衰老是人体内自发的、不可避免的过程,是人体维持体内平衡能力的退化性变化[1]。衰老的自由基理论是由Denham Harman于1956年首次提出的,这一理论认为,体内自由基的产生和消失处于动态平衡,当失去平衡时,身体就会趋于衰老[2]。自由基随着人的年龄增长而增加,体内抗氧化防御系统减弱,导致活性氧(ROS)增加,引起细胞和组织损伤。大量证据表明,抑制氧化应激在延缓人体衰老过程中起着重要作用[3]。

SIRT1/SIRT3/Nrf2通路可以促进氧化应激过程中许多抗氧化过程的激活,增加抗氧化酶的表达,从而发挥抗氧化作用,减少ROS的产生。Sirtuins是临床上重要的细胞和生物体过程(代谢、细胞分裂和衰老等)的关键调节剂。研究证实,sirtuin1 (SIRT1) 和sirtuin3 (SIRT3)可以上调Nrf2,促进下游基因的表达,以脱乙酰酶依赖的方式导致ROS水平降低,从而发挥抗氧化应激作用,调节凋亡、增殖和能量代谢[4-5]。SIRT1可以负调节p53,从而减少由p53引起的DNA损伤、缺氧和氧化应激[6]。SIRT3是一种位于线粒体基质中的可溶性蛋白,表现出与线粒体能量产生相关的脱乙酰酶活性,并限制ROS的积累[7]。

Nrf2是一种转录调节因子,在氧化应激系统中起着关键作用。在正常生理条件下,Nrf2主要与其抑制剂Keap1结合,并以非活性状态存在于细胞质中。当细胞受到ROS或其他亲核物质攻击时,Nrf2和Keap1解偶联,活化的Nrf2被转运到细胞核中,并与抗氧化反应元件(ARE)结合。此过程有助于激活目标基因的表达,使超氧化物歧化酶(SOD)、醌氧化还原酶(NQO1)、血红素加氧酶(HO-1)和γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-GCS) 等抗氧化酶得到表达,从而有效防御细胞氧化损害[8]。

乳酸菌具有促进免疫调节、改善肠道菌群平衡、抑制胆固醇吸收、降低血脂和血压、消除重金属污染等多种生物学功效[9-11]。随着年龄的增长,人体肠道中乳酸菌的数量会减少,补充乳酸菌可以通过其抗氧化[12-13]、免疫调节[14]和自噬激活[15]等作用改善人体健康。已有研究表明,植物乳植杆菌作为乳酸菌的重要种类,具有很强的抗氧化和清除自由基的能力,可以防止氧化损伤[9]。然而,关于植物乳植杆菌的抗氧化作用及其相关机制的研究还不够清晰和完善。当前,虽然SIRT1/SIRT3/Nrf2信号通路在氧化应激领域广受关注,但是有关SIRT3通路与乳植杆菌属的关系仍需进一步研究和明确。

植物乳植杆菌H8(Lactiplantibacillus plantarum H8,CGMCC No.20168)是从东北地区特有的发酵食品黏面子中筛选出的具有抗氧化与抗衰老双重功效的专利菌株[16]。已有研究表明,植物乳植杆菌H8可以在体外有效清除多种自由基,包括2,2′-联氮基双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二铵盐(ABTS)自由基、2,2-二苯基苦基肼基(DPPH)自由基、羟基自由基和超氧阴离子自由基[17]。为了探究植物乳植杆菌在体内的抗氧化机制,本研究拟以分离自黏面子中的植物乳植杆菌H8为研究对象,观察植物乳植杆菌H8处理对D-半乳糖诱导的氧化损伤小鼠的器官指数、体内氧化应激水平、抗氧化指标含量的影响,进而探究植物乳植杆菌H8可能改善小鼠氧化损伤的作用机制,旨在为扩大开发抗氧化性益生菌产品资源提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

