天麻(Gastrodia elata Bl.)是一种具有保护中枢神经系统和心血管系统、改善记忆等多种生理功能的植物块茎[1],2019年被纳入药食同源目录。据中国菌物学会天麻产业分会不完全统计,2020年我国天麻干品产量逾30 000 t,产值近50亿元。天麻在我国有三大主产地:云、贵、川、陕地区,长江流域的重庆、湖北、安徽等地,东北、西藏、甘肃等地[2]。重庆作为比较重要的天麻产区,位处不同海拔的多个区县均有大量天麻种植地,然而不同地区的栽培土壤和气候环境对天麻生长影响较大,容易导致天麻质量参差不齐,并且无法简单通过感官来判断天麻质量的好坏。乌天麻、红天麻和乌红杂交天麻是目前种植和售卖较多的天麻品种,其中乌红杂交天麻产量比乌天麻和红天麻高,生长周期比乌天麻短,具有广阔的发展前景。此前,人们对于天麻品质的判定大多是靠闻或是仅仅测定天麻素的含量,判断指标较单一。因此,建立科学的评价方法和统一的评价标准对天麻原料的筛选和实现优质优价具有重要指导意义。

本研究拟通过分析重庆不同产地乌红杂交鲜天麻的营养成分、活性成分、重金属指标以及挥发性成分,建立天麻HPLC指纹图谱,并对其进行综合质量评价,旨在为天麻质量标准制订及质量控制提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

乌红杂交鲜天麻样品采集于2021年10—12月,产地来源信息见表1。将鲜天麻洗净打浆,-20 ℃保存备用。

天麻素、对羟基苯甲醇、巴利森苷A、巴利森苷B、巴利森苷C、巴利森苷E,纯度均大于98.0%,上海源叶生物技术有限公司;Bradford蛋白浓度测定试剂盒,碧云天生物技术有限公司;纤维素(CLL)含量测试盒,苏州梦犀生物医药科技有限公司。

1.2 仪器与设备

L-8800型全自动氨基酸分析仪,日本日立公司;100 μm PDMS型固相微萃取装置,美国Supleco公司;GCMS-2010型气相色谱质谱联用仪,LC-20型高效液相色谱仪,日本岛津公司;NexION 1000G型电感耦合等离子质谱仪,美国PerkinElmer公司。

1.3 实验方法

1.3.1 水分、总灰分和浸出物含量测定

水分和总灰分的测定分别参考GB 5009.3—2016 《食品安全国家标准 食品中水分的测定》[3](第一法)和GB 5009.4—2016 《食品安全国家标准 食品中灰分的测定》[4](第一法)。

浸出物含量测定[5]：称取约2.000 g样品置250 mL锥形瓶中,加体积分数50%乙醇50 mL,密塞,称重,静置1 h后,连接回流冷流管,加热至沸腾,并保持微沸1 h。冷却后,取下锥形瓶,密塞,再称重,用体积分数50%乙醇补足损失的质量,摇匀后过滤。精密量取滤液10 mL,置于干燥至恒重的蒸发皿中,在水浴锅上蒸干后,于80 ℃干燥5 h,置干燥器中冷却 30 min,迅速精密称重。

1.3.2 淀粉、水溶性蛋白、粗纤维含量测定

淀粉含量测定参考GB 5009.9—2016《食品安全国家标准 食品中淀粉的测定》[6]中第二法酸水解法;水溶性蛋白、粗纤维素使用测试盒测定。

1.3.3 多糖含量测定

采用苯酚-硫酸法,参考雷有成[7]和张庚等[8]的方法并稍加修改。

称取约5.000 g样品,加入150 mL纯水,62 ℃恒温水浴3 h,提取2次,合并上清液并浓缩至20 mL,加入20 mL的Sevage试液(氯仿与正丁醇体积比为3∶1)混合均匀去除蛋白质,再次浓缩至10 mL,加入30 mL的体积分数95%乙醇溶液,静置于4 ℃冰箱10 h,6 500 r/min离心8 min,用热水将沉淀物溶解,并定容至25 mL容量瓶中,冷却至室温,得待测溶液。

1.3.4 活性成分含量测定

1)样品溶液制备。参考蒋然[9]的方法并稍加修改。称取天麻样品约2.000 g,加入体积分数50%乙醇溶液50 mL,称重,进行30 min超声处理 (240 W,40 kHz),冷却至室温,再称重,用稀乙醇补足超声损失的重量,量取续滤液10 mL,浓缩至近干,加体积分数3%的乙腈溶液溶解至25 mL容量瓶中,得待测溶液。

