生物活性肽是蛋白质水解后产生的由2～20个氨基酸组成的小分子活性片段[1],具有增强免疫、抗氧化、降血压等生理功能。但是,活性肽在胃肠道中的吸收转运能力相对较弱,并且由于胃内的酸性环境以及消化酶的存在,活性肽在胃肠道中容易失活[2]。建立合适的活性肽递送系统能够提高其在储存和通过胃肠道期间的稳定性,从而在人体所需位置释放出来,有效发挥其功能活性。目前,常用的递送载体包括脂质体、纳米乳化系统、微胶囊以及凝胶等[3],其中脂质体近年来在食品、药品研究和应用领域有了较多应用。

脂质体是由磷脂分子及其类似物组成的双分子层囊泡结构,其核心部分包含水相[4]。脂质体的主要成分是磷脂、胆固醇等脂类物质,天然存在于细胞膜中,无免疫抑制作用,毒性较小,具有一定的生物相容性和生物可降解性。脂质体结构具有两亲性,既可以携带水溶性物质,将其包封在内水相中,又可以携带脂溶性物质,将其整合到脂质双分子层结构内部[5]。作为活性物质递送系统,脂质体不仅可以保护被包埋物质的有效功能成分,提高其稳定性[6],还可以赋予活性物质特定的靶向功能[7]。目前,脂质体已经成功应用于生物活性肽等活性物质的包埋递送,表现出较大的发展潜力。例如:彭诗雨等[8]以大豆卵磷脂与胆固醇为原料,通过薄膜分散水合法制备了包载泥鳅活性四肽AHLL(Ala-His-Leu-Leu)的脂质体,该脂质体在4 ℃下具有较好的贮藏稳定性,在胃肠液中可以有效保护AHLL的生理活性且具有良好的AHLL缓释效果;Hanachi等[9]将分子质量为1 kDa以下的三文鱼多肽包埋进脂质体中,发现其具有良好的血管紧张素转换酶抑制活性。然而,目前关于海洋贝类活性成分及其递送系统的研究较少。

青蛤是我国沿海常见的经济贝类,其蛋白质和不饱和脂肪酸含量较高,具有很高的营养价值。本团队前期通过胃蛋白酶对青蛤肉进行酶解,经分离纯化得到青蛤免疫活性肽(Cyclina sinensis peptides, SCSP)(Arg-Val-Ala-Pro-Glu-Glu-His-Pro-Val-Glu-Gly-Arg-Tyr-Leu-Val,RVAPEEHPVEGRYLV)[11]。研究发现,SCSP可以诱导巨噬细胞活化,发挥免疫增强作用,修复小鼠肝肾损伤[11-12]。然而,SCSP作为生物活性肽,存在稳定性弱、活性易丧失等问题,因此需要寻找合适的递送系统,以提高SCSP的稳定性,更好地发挥其生物活性。本研究拟利用蛋黄卵磷脂和胆固醇为膜材料制备包埋SCSP的脂质体(SCSP-LIP),以包封率、粒径分布为主要指标,优化SCSP-LIP的制备方法;通过粒径分布、Zeta电位、包封率等指标,并采用红外光谱、形态学考察以及不同温度下的贮藏稳定性对SCSP-LIP进行分析;考察SCSP-LIP的免疫活性及细胞摄取效果。本研究旨在制备一种粒径小、包封率高、稳定性好的脂质体运载体系,为进一步开发海洋功能性免疫调节食品提供理论和技术参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

青蛤,舟山市老碶菜场;胆固醇,上海麦克林生化科技有限公司;蛋黄卵磷脂,北京索莱宝科技有限公司;细胞膜绿色荧光探针(DiO)、DAPI染色液、抗荧光淬灭封片液、脂多糖(LPS)、CCK-8细胞毒性试剂盒、中性红试剂盒,上海碧云天生物技术有限公司;RAW 264.7巨噬细胞、DMEM培养基(高糖)、胎牛血清,武汉普诺赛生命科技有限公司;BCA蛋白定量试剂盒,北京全式金生物技术股份有限公司。实验所用化学试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