植物乳植杆菌H8,分离自黑龙江地区的发酵食品黏面子(以玉米面为原料发酵制成),保藏于吉林农业大学食品毒理学实验室;昆明小鼠,北京华阜康生物科技股份有限公司[SCXK(京)2019-0008];D-半乳糖,西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司;一氧化氮(NO)、SOD、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、还原型谷胱甘肽(GSH)、丙二醛(MDA)试剂盒,南京建成生物工程研究所;总RNA提取试剂盒、荧光定量试剂盒、cDNA第一链合成试剂盒,天根生化科技(北京)有限公司;引物,吉林库美生物有限公司;BCA试剂盒、山羊抗兔IgG抗体,碧云天生物技术研究所;Nrf2、HO-1、NQO1、SIRT1、SIRT3、GAPDH抗体,浙江杭州华安生物技术有限公司。实验所用试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

FA1004B型电子天平,上海佑科仪器仪表有限公司;YXQ-100A型立式压力蒸汽灭菌锅,上海博讯实业有限公司医疗设备厂;SW-CJ-2F型超净工作台,上海新苗医疗器械制造有限公司;SPARK 10M型酶标仪,瑞士Tecan公司;Centrifuge 5424 R型台式离心机,德国Eppendorf股份公司;QuickGel 6200 型凝胶成像系统,莫纳生物科技有限公司;Stratagene Mx300p型实时荧光定量qPCR仪,美国Agilent公司。

1.3 实验方法

1.3.1 植物乳植杆菌H8的制备

将植物乳植杆菌H8接种到无菌MRS肉汤培养基中,并在37 ℃厌氧培养20 h,连续活化3次,并将细菌悬液离心(3 000 r/min、4 ℃、10 min),收集细菌沉淀。洗涤沉淀2次,将菌体沉淀以1.0×1010 CFU/mL的浓度重新悬浮于生理盐水中以备后用。

1.3.2 动物分组与处理方法

动物实验由吉林农业大学动物伦理委员会批准(动物实验伦理编号:20230601001),并遵守国际动物实验伦理委员会规定。将32只昆明小鼠,16只雄性、16只雌性,体重(20±2)g(6周龄),随机分成4组,分别为正常组、模型组(D-半乳糖诱导组)、实验组(植物乳植杆菌H8组)和VC组(维生素C组)。在25 ℃,相对湿度60%的条件下,对小鼠进行12 h昼夜循环光照,期间自由进食和饮水适应1周。除正常组外,给其他所有组的小鼠每天注射200 mg/kg的 D-半乳糖,持续8周。正常组腹腔注射等体积的生理盐水,同时,实验组和VC组小鼠每天分别灌胃植物乳植杆菌H8(1.0×1010 CFU/kg)或维生素C (200 mg/kg)。在整个动物实验过程中,正常组和D-半乳糖组每天灌胃200 mg/kg的生理盐水。灌胃8周后,所有小鼠禁食24 h,然后通过颈椎脱臼实施安乐死,收集血液和器官样本用于后续实验。称量小鼠的体重和器官(心脏、肝脏、脾脏、肾脏和大脑)质量。按式(1)计算器官指数(QSI)。

QSI=器官质量/小鼠体重×100%。

(1)

1.3.3 氧化和抗氧化水平的测定

准确称取小鼠肝脏质量,料液比(g∶mL)为 1∶9,冰水浴条件下机械匀浆,4 ℃和4 000 r/min离心10 min,收集上清液。根据试剂盒说明书测定小鼠血清和肝脏中的NO、MDA、GSH、GSH-Px和SOD活性。

1.3.4 组织病理学分析

收集小鼠的肝脏、脾脏、大脑和结肠组织,每个组织的面积约为0.5 cm2,并在体积分数为10%的福尔马林溶液中固定48 h。将组织脱水、清除,包埋在蜡中,切割,然后用苏木精-伊红(H&E)染色。在200倍光学显微镜下观察组织的形态学变化。

