针对肥胖的预防和治疗已成为世界各国面临的重大公共卫生挑战。为了应对这个挑战,很多减肥药物以及手术方法相继问世,但这些手段或多或少的都有一些副作用,对人们的健康有很大的影响。因此,通过日常合理膳食来预防和治疗肥胖及其相关代谢紊乱是目前最重要的措施和策略。天然食材因其良好的抑制肥胖的效果和较少的副作用越来越受到人们的青睐。

苹果是世界上四大水果之一,营养丰富,备受全球消费者的喜爱[1]。我国是世界上最大的苹果生产国,苹果种植面积和产量约占世界的50%[2]。为了提高苹果成熟果的品质,必须在苹果生产过程中进行疏花疏果[3]。大量的疏除幼果直接丢弃在果园中,不仅造成了严重的资源浪费,还会加速果树病虫害的传播[4]。除此之外,苹果幼果中富含多酚,幼果中多酚的含量大约是成熟果中的10倍,且绝大多数为根皮苷和绿原酸[5]。因此,如何合理开发利用大量废弃的苹果疏除幼果,对苹果资源深加工及提高其附加值具有重要的意义。

目前在苹果及其幼果对肠道健康的研究中,大多数采用的是单一的功能成分,但食物中的功能成分在被人体摄入时,通常是多种功能成分一起摄入协同调节宿主的肠道微生物群;然而关于这一协同调节作用研究较少。本研究拟采用三相连续发酵系统体外模拟结肠发酵,利用苹果幼果富含多酚和膳食纤维的特性,探究苹果幼果果粉(young apple powder,YAP)对健康(NC)和肥胖(OB)志愿者肠道菌群的影响,通过16S rRNA高通量测序和 GC-MS分析,测定YAP对结肠微生物菌群和短链脂肪酸含量的影响,旨在提高对苹果幼果多酚、膳食纤维和(或)其他功能成分对肠道微生物群的调节作用,以期为苹果幼果促进机体健康和预防疾病提供科学依据,为苹果幼果资源的合理利用提供新思路。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

富士苹果幼果,陕西兴华果蔬公司;阿拉伯半聚乳糖、L-半胱氨酸、D-无水葡萄糖、马铃薯淀粉,上海麦克林生化科技有限公司;黏蛋白、木聚糖,西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司;酵母提取物,英国Oxoid公司;苹果果胶(食品级),陕西海升果业发展股份有限公司;刃天青,上海原叶生物科技有限公司;磷酸盐缓冲液(PBS),广州环凯生物技术有限公司;二甲基亚砜(细胞培养级),北京索莱宝科技有限公司;其他试剂为分析纯。

1.2 仪器与设备

FD-1A-50型真空冷冻干燥机,北京博医康实验仪器有限公司;UV-3200型紫外分光光度计,上海美谱达仪器有限公司; YXQ-70A型立式压力蒸汽灭菌器,上海博迅实业有限公司;7890B-5977B型安捷伦气质联用仪,美国安捷伦科技有限公司;ME/04E型电子天平,梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司;SW-CJ-1FD型洁净工作台,苏净集团苏州安泰空气技术有限公司;H1850型台式高速离心机,湖南湘仪实验室仪器开发有限公司;Z-500B型高速多功能粉碎机,永康市兆申电器有限公司。三段式体外模拟结肠发酵装置,青岛大学公共卫生学院自主研发。

1.3 实验方法

1.3.1 苹果幼果果粉的制备

富士苹果幼果在开花30 d后于陕西渭南收集,保存于陕西师范大学-20 ℃冰箱。YAP的制备参考牛鹏飞等[6]的方法,并经过了实验室前期研究及实际生产的实践改进。去除表皮农药残留,清洗、晾干。切片后在质量分数为0.5%抗坏血酸和质量分数为1%柠檬酸水溶液中浸泡护色,冻干粉碎并过100目筛后于4 ℃避光保存备用。

1.3.2 YAP水分及灰分含量测定

参考GB 5009.4—2010测定了YAP中的水分及灰分含量,单位为mg/g。

1.3.3 YAP蛋白质及粗脂肪含量测定

蛋白质的含量采用考马斯亮蓝法进行测定。粗脂肪含量参考GB 5009.6—2016的方法进行测定,单位为mg/g。

1.3.4 YAP总多酚含量的测定

样品总多酚含量为可溶性和不可溶键合多酚含量之和。参考福林-酚试剂比色法测定样品中可溶性和不可溶键合多酚含量。以没食子酸作为标准品绘制标准曲线,y=0.046 7x+0.001 8(R2=0.999),结果以没食子酸当量表示,单位为mg/g。