N-1100型旋转蒸发仪,上海爱朗仪器有限公司;SHZ-D(Ⅲ)型循环水式多用真空泵,上海锦赋实验仪器设备有限公司;VC505型细胞破碎仪,苏州瑞诺德生物科技有限公司;CF16RN型高速冷冻离心机,日立(中国)有限公司;SpectraMax型酶标仪,美国Bio-Rad公司;ZS90型激光纳米粒度仪,英国马尔文仪器有限公司;JEM2100F型透射电子显微镜,日本电子Jeol公司;Tenaor Ⅱ型红外光谱仪,德国Bruker公司;CO2培养箱,赛默飞世尔科技公司;CKX41型荧光显微镜,日本Olympus公司;ALPHA 1-4/LD plus型冷冻干燥机,德国Christ公司。

1.3 实验方法

1.3.1 SCSP的制备

参照Li等[10]的方法进行SCSP的制备。将青蛤去壳取肉,匀浆后使用异丙醇脱脂,并用胃蛋白酶处理脱脂后的青蛤肉。将得到的酶解液经超滤截留、纳滤除盐、DEAE阴离子交换色谱、葡聚糖凝胶 G-25色谱柱以及反相高效液相色谱分离纯化得到SCSP。

1.3.2 SCSP含量的测定

采用二辛可宁酸(bicinchoninic acid, BCA)法进行多肽含量的测定。精密称取6 mg的SCSP于试管中,用浓度为0.01 mol/L的磷酸盐缓冲液(PBS)将其完全溶解,配制成质量浓度为2 mg/mL的SCSP母液。将母液按梯度稀释成质量浓度为1.000 0、0.500 0、0.250 0、0.125 0、0.062 5 mg/mL的多肽溶液。分别取稀释好的5种不同浓度的多肽溶液各20 μL按顺序放入96孔板中,每组平行3个孔,再依次加入200 μL的BCA混合工作液,用振荡器混匀后置于37 ℃的烘箱中孵育30 min,采用酶标仪测定各孔在562 nm处的吸光度。将SCSP浓度(x)与对应吸光度(y)进行直线回归拟合,绘制出SCSP含量的标准曲线(y=0.256 1x+0.138 2,R2=0.994 2)。标准曲线表明,SCSP在质量浓度为0.062 5～1.000 0 mg/mL范围内线性关系良好。

1.3.3 SCSP-LIP制备条件的优化

1.3.3.1 SCSP-LIP制备方法的筛选

1)乙醇注入法。参照Wang等[13]的方法并稍加修改。取50 mg蛋黄卵磷脂、8 mg胆固醇、10 μL吐温-80,超声溶解于3 mL无水乙醇中,作为有机相。精密称取10 mg SCSP溶于10 mL浓度为0.01 mol/L的PBS缓冲液中,50 ℃下预热,通过磁力搅拌形成均匀的旋涡状,作为水相。使用1 mL注射器将有机相缓慢均匀地注入水相中。在50 ℃下搅拌水合1 h,探头超声12 min,即得SCSP-LIP。

2)薄膜水合法。参照马德雪等[14]的方法并稍加修改。有机相和水相的制备方法均与乙醇注入法一致。通过旋转蒸发除去有机相中的乙醇,使脂质在烧瓶底部形成均匀的薄膜。将水相加入烧瓶中,搅拌水合1 h后,探头超声12 min,即得 SCSP-LIP。

3)逆相蒸发法。参照Zhang等[15]的方法并稍加修改。使用无水乙醚替代乙醇制备有机相。水相制备方法与乙醇注入法一致。使用注射器将水相缓慢注入有机相中,在冰水浴下超声使其形成稳定的乳液。将混合乳液置于圆底烧瓶中,旋转蒸发除去有机试剂,直至烧瓶底部形成凝胶状物质。加入PBS缓冲液水化至凝胶状物质从烧瓶底部脱落,搅拌水合1 h,探头超声12 min,即得SCSP-LIP。

1.3.3.2 SCSP-LIP制备条件的优化

根据1.3.3.1中优选出的方法,进行制备条件的优化实验。分别选取蛋黄卵磷脂质量(20、40、60、80、100 mg)、胆固醇与蛋黄卵磷脂质量比(1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6)以及SCSP与蛋黄卵磷脂质量比(1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6)为单因素指标,分析不同因素对SCSP-LIP的影响。