1.3.5 实时荧光定量PCR分析

收集小鼠肝脏并匀浆,使用动物总RNA提取试剂盒提取总组织RNA。使用超微分析仪测定RNA的纯度和浓度,根据cDNA合成和逆转录试剂盒说明书进行逆转录和cDNA合成。将cDNA模板与SYBR Green混合。引物混合后,使用Strata gene Mx3000P检测相关基因的表达水平,引物序列如表1[18-21]。

表1 引物序列

Tab.1 Primer sequence

基因序列参考文献Nos1Forward: 5′-ACGGCAAACTGCACAAAGC-3′Reverse: 5′-CGTTCTCTGAATACGGGTTGTTG-3′[18]Nos3Forward: 5′-TCAGCCATCACAGTGTTCCC-3′Reverse: 5′-ATAGCCCGCATAGCGTATCAG-3′[18]Nos2Forward: 5′-GTTCTCAGCCCAACAATACAAGA-3′Reverse: 5′-GTGGACGGGTCGATGTCAC-3′[18]Sod1Forward: 5′-AACCAGTTGTGTTGTCAGGAC-3′Reverse: 5′-CCACCATGTTTCTTAGAGTGAGG-3′[18]CatForward: 5′-GGAGGCGGGAACCCAATAG-3′Reverse: 5′-GTGTGCCATCTCGTCAGTGAA-3′[18]HO-1Forward: 5′-ACAGATGGCGTCACTTCG-3′Reverse: 5′-TGAGGACCCACTGGAGGA-3′[18]Nrf2Forward: 5′-CAGTGCTCCTATGCGTGAA-3′Reverse: 5′-GCGGCTTGAATGTTTGTC-3′[19]γ-GcsForward: 5′-GCACATCTACCACGCAGTCA-3′Reverse: 5′-CAGAGTCTCAAGAACATCGCC-3′[18]Nqo1Forward: 5′-CTTTAGGGTCGTCTTGGC-3′Reverse: 5′-CAATCAGGGCTCTTCTCG-3′[18]Gap-dhForward: 5′-AGGTCGGTGTGAACGGATTTG-3′Reverse: 5′-GGGGTCGTTGATGGCAACA-3′[19]TrxForward: 5′-AGCCCTTCTTCCATTCCCTCTGT-3′Reverse: 5′-CTCCCCCACCTTTTGACCCTTTTT-3′[20]Sod2Forward: 5′-CAGACCTGCCTTACGACTATGG-3′Reverse: 5′-CTCGGTGGCGTTGAGATTGTT-3′[19]Sirt1Forward: 5′-GCAGGTTGCAGGAATCCAAA-3′Reverse: 5′-TGGCTTCATGATGGCAAGTG-3′[19]Sirt3Forward: 5′-AGATCCTGACCGAGCGTGGC-3′Reverse: 5′-CCAGGGAGGAAGAGGATGCG-3′[18]P53Forward: 5′-CCGCCGACCTATCCTTACC-3′Reverse: 5′-GCACAAACACGAACCTCAAAG-3′[21]

PCR反应循环参数:95 ℃预变性15 min后,95 ℃变性5 s,60 ℃退火10 s,72 ℃延伸15 s,共40个循环,72 ℃延伸5 min。以Gapdh为内参基因,使用荧光定量仪的分析软件获得Ct值。最终的基因表达水平用2-△△Ct表示。

1.3.6 蛋白免疫印迹分析

将PMSF蛋白裂解物加入1 mg肝脏中。混合物在低温下研磨,振荡30 min,在4 ℃条件下以 12 000 r/min离心10 min。用BCA分析试剂盒测定上清液中的蛋白质含量,通过SDS-PAGE分离蛋白质,并转移到PVDF膜上。室温下用体积分数为0.5%的牛血清白蛋白封闭膜1.5 h,然后将一抗(Nrf2、HO-1、NQO1、SIRT1和SIRT3)在4 ℃下孵育过夜。3次洗涤后,将样品与山羊抗兔IgG抗体在TBST孵育1.5 h。使用ECL试剂观察免疫蛋白条带,并用NIH Image 1.63软件对其进行定量分析,以GAPDH蛋白作为内参。

