltd., Changsha 410127, China; 4.Jiangxi Provincial Key Laboratory of Food Allergy, Nanchang University, Nanchang 330047, China;5.Sino-German Joint Research Institute, Nanchang University, Nanchang 330047, China)

Abstract：Whey protein, the main allergen of bovine milk, was treated by alkaline protease enzymatic hydrolysis process to explore the changes of its allergenicity, and compared with two types of commercially available hypoallergenic whey powders. Bovine whey protein was spray dried after enzymatic hydrolysis, and the allergenicity of the enzymatic hydrolysate and its residual epitope information were evaluated by enzyme linked immunosorbent assay and liquid chromatography tandem mass spectrometry. The intestinal transport rate, molecular weight distribution, hydrolysis degree, sensory characteristics and other indexes were evaluated by Ussing Chamber system, gel electrophoresis, electronic tongue and other methods. The results showed that the molecular weight of hypoallergenic hydrolyzed whey powder was significantly reduced after treatment by alkaline protease enzymatic hydrolysis process. Mass spectrometry analysis of residual epitopes showed that all epitopes of α-lactalbumin in hypoallergenic hydrolyzed whey powder were enzymatically hydrolyzed, while several epitope residues of β-lactoglobulin were still undamaged, among which AA17-33 existed in different degrees of hydrolyzed whey powder samples. According to the serum pool detection of patients with milk allergy, the allergenicity of hypoallergenic hydrolyzed whey powder was lower than that of commercially available partially hydrolyzed whey powder under similar degree of hydrolysis. The results of Ussing Chamber showed that the intestinal transport rate of hypoallergenic hydrolyzed whey powder was good, similar to that of commercially available extensively hydrolyzed whey powder, while the bitterness was weaker and more palatable than that of commercially available extensively hydrolyzed whey powder. In summary, the treatment of whey protein by alkaline protease enzymatic hydrolysis process could significantly reduce the allergenicity of the product, enhance product had good transport and absorption capacity, and reduce the bitter taste, which had good application potential and development prospects.

Keywords：whey powder; whey protein; hydrolysis process; epitope residue; assessment of allergenicity

中图分类号：TS252.4

文献标志码：A

doi：10.12301/spxb202201095

文章编号：2095-6002(2024)05-0168-11

引用格式：谭宏凯, 邱毓, 陈思懿, 等. 低致敏水解乳清粉的制备及其致敏性评估[J]. 食品科学技术学报,2024,42(5):168-178.
TAN Hongkai, QIU Yu, CHEN Siyi, et al. Preparation and allergenicity assessment of hypoallergenic hydrolyzed whey powder[J]. Journal of Food Science and Technology, 2024,42(5):168-178.

收稿日期：2022-12-07

基金项目：广东省重点领域研发计划项目(2022B0202030002); 国家自然科学基金面上项目(32072241); 湖南省科协科技人才托举工程(2022TJ-XH-047)。

Foundation： Guangdong Provincial Key Areas R&D Program (2022B0202030002); National Natural Science Foundation of China (32072241); Science and Technology Talent Lifting Project of Hunan Association for Science and Technology (2022TJ-XH-047).

第一作者：谭宏凯,男,硕士研究生,研究方向为食品生物技术。

*通信作者：李 欣,女,教授,博士,博士生导师,主要从事食品免疫学方面的研究。

(责任编辑：李 宁)