2)色谱条件。色谱柱:ThermoFisher-C18(4.6 mm×250 mm,5 μm);流动相:乙腈-体积分数0.1%磷酸水溶液(体积比为3∶97);流速:0.8 mL/min;检测波长:220 nm;柱温:30 ℃;进样量:20 μL。洗脱程序:洗脱时间共48 min,乙腈体积分数由3%逐渐升至95%,0.1%磷酸溶液体积分数由97%逐渐降至5%。

3)活性成分测定。使用HPLC测定活性成分。

1.3.5 有机酸含量测定

1)样品制备。参照华丰[10]方法并稍加修改。

称取约5.000 g样品,加入30 mL纯水均质,超声30 min,定容至50 mL过滤,向滤液中加入各1 mL体积分数30%硫酸锌溶液和体积分数10.6%亚铁氰化钾溶液,涡旋震荡后静置30 min,取上清液经0.22 μm滤头过滤。

2)色谱条件。色谱柱:Thermo Fisher-C18(4.6 mm×250 mm,5 μm);流动相:甲醇-0.01 mol/L磷酸二氢钾水溶液(体积比为3∶97),用磷酸调pH值至2.8;流速:0.8 mL/min;进样量:20 μL;柱温:30 ℃;检测波长:210 nm。

3)有机酸含量测定。使用HPLC测定有机酸含量。

1.3.6 游离氨基酸含量测定

参考赵敏等[11]的方法并稍加修改。称取约1.000 g样品,向样品中加入9 mL体积分数4%的磺基水杨酸溶液,涡旋振荡,6 500 r/min离心8 min,取上清液经0.22 μm滤头过滤。

1.3.7 重金属含量测定

参考GB 5009.268—2016《食品安全国家标准 食品中多元素的测定》[12]中的第一法。

1.3.8 挥发性成分测定

参考赵敏等[11]的方法并稍加修改。

萃取方法:准确称取5.000 g样品置于20 mL顶空进样瓶中,加入2-辛醇(10 μL 300 mg/L),加盖密封。将装有100 μm聚二甲基硅氧烷萃取头的手动进样器插入瓶中,80 ℃顶空吸附40 min。吸附完成后,迅速拔出手动进样器放置于气相色谱仪进样口(250 ℃),推出萃取头解析5 min后进行数据采集。

GC条件:DB-5MS毛细管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm); 40 ℃保持3 min,以10 ℃/min升温到100 ℃,保持2 min;再以3 ℃/min升温到160 ℃,保持5 min;最后以10 ℃/min升温到250 ℃;不分流进样;高纯氮气流速为1 mL/min。

MS条件:离子源温度250 ℃;电子能量70 eV;接口温度250 ℃;四极杆质量分析器;质量扫描范围m/z为40～400。

通过NIST17 Library谱库检索所得挥发性成分(匹配度>80%);再利用内标对各挥发性成分进行定量分析。

1.3.9 香气活力值分析

采用香气活力值(odor activity value,OAV)对天麻挥发性成分的主体风味贡献进行表征。OAV计算见式(1)。

(1)

式(1)中,Ci为挥发性成分的质量比,μg/kg;Ti为挥发性成分的阈值,μg/kg。

1.4 数据处理

实验结果表示为3次独立重复实验的平均值±标准偏差。所有数据均使用SPSS Statistic 25.0进行数据的线性回归分析,HPLC指纹图谱采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)绘制,图片采用Origin 2018、SMICA 14.0软件绘制。

2 结果与分析

2.1 天麻营养成分分析

5批重庆不同地区天麻的营养成分含量分析结果见表2。由表2可知,5批天麻水分质量分数为76.77%～88.29%,样品间差异显著(P<0.05);总灰分和浸出物的质量分数分别为2.54%～3.50%和15.60%～22.86%,均符合相关标准中总灰分不得超过4.5%,浸出物不少于15%的规定[5];淀粉质量分数为15.13%～29.22%,其中G1样品的淀粉质量分数最高;粗蛋白质量分数为0.93%～1.59%,与德江、昭通等地区天麻相比,粗蛋白整体含量均偏低[13-14];粗纤维质量分数为17.79%～36.48%。近年来,许多研究报道天麻多糖有较强的生物活性,具有降血脂降血压[15]、抗肿瘤[16]、抗病毒[17]、免疫调节[18]等功效。5批天麻的多糖质量分数为31.50%～40.53%,普遍高于贵州、四川、云南、吉林等地区的天麻[19-21]。G2、G4样品位于高海拔地区(1 500 m以上),其浸出物、粗纤维、多糖含量普遍高于其余3组低海拔地区的天麻,说明高海拔地区天麻品质更好。