1.4 数据处理

使用Graphpad 8.0软件进行统计分析。所有数据均以平均值±标准偏差表示,采用Tukey’s多重比较检验的单向方差分析多组间的显著性差异。P<0.05表示有显著差异。

2 结果与讨论

2.1 H8对氧化损伤小鼠器官指数的影响

氧化是分解物质和释放能量的过程,在机体代谢过程中起着重要作用。当细胞中促进氧化和抗氧化的平衡被打破时,就会发生氧化应激,增加细胞中的氧自由基水平,并对脂质、蛋白质和DNA造成损害[22]。研究表明,过量的ROS会导致一些慢性疾病的发生,如阿尔茨海默病、神经退行性疾病和心血管疾病。近年来,人们十分重视从生物资源中寻找安全、天然的抗氧化剂[23]。研究发现,植物乳植杆菌H8具有良好的体外抗氧化作用[17]。因此,我们假设H8在改善由氧化应激引起的异常衰老中起重要作用。

在动物研究中,D-半乳糖会诱导和加速小鼠衰老的进程,可导致细胞肿胀、代谢紊乱以及组织和细胞中氧化酶活性的变化[24],进而导致其全身组织损伤。器官指数可用于测量动物器官的功能状态,并确定器官病变的性质和程度。衰老过程中,各器官收缩,器官指数随动物体重增加而降低,是衰老的重要指标[25]。本研究探究了H8对氧化损伤小鼠器官指数的影响,小鼠的器官指数变化情况见表2。由表2可知,与正常组相比,模型组中小鼠心脏、肝脏、脾脏、肾脏和大脑的器官指数分别降低了38.46%、22.45%、16.67%、15.03%、11.04%,表明腹腔注射D-半乳糖导致小鼠组织萎缩。与模型组相比,实验组的心脏、脾脏、肾脏和大脑的器官指数分别升高了14.29%、12.5%、6.92%、8.76%,并且与传统抗氧化剂VC组相比没有显著性差异,表明实验组小鼠组织萎缩过程受到抑制。本研究结果表明,植物乳植杆菌H8能抑制小鼠氧化衰老过程中器官指数的下降,从而减缓D-半乳糖引起的小鼠机体组织萎缩。

表2 小鼠的器官指数

Tab.2 Organ index of mice

组别心脏肝脏脾脏肾脏大脑正常组0.91±0.07a5.88±0.42a0.48±0.06a1.53±0.04a1.54±0.08a模型组0.56±0.14c4.56±0.24b0.40±0.09c1.30±0.05c1.37±0.22c实验组0.64±0.03b4.87±0.06b0.45±0.06b1.39±0.14b1.49±0.12bVC组0.67±0.04b5.64±0.74a0.45±0.04b1.41±0.19b1.49±0.07b