1.3.3.3 SCSP-LIP制备方法的验证

根据1.3.3.2中优选出的制备条件,进行3次重复实验。空白脂质体(B-LIP)根据1.3.3.2中优选出的条件,使用不含SCSP的PBS缓冲液制备。

1.3.4 SCSP-LIP性质表征

1.3.4.1 SCSP-LIP平均粒径、多分散指数以及Zeta电位的测定

用蒸馏水将SCSP-LIP稀释至合适的浓度,分别取适量样品放入聚苯乙烯池以及电位池中,平衡120 s后使用马尔文激光纳米粒度仪测定其平均粒径、多分散指数(PDI)及Zeta电位,经动态光散射处理软件对数据进行处理。

1.3.4.2 SCSP-LIP包封率的测定

采用超滤离心法[6]进行SCSP-LIP包封率的测定。使用移液器移取2 mL SCSP-LIP混悬液,置于Millipore超滤离心管(截留分子质量为100 kDa)的顶端套管内,7 000 r/min离心15 min。取下顶端套管,吸取管内液体,根据1.3.2中的方法计算游离SCSP的质量,重复实验3次并取平均值。通过式(1)计算包封率。

包封率

(1)

式(1)中:m为制备脂质体时加入的SCSP总质量,mg;m1为未被包封进脂质体的游离SCSP的质量,mg。

1.3.4.3 SCSP-LIP微观形态的观察

1)外观检查。将SCSP-LIP放置于透明玻璃瓶中拍照观察。

2)透射电子显微镜(TEM)观测。将SCSP-LIP稀释至适当倍数后,滴加在铜网正面,使用滤纸吸干多余样品,通过质量分数为2%的磷钨酸溶液负染 4 min,再用滤纸吸干多余染液,干燥后用透射电子显微镜观察并拍照分析。

1.3.4.4 SCSP-LIP红外光谱分析

将冻干后的样品与溴化钾压片后,采集红外光谱,扫描范围为4 000～400 cm-1,分辨率为2 cm-1。

1.3.5 SCSP-LIP的贮藏稳定性测定

将SCSP-LIP分别避光贮存于4、25 ℃条件下,分别于0、1、3、5、7 d取样并分析SCSP-LIP的平均粒径、PDI以及包封率。

1.3.6 SCSP-LIP的促细胞增殖作用分析

为了考察膜材料是否具有毒性,采用CCK-8试剂盒评估B-LIP对RAW 264.7巨噬细胞的毒性以及SCSP-LIP的促细胞增殖作用。取对数生长期的细胞,吹散计数后用新鲜培养基将细胞稀释成2.5×104个/mL的细胞悬液,以每孔200 μL的接种量将细胞接种至96孔培养板中。接种完成后将细胞置于培养箱(37 ℃、5% CO2)中孵育12 h,弃去细胞培养液。在各孔中分别添加含不同浓度的 B-LIP 和SCSP-LIP的培养液,将96孔板置于培养箱中孵育24 h。弃去细胞培养液,加入CCK-8试剂,将96孔板置于培养箱中孵育一段时间后,采用酶标仪测定各孔在450 nm处的吸光度。细胞相对活性计算方法见式(2)。

细胞活力=A实验/A对照×100% 。

(2)

式(2)中,A实验为含有不同浓度脂质体的实验组吸光度,A对照为对照组吸光度。

1.3.7 SCSP-LIP处理后的RAW 264.7细胞形态观察

取对数生长期的RAW 264.7细胞,吹散计数后调整其密度为5.0×104个/mL,按每孔2 mL将细胞接种至6孔板中。培养12 h后,弃去细胞培养基,分别添加含LPS(质量浓度为1 μg/mL)、SCSP、B-LIP及SCSP-LIP的DMEM培养基,将6孔板置于培养箱中孵育24 h。用倒置显微镜观察细胞形态并拍照。

1.3.8 SCSP-LIP对RAW 264.7细胞吞噬作用的测定

取对数生长期的RAW 264.7细胞,吹散计数后调整其密度为2.5×105个/mL,按每孔200 μL将细胞接种于96孔板中。各孔细胞处理方式与1.3.7相同。将6孔板置于培养箱中孵育24 h后,按照中性红吞噬试剂盒说明书测定各孔RAW 264.7细胞的中性红吞噬效果。

1.3.9 细胞摄取SCSP-LIP效果的观察

DiO标记的包埋SCSP脂质体(DiO-SCSP-LIP)的制备。称取0.1 mg DiO,与蛋黄卵磷脂、胆固醇、吐温-80一起溶入无水乙醇中,作为有机相,按1.3.3.1中薄膜水合法制备DiO-SCSP-LIP。