2.2 天麻活性成分分析

2.2.1 活性成分含量分析

5批重庆不同地区天麻的活性成分见表3。由表3可知,G2天麻中天麻素和对羟基苯甲醇总质量比最高,为(5.92±0.67) mg/g;G5天麻活性成分总质量比最高,为(20.59±1.59 )mg/g。天麻素和柠檬酸通过缩合反应可以生成巴利森苷类化合物,这类化合物具有热不稳定性,在受热过程中,酯键容易断裂,导致巴利森苷类化合物和天麻素相互转化[22]。研究结果也进一步验证了袁胜浩等[23]的结论,新鲜天麻中的天麻素含量极低。

2.2.2 基于活性成分的天麻指纹图谱建立

2.2.2.1 样品色谱峰及共有峰分析

选取G1作为参照谱,使用中位数法,设定时间窗宽度为0.1,采用多点校正,全谱峰匹配等技术,得到5批天麻指纹图谱共有峰模式及对照谱R(图1)。经匹配后标定了15个共有峰,与对照品HPLC结果比对后,指认出6个峰,分别为1号峰天麻素、2号峰对羟基苯甲醇、3号峰巴利森苷E、4号峰巴利森苷B、5号峰巴利森苷C、6号峰巴利森苷A。

2.2.2.2 相似度评价

以对照谱为参考,对5批天麻的指纹图谱进行相似度分析。结果显示,5批天麻样品的相似度为0.967～0.997,差异较小,说明生成的天麻对照指纹图谱能够代表所采集的5批重庆天麻样品的共同特征,适合建立同一指纹图谱。

2.2.3 基于活性成分的天麻判别模型建立

2.2.3.1 主成分分析结果

以6个活性成分含量为变量进行主成分分析(PCA),结果见图2。由图2可知,5批样品可大致分为两大类,分布在左右两侧,第一主成分提取的天麻素、对羟基苯甲醇、巴利森苷A、巴利森苷B、巴利森苷E对样品G1、G2、G3的分类具有影响较大,并且样品G2在化学成分评价上具有明显优势,整体质量较优;而巴利森苷C对样品G5的分类具有较大影响。

2.2.3.2 正交偏最小二乘判别分析结果

为更好地观察组间差异,在主成分分析的基础上进行了两组间的正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA),结果见图3。模型中累计解释能力参数(R2)和预测能力参数(Q2)分别为0.947、0.888,均接近于1,表明该模型比较稳定且预测能力良好。由图3可知,5批天麻分为两大类。以变量重要性投影(VIP)大于1为标准,得到2个差异化学成分,分别为对羟基苯甲醇和天麻素,表明这2个成分可用作区别5批天麻的主要指标。

2.2.3.3 聚类分析结果

采用Ward法进行聚类分析,结果见图4。由图4可知,当欧氏距离为1时,5批天麻被聚类为两大类。第一类为G1、G2、G3,第二类为G4、G5,第一类天麻的天麻素和对羟基苯甲醇总含量高于第二类。该结果验证了PCA和OPLS-DA分析结果。

2.3 天麻有机酸分析

重庆不同地区天麻的有机酸含量见表4。由表4可知,5批天麻中位于高海拔地区的G2、G4天麻有机酸总质量比更高,其中G2天麻的有机酸总质量比最高,为(563.89±24.64) mg/kg。同种天麻有机酸间含量的差异主要体现在乙酸和柠檬酸上。G1天麻有机酸中柠檬酸质量比最高,占有机酸总质量比的42.34%;乙酸在G2、G3、G4、G5天麻有机酸中质量比最高,分别占有机酸总质量比的54.69%、41.78%、37.44%、46.70%。苹果酸和琥珀酸在5批天麻有机酸中的质量比均较低。有机酸作为中间或最终产物参与植物新陈代谢和分解代谢的各种基本途径。柠檬酸、苹果酸、琥珀酸和草酸等在三羧酸循环中发挥关键作用[24]。苹果酸参与光合作用,是C4循环的底物[25],但天麻属真菌异养型植物,无根无绿色叶片,不能进行光合作用[26],所以这可能是天麻中苹果酸含量低的原因。