同列不同上标字母表示组间数值差异显著(P<0.05)。

2.2 H8对氧化损伤小鼠血清和肝脏中氧化和抗氧化水平的影响

宿主本身具有天然的抗氧化酶系统,如SOD和GSH-Px,可以保护其免受氧化应激。维持抗氧化酶系统的平衡对宿主很重要。Garrido等[26]发现,CAT和GSH在过早衰老小鼠细胞中的活性明显低于正常小鼠相应酶的活性。益生菌在体内和体外对ROS具有显著的抗氧化能力[27]。动物双歧杆菌的培养上清液、完整细胞和细胞内无细胞提取物可以在体外清除羟基自由基和超氧阴离子自由基,同时增强体内抗氧化酶活性[28]。林祥娜等[29]论证了短乳杆菌AR247的抗氧化成分是细胞表面的主要膜蛋白,是细胞内的主要成分,而不是表面多糖。本团队前期体外研究表明,植物乳植杆菌H8的无细胞上清液、完整细胞和无细胞提取物均显著清除了DPPH自由基和ABTS+自由基[17]。在本研究中,测定各组血清和肝脏中的NO和MDA水平以及SOD、GSH-Px和GSH的活性,以确定H8能否减轻氧化损伤小鼠的体内氧化应激并提高抗氧化水平,实验结果如表3。由表3可知,与正常组相比,模型组血清和肝脏中SOD、GSH-Px和GSH活性显著降低,NO和MDA水平显著升高。然而,在灌胃H8后,与模型组相比,实验组小鼠血清中NO和MDA占比分别降低了17.69%和42.11%,肝脏中NO和MDA占比分别降低了60.08%、13.95%。同样,小鼠血清和肝脏中SOD、GSH-Px和GSH活性显著升高。这些结果表明,小鼠摄入植物乳植杆菌H8后,通过清除自由基增强了各种抗氧化酶的活性,进而逆转了小鼠的氧化应激状态,减缓了氧化损伤。

表3 小鼠血清和肝脏NO和MDA水平以及SOD、GSH-Px和GSH的活性

Tab.3 NO and MDA levels and activities of SOD, GSH-Px, and GSH in serum and liver of mice

指标正常组模型组实验组VC组c(NO)/(μmol·L-1)16.26±0.75d44.27±0.04a36.44±1.46b29.31±0.10cc(MDA)/(nmol·mL-1)6.92±0.12d18.64±0.27a10.79±0.33b9.86±0.50c血清ρ(GSH)/(mg·L-1)30.18±1.31a14.51±1.84d17.65±4.14c23±2.13bρ(GSH-Px)/(U·mL-1)298.70±20.43a148.33±31.45d210.23±12.80c244.62±9.03bρ(SOD)/(U·mL-1)167±15.93a82±10.26d122.43±13.29c148±20.52bc(NO)/(μmol·L-1)0.25±0.02d2.43±0.79a0.97±0.09b0.38±0.10cc(MDA)/(nmol·mL-1)1.87±0.14d3.87±0.13a3.33±0.34b3.20±0.23c肝脏ρ(GSH)/(mg·L-1)7.01±2.89a1.34±3.00d3.83±3.93c5.44±3.50bρ(GSH-Px)/(U·mL-1)289.22±23.47a133.07±15.82d200.10±10.13c236.50±8.25bρ(SOD)/(U·mL-1)79.42±8.28a33.29±10.28d50.34±12.36c56.39±7.39b

同列不同上标字母表示组间数值差异显著(P<0.05)。

2.3 H8对氧化损伤小鼠器官组织的影响

对小鼠的肝脏、脾脏、大脑和结肠组织进行病理学分析,结果见图1。由图1(a)可知:显微镜下观察小鼠肝组织H&E切片,正常组肝细胞组织良好,胞浆分布均匀,无炎性细胞浸润,无明显病理改变;模型组肝细胞出现明显的病理改变,并伴有大范围出血、细胞排列紊乱、不同程度肿胀、形态不规则、大量炎症浸润;与模型组相比,实验组出现零星出血,肝细胞形态与正常组相似。因此,植物乳植杆菌H8可以减轻D-半乳糖诱导的肝损伤。

放大倍数为200倍。

图1 小鼠肝脏、脾脏、大脑和结肠组织的病理分析结果
Fig.1 Pathological analysis of liver, spleen, brain, and colon in mice

由图1(b)可知:正常组小鼠脾脏组织结构完整,红、白髓分布清晰;而模型组红髓和白髓分布紊乱,红髓窦扩张并充满大量红细胞,相比之下,白髓淋巴细胞减少,红髓索变窄;与模型组相比,实验组病理损伤程度较轻,红髓和白髓清晰,接近正常组,表明植物乳植杆菌H8对D-半乳糖诱导的脾脏组织损伤有一定的缓解作用。