细胞摄取实验。取对数生长期的RAW 264.7细胞,吹散计数后调整其密度为5.0×104个/mL,按每孔1 mL将细胞接种于24孔板中。接种完成后将细胞置于培养箱(37 ℃、5% CO2)中孵育12 h,弃去细胞培养基。向各孔中添加含有质量分数为50 μg/mL 的DiO-SCSP-LIP的DMEM培养基,将24孔板置于培养箱中孵育24 h后,弃去培养液,用PBS缓冲液清洗细胞3次。使用体积分数为4%的多聚甲醛固定细胞10 min,经PBS缓冲液清洗3遍后使用DAPI染色液避光染色15 min,再用PBS缓冲液洗去多余DAPI并封片。通过荧光显微镜观察荧光强度并拍照,考察RAW 264.7细胞对DiO-SCSP-LIP的摄取情况[16]。

1.4 数据处理

实验数据采用平均值±标准差(M±SD)表示;通过SPSS 27统计软件进行单因素方差分析,以 P<0.05表示数据间有显著性差异;使用Origin 2021软件绘图。

2 结果与分析

2.1 SCSP-LIP制备方法筛选结果

分别采用乙醇注入法、薄膜水合法、逆相蒸发法制备SCSP-LIP,以SCSP-LIP的平均粒径、PDI、Zeta电位和包封率为指标,筛选制备SCSP-LIP的较佳方法,实验结果如表1。

表1中Zeta电位均为负值,说明3种方法制备的SCSP-LIP均为阴离子脂质体。薄膜水合法制备的SCSP-LIP粒径最小,乙醇注入法次之,逆相蒸发法制备的SCSP-LIP粒径相对较大;3种方法制备得到的SCSP-LIP的PDI均小于0.3,说明其粒径分布较为均匀。薄膜水合法的包封率最高,达61.36%,逆相蒸发法次之,乙醇注入法最低。本研究结果表明,选用薄膜水合法制备SCSP-LIP,包封率较高、粒径较小且稳定性相对较好。

2.2 SCSP-LIP制备条件优化结果

考察了蛋黄卵磷脂含量、胆固醇与蛋黄卵磷脂质量比、SCSP与蛋黄卵磷脂质量比对SCSP-LIP的平均粒径及包封率的影响,实验结果见图1。由图1(a)可知,随着蛋黄卵磷脂添加量的不断增加,SCSP-LIP的包封率相应增大,当蛋黄卵磷脂用量达到40 mg时,SCSP-LIP的包封率达到峰值69.45%,此时继续增加蛋黄卵磷脂用量,包封率反而开始下降。包封率之所以会出现先增加后降低的现象,主要是因为蛋黄卵磷脂含量增加可以促进脂质自组装[14],脂质双分子层所包裹的SCSP也在相应增加;当进一步提高蛋黄卵磷脂的用量,会促使脂质双分子层的对称性和通透性降低,体系总体稳定性减弱,甚至会引起脂质聚集,从而导致被包裹的 SCSP 减少,包封率降低。从粒径分布来看,当蛋黄卵磷脂用量为40 mg时,所制得的SCSP-LIP粒径相对较小且分布均匀(PDI=0.180)。因此,蛋黄卵磷脂的用量应设置为40 mg。

由图1(b)可知,随着胆固醇用量比例的减小,SCSP-LIP的包封率先增大后减小,相对应的平均粒径则逐渐降低。当胆固醇和蛋黄卵磷脂质量比为1∶4时, SCSP-LIP的包封率最大、粒径适中。这是因为在脂质体膜材中添加一定量的胆固醇可以调节磷脂双分子层的流动性,改善内相渗漏现象并增加体系稳定性[17]。胆固醇本身不能形成双分子层结构,其用量过高会使脂质双分子层的刚性太大,脂质体内部可用于包裹SCSP的空间变小,包封率降低;而胆固醇比例过小时,会影响脂质双分子层的形成,致使脂质膜不稳定。综合包封率以及粒径分布分析结果,胆固醇与蛋黄卵磷脂用量比例设置为1∶4。