1.3.5 YAP总膳食纤维含量测定

总膳食纤维含量测定采用GB 5009.88—2014中的酶重量法。经沉淀、抽滤、洗涤后,同时测出样品残渣中蛋白质与灰分含量,单位为mg/g。

1.3.6 YAP可溶性膳食纤维含量的测定

提取YAP中粗多糖并按1.3.5节测定YAP中以多糖为主的可溶性膳食纤维含量。

1.3.7 粪便采集与处理

粪便采集自2名年龄相仿的成年男性,1名为健康志愿者(NC),采样前3个月内没有任何肠道紊乱,没有服用抗生素或定期使用益生菌等;另1名为BMI>25的肥胖志愿者(OB)。具体处理过程为用一次性硬质无菌袋收集新鲜粪便,取 10 g 粪便样品用50 mL无菌PBS缓冲液(pH=7.4)稀释,匀浆,500 r/min离心2 min后于-18 ℃避光保存,离心后的浑浊液作为接种物。

1.3.8 三相连续发酵系统体外模拟结肠发酵实验

发酵培养基的配制采用Gil-Sánchez等[7]的方法并稍加改动。将培养基调至pH值为6.0后120 ℃、20 min高压蒸汽灭菌。每个独立实验由3个发酵罐串联而成,分别模拟升结肠AC(80 mL,pH=5.6)、横结肠TC(100 mL,pH=6.2)、降结肠DC(120 mL,pH=6.8),装置流速为6.25 mL/h。在实验开始前向每个发酵罐中独立接入20 g/mL的粪便浑浊液,整体温度控制在37 ℃。每个发酵瓶都用磁力搅拌器以一定速度持续搅拌以模拟肠道蠕动。充入氮气,并排出氧气,以维持发酵罐中的厌氧环境。每个发酵罐独立连接碱液瓶(0.1 g/L NaOH),通过恒流泵向发酵罐中均匀输送碱液以维持每个发酵罐预先设置的pH值。首先,在3个结肠反应器(AC、TC、DC)中分别接种新鲜的粪便溶液(20 g/mL),接种后运行系统14 d,此阶段为微生物稳定期。微生物群稳定后,连续7 d急性喂食二甲基亚砜(DMSO)预先溶解的低剂量YAP,单次剂量155 mg,共2.17 g(相当于干预39.62 mg总多酚、452.99 mg膳食纤维)。随后进行7 d洗脱,并将系统恢复到初始稳定的状态,再进行连续7 d的高剂量YAP(DMSO预溶解)急性干预,单次剂量620 mg YAP,共8.68 g(相当于干预158.48 mg总多酚、1.81 g膳食纤维)。最后进行8 d洗脱后结束实验,整个发酵周期持续44 d。

1.3.9 微生物16S rRNA测序分析

发酵结束后,取样品进行16S rRNA测序。根据保守区设计得到引物,在引物末端加上测序接头,进行PCR扩增并对其产物进行纯化、定量和均一化,形成测序文库,建好的文库先进行文库质检,质检合格的文库用Illumina Novaseq 6000进行双末端测序(Paired-End),通过对16S rRNA V3～V4高变区扩增分析微生物群落。扩增V3和V4高变区的PCR引物:正向5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′、反向5′- GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′。得到的原始图像数据文件,经碱基识别(base calling)分析转化为原始测序序列(Sequenced Reads),使用Usearch软件[8]对Reads在97.0%的相似度水平下进行聚类,获得操作分类单元(OTUs)进行生物信息学分析和统计学分析。

1.3.10 发酵样品短链脂肪酸含量测定

根据Hua等[9]的方法提取短链脂肪酸(short-chain fatty acids,SCFAs)并测定含量。取结肠发酵样品离心后的上清液,加入NaCl、丙酮、硫酸后涡旋混匀,用乙醚振摇提取10 min,冷冻离心后取上层有机清液转移进离心管中,过0.22 μm有机系滤膜,滤液使用GC-MS分析发酵液中7种SCFAs (乙酸、丙酸、丁酸、异丁酸、戊酸、异戊酸、己酸)的含量。气质联用仪色谱柱为DB-FFAP(30 m×0.250 mm×0.25 μm)。

1.4 数据处理

使用GraphPad 8.0.2绘图,采用SPSS 19中单因素方差分析的LSD检验确定差异的显著性。采用相应R包对Shannon指数、Chao1指数、ACE指数和Simpson指数进行了Alpha多样性分析,通过主成分分析(PCA)判别可视化多样性的差异。利用QIIME软件生成门和属水平上的物种丰度表,再利用R语言工具绘制样品各分类学水平下的群落结构图。使用斯皮尔曼相关系数分析不同SCFAs与肠道微生物区系相对丰度之间关系, 并调用相应R包绘制热图。

2 结果分析

2.1 YAP的基本组分测定结果

YAP中基本组分及含量见表1。1.3.1节制备的YAP得率为15.1%。

表1 YAP的基本组分含量

Tab.1 Basic ingredient content of YAP

组分w/(mg·g-1)水分1.58%±0.28%灰分3.20%±1.37%蛋白质4.29±0.02粗脂肪15.90±1.04 总膳食纤维417.50±0.04 多糖56.90±0.20 不可溶性膳食纤维339.30±0.36总酚57.10±0.03