由图1(c)可知:正常组小鼠脑组织的皮质区呈圆锥形,排列整齐致密,细胞核饱满、核仁明显、边界清晰;模型组部分区域出现细胞核凋亡,与正常组小鼠相比,脑组织结构松散、排列紊乱;然而,植物乳植杆菌H8的治疗减少了D-半乳糖诱导的脑组织的损伤,切片接近于正常小鼠的脑组织。

同样观察小鼠结肠组织切片,由图1(d)可知:正常组的结肠组织结构完整、隐窝结构良好;模型组结肠组织隐窝深度明显萎缩,杯状细胞丢失,结肠组织充血,出现炎症;实验组病理损伤较轻,隐窝萎缩程度减轻,与正常组接近,表明植物乳植杆菌H8对结肠组织有一定的保护作用。

2.4 H8对氧化损伤小鼠肝脏中氧化应激相关mRNA基因表达的影响

SIRT1在能量代谢和衰老中发挥着重要作用。作为一种双向调节蛋白,SIRT1可以抑制下游p53的表达。p53是通过SIRT1调节细胞生命活动和去乙酰化功能的信号,从而抑制正常的细胞凋亡。p53 mRNA在氧化应激诱导的衰老过程中过度表达。虽然对SIRT1已有大量的研究,但是关于乳杆菌属对SIRT1的调节相关研究较少[30-32]。本研究中,H8对氧化损伤小鼠肝脏中氧化应激相关mRNA基因表达的影响,分析结果见图2。由图2可知,与正常组相比,模型组中SIRT1、NQO1、NOS1、NOS3、SOD1、HO-1、Cat、Nrf2、SIRT3、Trx、SOD2和GLCM的mRNA表达水平显著降低。在灌胃H8后,基因的mRNA表达水平均有不同程度的增加。此外,模型组p53和NOS2的mRNA表达水平明显高于正常组,但H8灌胃后其mRNA表达水平明显下降。一些研究表明[33],SIRT3可以通过增强抗氧化酶的活性来提高线粒体活性氧的清除率,在本研究中,H8也是通过SIRT3的上调增强了抗氧化酶,如SOD、GSH-Px的活性来改善氧化损伤的。目前,尚未见到关于乳植杆菌属和SIRT3之间关系的报道。本团队研究了SIRT3信号通路的激活和乳植杆菌属之间的潜在联系,发现其激活可能与乳酸菌的表面成分有关,SIRT通过乙酰化修饰乳酸菌表面肽聚糖、多糖蛋白质等,进而对细胞功能进行调节;并且,乳酸菌代谢物如乙酸也有可能与促进SIRT1的表达有关[34]。本研究结果显示,D-半乳糖诱导的小鼠SIRT1和SIRT3的基因表达水平显著降低,而p53表达水平显著提高。植物乳植杆菌H8处理显著逆转了D-半乳糖对SIRT1和SIRT3表达的抑制,并抑制了p53表达,表明菌株H8可以调节SIRT1、SIRT3和p53,从而防止D-半乳糖诱导的氧化损伤。

不同小写字母表示组间数值差异显著(P<0.05)。

图2 小鼠肝脏中氧化应激相关基因的mRNA表达
Fig.2 mRNA expression of oxidative stress related genes in mice liver