由图1(c)可知,随着SCSP用量比例的减小,SCSP-LIP的包封率有所提高,当SCSP与蛋黄卵磷脂质量比为1∶4时,SCSP-LIP的包封率达到最大值,为69.49%,此时继续减小SCSP比例,SCSP-LIP的包封率明显降低。这是因为SCSP用量过高,会导致在此脂质用量下,包载能力达到最大时,仍有大部分SCSP以游离态存在于水相缓冲液中,SCSP 有一定的浪费,包封率相对较低;而SCSP用量较少又会导致脂质体包裹不均,整个体系失衡,致使包封率降低。本研究结果表明,多肽用量的变化对SCSP-LIP粒径影响不大,因此,将SCSP与蛋黄卵磷脂质量比设置为1∶4。

本研究表明,SCSP-LIP制备的较佳条件为:蛋黄卵磷脂用量为40 mg,胆固醇与蛋黄卵磷脂的质量比为1∶4,SCSP与蛋黄卵磷脂的质量比为1∶4,吐温-80用量为10 μL,PBS缓冲液的用量为10 mL,水化时间1 h,探头超声12 min。按照本实验优化条件制备3批次的SCSP-LIP,测定粒径为108.6、105.3、107.6 nm,平均粒径为(107.2±1.4) nm;包封率为68.26%、70.35%、71.23%,平均包封率为69.95%±1.24%。3批次的SCSP-LIP性质稳定。

2.3 SCSP-LIP的理化性质分析

2.3.1 SCSP-LIP的粒径分布及Zeta电位分析

SCSP-LIP的粒径分布及Zeta电位分析结果见图2。 由图2(a)可知,SCSP-LIP的平均粒径为(107.500±2.301)nm,PDI为0.175±0.023,粒径分布范围较窄,且分布区域相对集中。由图2(b)可知,SCSP-LIP的Zeta电位为(-29.800±0.577)mV。Zeta电位是判断一个样品携带电荷数量多少的指标。一般认为相对稳定的纳米悬浮液体系Zeta电位约为±30 mV[18-19]。 因此,可以初步判断通过本研究得到的SCSP-LIP粒径较小、分布均匀且具有一定稳定性。

2.3.2 SCSP-LIP的形态分析

考察SCSP-LIP的形态特征,实验结果见图3。由图3(a)可知:SCSP-LIP悬液澄清透明;图3(b)中的SCSP-LIP溶液可以显示红色激光路径,分散均匀,具有较好的丁达尔效应;由图3(c)可知,单一的SCSP-LIP呈球形,结构较为完整,表现为饱满的颗粒状囊泡,且大小分布均匀。本研究制备的SCSP-LIP符合脂质体制剂的形态要求。

2.3.3 SCSP-LIP的红外光谱分析

比较了SCSP、B-LIP与SCSP-LIP的红外光谱,实验结果见图4。由图4可以推断出多肽与磷脂分子相互作用的位点。由图4可知,对于SCSP,图谱中1 673 cm-1主要是CO在酰胺键上的伸缩振动峰[20];SCSP的α-螺旋、β-折叠分别位于1 650～1 658 cm-1和1 610～1 640 cm-1处;1 530～1 592 cm-1处的峰值是N—H的面内弯曲振动[21]。 B-LIP 在3 446 cm-1处有吸收峰,表示磷脂膜与水分子之间存在氢键(多分子缔合),从而引起O—H伸缩振动,而在负载SCSP后红移至3 461 cm-1处。CH2拉伸振动的交替及频率可以在一定程度上反映脂质体单层膜内部结构信息,从而表示脂质体搭载多肽后的变化以及多肽的位置[22]。当负载多肽后,1 363 cm-1处的吸收峰红移到1 364 cm-1处,导致多肽链上酰胺Ⅲ区C—O拉伸振动。此外,SCSP与磷脂酰胆碱的羧甲基发生反应后,胆碱基团的吸收峰从973 cm-1处移动到了983 cm-1处,表示多肽位于磷脂膜的极性位置。红外光谱分析结果说明SCSP被成功包封在脂质体中。

2.4 SCSP-LIP贮藏稳定性分析

脂质体制剂在日常加工、运输以及贮藏过程中容易受环境影响出现聚集、沉淀等现象,导致被包埋物质泄漏以及粒径分布发生变化[23]。将采用优化条件制备的SCSP-LIP平均分为两份,分别置于4、25 ℃下避光保存一定时间,定期检测不同保存条件下SCSP-LIP的粒径分布以及包封率的变化,判断样品最适的贮藏条件,贮藏稳定性实验结果见图5。由图5(a)可知,4 ℃条件下贮存的SCSP-LIP粒径并无明显变化,与之相比,25 ℃下储存的SCSP-LIP粒径显著增大。由图5(b)可知,随着贮藏时间的延长,25 ℃ 条件下贮存的SCSP-LIP的包封率明显低于4 ℃下贮存的SCSP-LIP。SCSP-LIP在低温条件下的相对高稳定性(与同研究的其他贮存条件相比)可归因于低温环境下Zeta电位的维持、双分子层流动性有所降低以及膜材中不饱和脂肪酸氧化过程的延迟[24]。较高的环境温度会改变脂质结晶结构,软化脂质膜从而增加其流动性,导致被包埋物质较快地从脂质体中泄露出来。