2.4 天麻游离氨基酸分析

重庆不同地区天麻游离氨基酸含量见表5。由表5可知,从5批天麻中共检出16种氨基酸,天麻氨基酸成分中甜味氨基酸和鲜味氨基酸含量较为丰富,表明天麻独特风味比较明显。样品中9.77%～18.66%的氨基酸为人体必需氨基酸。尽管维持机体氮平衡所必需的药用氨基酸在植物中含量较少[27],但5批天麻中药用氨基酸含量占总氨基酸含量的63.05%～76.79%,均显示出较高水平,其中具有提鲜、护肝等功效的谷氨酸[28]含量最高,占总氨基酸的20.05%～32.42%。所有样品中G3、G1、G2氨基酸含量最高,其次是G4、G5。

2.5 天麻重金属分析

采用电感耦合等离子体质谱(inductively coupled plasma-mass spectrometry, ICP-MS)对5批重庆天麻进行重金属检测,结果见表6。现行WM2-2001《药用植物及制剂进出口绿色行业标准》[29]规定:w(Pb)≤5.0 mg/kg,w(Cd)≤0.3 mg/kg,w(Hg)≤0.2 mg/kg,w(As)≤2.0 mg/kg。由表6可知,G1、G2、G3、G4均符合标准要求,G5中Cd含量超出标准规定,可能是因为该采样地更靠近经济发展中心,城镇化和工业化进程不断加快,导致耕地受到严重污染,而天麻块茎与土壤接触时间长、相对接触面积大更容易蓄积重金属,并且研究发现,Cd是最容易形成生态风险的重金属元素[30]。Cr属于人体必需微量元素,以三价形式存在于天然食品中,对人体健康有突出作用,所以食用天麻也能补充一定的Cr。

2.6 天麻挥发性成分分析

2.6.1 种类及含量分析

采用GC-MS对5批天麻进行挥发性成分检测,结果见图5。由图5(a)可知,5批天麻共检出67种挥发性化合物,其中,G1检测出45种挥发性化合物,G2天麻检测出32种,G3天麻检测出46种,G4天麻检测出39种,G5天麻检测出40种,共有成分18种。挥发性化合物按属性分为醛类、酯类、酮类、酸类、醇类、酚类、萜类、烷烃类等。酯类物质检出最多,有23种;其次是醛类物质,检出15种,酯类和醛类物质种类占总挥发性化合物种类的56.72%。

醛类物质主要源于脂肪氧化降解,5批天麻中醛类物质含量在已知物质含量中占比最大,高达40.34%～70.77%[图5(b)]。己醛具有生油脂和青草气味,庚醛呈强烈和不愉快脂肪气味,(E)-2-辛烯醛、壬醛、(2E,4E)-2,4-癸二烯醛和月桂醛具有强烈的脂肪气息,对天麻总体风味组成有重要贡献。酯类物质主要带来水果香,虽然在天麻挥发性化合物中含量不是特别高,但对5批天麻气味差异起到了不可忽略的作用。酮类和醇类物质具有花香和木质香气,给天麻带来一种独特的清香气味。

2.6.2 香气活力值分析

为进一步确认天麻的关键挥发性风味化合物,采用OAV法表征天麻各香气化合物对主体香气成分的贡献,结果见表7[31]。当OAV大于1时,可以认为该挥发性物质对样品的整体风味具有贡献作用。近年来,也有研究表明OAV大于0.1的香气物质可作为潜在呈味物质[32]。5批天麻中共检出20种OAV大于0.1的挥发性化合物。醛类物质几乎在所有天麻中都检测出,其中5批天麻都含有(E)-2-壬烯醛且OAV较大,具有生腥味;大马士酮在G1、G4、G5天麻中检测出,OAV在天麻中相对较大,给天麻带来芳香气味。因此,天麻主要呈现出生腥味、脂肪味、芳香和木质香气。