2.5 H8对氧化损伤小鼠肝脏中氧化应激相关蛋白表达的影响

Nrf2在细胞氧化应激的调节中起重要作用。当受到氧化应激时,Nrf2可以通过调节抗氧化酶的转录来影响氧化还原状态。Sirt1和Sirt3的激活促进Nrf2的抗氧化途径和抗氧化酶的转录活性,从而在抗氧化损伤中发挥作用。Nrf2是益生菌中重要的抗氧化因子[35-36]。Nrf2参与益生菌对抗氧化细胞防御的激活,这不仅在人体细胞中得到证实,而且在体外动物细胞模型中也得到了证实。体内研究集中于不同的小鼠模型,包括高胆固醇、高脂肪饮食、高氧化应激和衰老模型。一些益生菌乳酸菌株可以激活Nrf2信号并上调小鼠肝脏中的下游抗氧化酶,包括SOD、CAT和HO-1,从而增强抗氧化防御。在对小鼠和果蝇模型进行的一项研究中发现,鼠李糖乳杆菌LGG通过产生5-甲氧基吲哚乙酸激活Nrf2的转录,并改变肝脏的抗氧化反应,这在一定程度上揭示了肠道微生物调节肝脏氧化应激敏感性的机制[37]。

本研究利用Western blot分析检测SIRT1/Nrf2通路,并探讨了植物乳植杆菌H8在D-半乳糖诱导的小鼠肝脏中的抗氧化应激反应机制,分析结果见图3。由图3可知,模型组中NQO1、HO-1、SIRT3、SIRT1和Nrf2的蛋白水平均显著低于正常组(P<0.05)。但在灌胃植物乳植杆菌H8后,这些蛋白的表达水平显著提高,尤其是NQO1、HO-1和SIRT3,这与VC组的灌胃效果相似。本结果表明,植物乳植杆菌H8可促进Nrf2蛋白易位,Nrf2的下游基因NQO1、NOS1、NOS3、SOD1、HO-1、Cat、Nrf2、SIRT3、Trx、SOD2和GLCM的mRNA表达水平显著提高,NOS2水平显著降低,p53的转录活性受到抑制。本研究结果表明,植物乳植杆菌H8能够通过提高SIRT1/Nrf2通路中相关蛋白的表达,进而改善氧化损伤小鼠的氧化应激反应。

柱状图中不同小写字母表示组间数值差异显著(P<0.05)。

图3 小鼠肝脏中氧化应激相关蛋白的mRNA表达
Fig.3 mRNA expression of oxidative stress related protein in mice liver

通过对氧化应激相关mRNA基因表达和蛋白表达的分析,得出植物乳植杆菌H8对D-半乳糖诱导的小鼠氧化应激影响的机制,见图4。然而,抗氧化酶的表达和活性可以受到多个信号通路的调控,这些信号通路包括Nrf2、NF-κB、MAPK、SIRT3等,它们可以通过不同的途径来调节抗氧化酶的表达和活性,从而影响细胞的抗氧化能力。在本研究中,H8的抗氧化作用与SIRT1和SIRT3上调Nrf2有关,从而促进抗氧化酶的表达,抗氧化酶包括这些氧化应激指标如SOD、GSH-Px等,进而改善D-半乳糖诱导的小鼠氧化损伤。本研究仅探讨了一株植物乳植杆菌改善小鼠氧化损伤的机制,对于其他菌株的抗氧化作用是否也是通过此通路实现的,还需要进一步研究和证明。在未来的研究中有必要探讨其他乳植杆菌属对D-半乳糖诱导的氧化损伤的影响及其潜在机制,以及是否存在菌株差异性。

图4 植物乳植杆菌H8对D-半乳糖诱导的小鼠氧化应激影响的机制
Fig.4 Mechanism of effect of Lactobacillus plantarum H8 onoxidative stress induced by D-galactose in mice

3 结 论

本研究初步证实了植物乳植杆菌H8对D-半乳糖诱导的小鼠氧化损伤具有改善作用,并探究了SIRT3通路和乳植杆菌属之间对抗氧化损伤作用的关系。本研究表明,植物乳植杆菌H8可以提高 D-半乳糖诱导的小鼠器官指数,降低小鼠血清和肝脏中氧化应激标志物NO和MDA的水平,提高小鼠血清和肝脏中抗氧化指标SOD、GSH-Px和GSH的活性,说明了植物乳植杆菌H8能够改善D-半乳糖诱导小鼠组织免受氧化应激损伤。同时,植物乳植杆菌H8可以激活SIRT1和SIRT3的表达,并激发抗氧化酶的mRNA和蛋白的表达,促进p53的泛素化和降解,并减少ROS的生成,进而改善小鼠的氧化损伤。本研究表明,植物乳植杆菌H8可能通过上调SIRT1/SIRT3/Nrf2信号通路,改善小鼠氧化损伤。因此,分离自黏面子的植物乳植杆菌H8能够改善氧化损伤,有望成为抗氧化性益生菌产品的原料。