2.5 SCSP-LIP的促细胞增殖作用

为考察载体的安全性,对B-LIP进行了细胞毒性实验,实验结果见图6。由图6可知,经过不同浓度的B-LIP处理后,RAW 264.7细胞存活率没有明显差异,这表明在磷脂质量浓度为12.50～1 000.00 μg/mL时,载体本身不会对RAW 264.7细胞产生明显影响,该脂质体载体是安全可靠的。

考察了制备的不同质量浓度的SCSP-LIP对RAW 264.7细胞的增殖作用,实验结果见图7。由图7可知,低质量浓度条件下,RAW 264.7细胞相对增殖率随着SCSP-LIP质量浓度升高而增加,且与未添加SCSP-LIP的细胞相比存在显著差异;在SCSP-LIP质量浓度为200.0 μg/mL时,细胞增殖率略有下降。这一研究结果与课题组前期[10]对SCSP的研究结果一致,将SCSP包埋进脂质体中仍然可以较好地发挥促RAW 264.7细胞增殖的作用。

2.6 SCSP-LIP处理后的RAW 264.7细胞形态分析

巨噬细胞受到刺激被激活后,形态会发生不同程度的改变。不同处理方式对RAW 264.7细胞形态的影响见图8。由图8可知:未经过处理的细胞呈饱满的圆形且数量较少;LPS处理组的RAW 264.7细胞数量增加,形态变化明显,分化较多,细胞形状不规则并伴有伪足;经B-LIP处理后的RAW 264.7细胞形态没有明显改变,数量也没有明显增加;经SCSP处理后的RAW 264.7细胞出现少量分化,个别细胞伸出伪足(箭头所指);而SCSP-LIP处理组细胞体积增大,数量明显增多,分化较SCSP组明显(SCSP质量浓度均为100 μg/mL)。本研究结果说明,RAW 264.7细胞在SCSP的刺激下形态会发生改变,而SCSP-LIP能更好地激活RAW 264.7细胞,使其分化。

2.7 RAW 264.7细胞吞噬功能的变化

细胞吞噬作用是生物体内的某些特定细胞识别异物并将其消灭的功能,属于生物的基本防卫机制[25]。对于RAW 264.7细胞,吞噬能力是检测其活化状态的一个重要指标[26]。因此采用中性红染料检测不同方式处理后的RAW 264.7细胞吞噬能力变化,实验结果见图9。由图9可知:与未处理组相比,LPS处理组RAW 264.7细胞中性红吞噬率极显著增加;经SCSP及SCSP-LIP处理后,RAW 264.7细胞中性红吞噬能力与未处理组相比有显著提升(P<0.05)。本研究结果说明,与SCSP相比,SCSP-LIP能更显著地增强RAW 264.7细胞的吞噬能力。

2.8 细胞摄取SCSP-LIP效果分析

为评价SCSP-LIP的细胞内化能力,使用荧光显微镜观察RAW 264.7细胞摄取效果,观察结果见图10。由图10(a)可见,DAPI针对细胞核染色,蓝色荧光显示出RAW 264.7细胞核所在位置。由图10(b)可见,DiO的绿色荧光位于细胞的核周区域,表明其主要分布在细胞质中。由图10(c)可见,两种荧光共定位,说明DiO-SCSP-LIP被细胞摄取,进入细胞内部,帮助SCSP的细胞内化吸收。