3 结 论

5批重庆乌红杂交鲜天麻的总灰分和浸出物含量均符合相关标准规定。和其他地区天麻相比[19-21],所采5批重庆天麻多糖含量较高,并且位于高海拔地区天麻的浸出物、多糖、粗纤维素、有机酸含量普遍高于低海拔地区天麻。随着海拔高度变化,温度和湿度的垂直变化明显,导致植物的生长环境发生变化从而影响植物的产量及物质构成。重庆位于三峡库区,地形特殊,更不能忽略海拔对植物分布及生长发育的重要影响。本研究建立了重庆乌红杂交天麻的HPLC指纹图谱,相似度在0.967～0.997,表明5批重庆天麻整体差异较小,但就营养成分和活性成分来看,G2天麻为较优天麻。5批天麻中G2的天麻素和对羟基苯甲醇总质量比最高,为(5.92±0.67) mg/g。从所有样品中共检测到16种氨基酸,其中药用氨基酸含量较高,占总氨基酸含量的63.05%～76.79%,且甜味和鲜味氨基酸含量较丰富。5批天麻重金属蓄积较少,但G5天麻中Cd含量超出标准规定,可能是由于种植土壤受到污染;土壤对天麻种植有至关重要的作用,即使位于同一区县,不同种植环境也对天麻的质量影响很大。5批天麻共检出67种挥发性化合物,其中有20种化合物(OAV>0.1)对天麻气味组成具有贡献作用,醛类物质是构成天麻风味的主要成分。G2天麻在所采样品中综合质量较优,可作为评估参照。本研究旨在为重庆乌红杂交鲜天麻质量控制及质量评价提供数据支持。

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Study on Quality Evaluation of Hybrid Fresh Gastrodia elata

DUAN Guiyuan1,2, ZHANG Man3, TANG Xinjing1,2, YAN Yuge1,2, YAO Hong1,2, KAN Jianquan1,2, LIU Xiong1, DU Muying1,2,*
(1. College of Food Sciences, Southwest University, Chongqing 400715, China;2. Chinese-Hungarian Cooperative Research Centre for Food Science/Chongqing Key Laboratory of Speciality Food Co-Built by Sichuan and Chongqing, Chongqing 400715, China;3. Sichuan National Inspection and Testing Co. Ltd., Luzhou 646000, China)

Abstract：To conduct a comprehensive quality evaluation of Chongqing hybrid fresh Gastrodia elata, 5 batches of fresh Gastrodia elata (G1-G5) from different origins in Chongqing were collected as the research objects. The differences in nutritional components, active ingredients, heavy metal content, and volatile substances of hybrid fresh Gastrodia elata were compared and analyzed, and pattern recognition research was conducted by combining principal component analysis, orthogonal partial least squares discriminant analysis, and cluster analysis. As a result, the HPLC fingerprints of 5 batches of Chongqing Gastrodia elata were established, with similarities ranging from 0.967 to 0.997, indicating that the differences between different batches of Gastrodia elata were relatively small. The total content of gastrodin and p-hydroxybenzyl alcohol in G2 Gastrodia elata was the highest, at (5.92±0.67) mg/g. A total of 16 amino acids were detected from all samples, of which 9.77%-18.66% were essential amino acids. The content of medicinal amino acids was relatively higher in the range of (5 703.77±240.89)-(7 889.03±145.37) mg/kg, accounting for 63.05%-76.79% of the total amino acid content. Except for G5 Gastrodia elata, the heavy metal content of the other batches of Gastrodia elata complied with relevant industry standards. A total of 67 volatile compounds were detected in 5 batches of Gastrodia elata. Through odor activity value (OAV) analysis, 20 compounds with OAV greater than 0.1 were identified, of which 5 batches of Gastrodia elata all contained (E)-2-nonenal and had high OAV. This study aimed to provide a reference for the overall quality evaluation of Chongqing hybrid fresh Gastrodia elata, and to provide theoretical support for the further development and utilization of Gastrodia elata resources.

Keywords：fresh Gastrodia elata; medicine and food homology; quality evaluation; volatile substances; active ingredients

中图分类号：TS201

文献标志码：A

doi：10.12301/spxb202200919

文章编号：2095-6002(2024)05-0157-11

引用格式：段桂媛,张曼,唐鑫静,等.乌红杂交鲜天麻质量评价研究[J]. 食品科学技术学报,2024,42(5):157-167.
DUAN Guiyuan, ZHANG Man, TANG Xinjing, et al. Study on quality evaluation of hybrid fresh Gastrodia elata[J]. Journal of Food Science and Technology, 2024,42(5):157-167.

收稿日期：2022-10-02

基金项目：重庆市科技兴林基金资助项目(2021-5)。

Foundation： Science and Technology for Forestry Revitalization Fund of Chongqing(2021-5).

第一作者：段桂媛,女,硕士研究生,研究方向为食品微生物发酵。

*通信作者：杜木英,女,教授,博士,主要从事食品微生物发酵方面的研究。

(责任编辑：张逸群)