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Mechanism of Lactiplantibacillus plantarum H8 on Oxidative Damage in Mice

LI Yue, YAN Wei, JIANG Bin, LIN Ke, REN Dayong*
(College of Food Science and Engineering, Jilin Agricultural University, Changchun 130118, China)

Abstract：Nianmianzi is a unique fermented food in Northeast China which is fermented with corn flour as raw material. In order to explore whether Lactiplantibacillus plantarum H8 isolated from Nianmianzi can improve the oxidative damage in mice, an aging mouse model of oxidative damage induced by D-galactose was established, and its possible signal mechanism was studied. 32 Kunming mice were injected with 200 mg/kg D-galactose every day to induce oxidative damage in mice, and at the same time, Lactiplantibacillus plantarum H8 with a concentration of 1.0×1010 CFU/mL was gavaged for 8 weeks to observe the effect of H8 on serum and liver of mice with oxidative damage. According to the findings, H8 could prevent oxidative stress in mice tissues by raising the organ index. It could also dramatically lower oxidative stress levels in serum and liver, including NO and MDA, and increase the activity of antioxidant indices in serum and liver, like SOD, GSH-Px, and GSH. Furthermore, Lactiplantibacillus plantarum H8 was shown to be able to lessen the harm that D-galactose caused to mice’s liver, spleen, brain, and colon tissue using H&E section staining. Meanwhile, Lactiplantibacillus plantarum H8 had the ability to promote the expression of antioxidant enzymes generated by the Nrf2-ARE pathway at the mRNA and protein levels, as well as activate sirtuins 1 (SIRT1) and sirtuins 3. SIRT1 could encourage the ubiquitination and destruction of p53 and lessen the production of reactive oxygen species. The findings suggested that the up-regulation of the SIRT1/SIRT3/Nrf2 signaling pathway might be connected to the antioxidant activity of Lactiplantibacillus plantarum H8, and a possible correlation between the SIRT3 signaling pathway and Lactiplantibacillus was investigated. The goal of this study wa to provide theoretical reference for developing antioxidant probiotic products.

Keywords：Lactiplantibacillus plantarum; aging; oxidative damage; D-galactose; SIRT1/SIRT3/Nrf2 signaling pathway

中图分类号：TS201.3

文献标志码：A

doi：10.12301/spxb202300788

文章编号：2095-6002(2024)05-0093-11

引用格式：李月,闫薇,姜斌,等.植物乳植杆菌H8对小鼠氧化损伤的作用机制[J]. 食品科学技术学报,2024,42(5):93-103.
LI Yue, YAN Wei, JIANG Bin, et al. Mechanism of Lactiplantibacillus plantarum H8 on oxidative damage in mice[J]. Journal of Food Science and Technology, 2024,42(5):93-103.

收稿日期：2023-12-24

基金项目：国家自然科学基金资助项目(32172189);吉林省科技厅中青年科技创新创业卓越人才(团队)项目(20220508106RC)。

Foundation： National Natural Science Foundation of China (32172189); Outstanding Talents (Team) Project of Young and Middle-Aged Scientific and Technological Innovation and Entrepreneurship in Jilin Province Science and Technology Department(20220508106RC).

第一作者：李 月,女,博士研究生,研究方向为食品科学与工程。

*通信作者：任大勇,男,教授,博士,主要从事益生菌资源开发与利用方面的研究。

(责任编辑：叶红波)