3 结 论

本研究对免疫调节活性肽SCSP(RVAPEEHPVEGRYLV)进行了脂质体包埋技术优化,通过薄膜水合法制备了SCSP-LIP。得到了制备SCSP-LIP的较佳工艺:蛋黄卵磷脂用量为40 mg,胆固醇与蛋黄卵磷脂质量比为1∶4,SCSP与蛋黄卵磷脂质量比为1∶4,吐温-80用量为10 μL,PBS缓冲液用量为10 mL,探头超声12 min。制备的SCSP-LIP呈均匀球形,适合在4 ℃避光条件下贮藏。通过细胞实验可知,载体本身无细胞毒性,SCSP-LIP可以增强SCSP的免疫调节活性,促进RAW 264.7细胞增殖分化,提高吞噬能力,并能被RAW 264.7细胞摄取。本研究制备的包埋SCSP的脂质体递送体系,旨在为进一步开发吸收更好、更稳定的功能性免疫调节食品提供参考。

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Preparation and Characterization of Liposomes Encapsulating Cyclina sinensis Immunoreactive Peptides

WANG Zhen1, LIU Yuxuan1, ZHANG Mengqi2, TANG Yunping1, YU Fangmiao1,*
(1.School of Food and Pharmacy/Zhejiang Provincial Engineering Technology Research Center of Marine Biomedical Products, Zhejiang Ocean University, Zhoushan 316022, China;2.Zhoushan Institute for Food and Drug Control, Zhoushan 316012, China)

Abstract：To further exploit the immunomodulatory effects of Cyclina sinensis immunoreactive peptides (SCSP) and to seek a better method of peptide delivery, liposome technology was employed to encapsulate SCSP. Its preparation technology was optimized, and its physical and chemical properties and biological activity was explored. The effects of ethanol injection, thin-film hydration, and reverse-phase evaporation methods on the average particle size and encapsulation efficiency of the SCSP-encapsulated liposomes (SCSP-LIP) were compared. The preparation process for SCSP-LIP was optimized by utilizing average particle size and encapsulation efficiency as key performance metrics, with the mass of egg yolk lecithin, the mass ratio of cholesterol to egg yolk lecithin, and the mass ratio of SCSP to egg yolk lecithin as variables. The stability of SCSP-LIP was examined over 7 d storage at 4 ℃ and 25 ℃. The immunomodulatory and cellular uptake effects of SCSP-LIP on RAW 264.7 cells were explored. The results showed that the thin-film hydration method was more suitable for the preparation of SCSP-LIP, with optimal conditions being 40 mg of egg yolk lecithin, a cholesterol to egg yolk lecithin mass ratio of 1∶4, and an SCSP to egg yolk lecithin mass ratio of 1∶4, using probe sonication for 12 min. Under these conditions, the mean particle size, polydispersity index, Zeta potential and encapsulation efficiency of the SCSP-LIP was (107.500±2.301) nm, 0.175±0.023, (-29.800±0.577) mV and 69.95%±1.24%, respectively. SCSP-LIP system was clear, with no distinct odor. Transmission electron microscopy revealed that SCSP-LIP was spherical with uniform distribution. FTIR confirmed that SCSP was encapsulated in the polar part of the liposome. Storage stability results suggested that SCSP-LIP was more suitable for storage in the dark at 4 ℃. Cell experiments showed that SCSP-LIP could promote the proliferation and differentiation of RAW 264.7 macrophages, improve the phagocytosis function of macrophages more strongly than SCSP, and exhibit good cellular uptake effects. The results showed that preparation process of SCSP-LIP was simple and its properties was stable, providing a reference for further development of peptide-based functional foods with immunomodulatory activity.

Keywords：Cyclina sinensis; immunoreactive peptides; liposomes; thin film hydration method; encapsulation efficiency

中图分类号：TS201.1

文献标志码：A

doi：10.12301/spxb202300410

文章编号：2095-6002(2024)05-0104-11

引用格式：王震,刘昱璇,张梦奇,等.包埋青蛤免疫活性肽脂质体的制备及性质表征[J]. 食品科学技术学报,2024,42(5):104-114.
WANG Zhen, LIU Yuxuan, ZHANG Mengqi, et al. Preparation and characterization of liposomes encapsulating Cyclina sinensis immunoreactive peptides[J]. Journal of Food Science and Technology, 2024,42(5):104-114.

收稿日期：2023-07-07

基金项目：浙江省自然科学基金资助项目(LTGY24D060002; LGN20D060002)。

Foundation： Natural Science Foundation of Zhejiang Province (LTGY24D060002; LGN20D060002).

第一作者：王 震,男,硕士研究生,研究方向为海洋药物、海洋功能食品。

*通信作者：余方苗,男,副研究员,博士,主要从事海洋药物、海洋功能食品方面的研究。

(责任编辑：叶红波)