2.2 人体结肠微生态模拟系统中微生物的组成分析

利用OB和NC志愿者的粪便,采用16S rRNA分析人体结肠微生态模拟系统中微生物的组成。选取第0天(对照组)、第1天、第5天和第7天的样品进行16S rRNA测序,测序结果进行微生物谱图分析,探究低剂量和高剂量的YAP急性干预对升结肠(AC)、横结肠(TC)、降结肠(DC)3个结肠反应器肠道菌群的影响。样品测序共获得3 357 741对Reads,双端Reads质控、拼接后共产生3 349 377条 Clean Reads。经97%的相似度聚类,共得到7 199个OTUs。

2.3 结肠微生物多样性分析

图1显示了OB组和NC组在体外发酵过程中的Alpha多样性。Chao 1和Ace指数用于衡量物种丰度即物种数量的多少,Shannon和Simpson指数用于衡量物种多样性,受样品群落中物种丰度和物种均匀度的影响[10-11]。在不同剂量YAP干预的过程中(L1～L7和H1～H7),OB组和NC组的Shannon和Simpson指数均呈现先升高后降低的趋势,在L5时达到最高,这可能是由于发酵前期YAP中含量较高的膳食纤维促进了微生物的生长,导致微生物多样性增强,而后期多酚对结肠微生物生长的抑制作用导致微生物多样性指数降低。Chao 1指数和Ace指数在发酵过程中上下波动并在发酵结束后均略有升高,说明微生物群的丰度有所提高,这可能由于多酚和膳食纤维的协同调节作用,导致微生物生长逐步趋于平衡。整体看来,OB组和NC组的模拟结肠菌群在经YAP干预后的丰度及多样性都有所升高,但不显著(P>0.05)。

D0:基线第0天(对照);H1、H5、H7:高剂量处理第1、5、7天;L1、L5、L7:低剂量处理第1、5、7天。

图1 连续发酵期间样品的Alpha多样性分析
Fig.1 Alpha diversity analysis of samples during continuous fermentation

在不同剂量的YAP干预下,OB组和NC组结肠微生物的Beta多样性见图2。采用基于不同样品OTU(97%相似性)组成的主成分分析(PCA)来反映肠道菌群在属水平上的差异。第一组分(PC1)和第二组分(PC2)对样品差异的贡献值在AC、TC、DC这3个反应器中分别占到总方差的65.40%、63.73%、68.63%,说明前2个组分可以反映OB组和NC组在不同剂量YAP处理下的结肠微生物在属水平的差异情况。在D0(对照组)时,NC组和OB组在3个反应器内均位于第二、三象限(除OB在DC反应器位于PC1正负半轴临界值外),表明2个实验组的初始微生物群落在组成上存在显著差异。经过高剂量YAP处理后,OB组和NC组几乎全部分布至PC1的负半轴,而低剂量YAP处理后的全部存在于PC1轴的正半轴,表明高低剂量YAP作用差异显著。

NC:健康志愿者;OB:肥胖志愿者;发酵过程中时间的演变以图形从小到大的形式表示。

图2 连续发酵系统中样品微生物组成的主成分分析
Fig.2 Principal component analysis based on microbial composition of samples in continuous fermentation system

此外,与高剂量YAP处理组相比,低剂量YAP处理组的数据发生更远距离的位移,表明低剂量YAP处理组对微生物群落Beta多样性的影响更显著。综上所述,OB组和NC组都有一个特定的结肠微生物起始种群,尽管样本之间存在差异,但YAP对2组微生物群落的Beta多样性均存在与剂量干预相关的显著变化。

2.4 结肠微生物群落结构分析

图3展示了在不同剂量YAP干预前后,OB组和NC组在D0,L1、L5、L7,H1、H5、H7时发酵液中结肠微生物在门水平的相对丰度。发酵过程中3个结肠反应器的主要优势菌门为厚壁菌门(Firmicutes)、变形菌门(Proteobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidota)和放线菌门(Actinobacteriota)。厚壁菌门(Firmicutes)和拟杆菌门(Bacteroidota)是人类肠道菌群的优势类群[12]。本研究发现,不同剂量的YAP可改变结肠微生物在门水平的相对丰度,但不改变结肠微生物在门水平的群落结构。此外,除H5之外,NC组厚壁菌门(Firmicutes)的相对丰度在整个结肠发酵过程中均高于OB组。高低剂量的YAP干预过程中厚壁菌门(Firmicutes)的相对丰度在各组的AC反应器中相对较高,而在DC反应器中相对较低,说明发酵过程消耗了部分来自厚壁菌门的细菌。NC组在不同剂量的YAP干预下,L5和L7时,拟杆菌门(Bacteroidota)的相对丰度较D0时显著降低(P<0.05)。OB组在低剂量YAP的干预下,放线菌门(Actinobacteriota)的相对丰度在L5和L7时均较D0时显著增加(P<0.05),这一现象在NC组同样存在但并不显著(P>0.05)。综上所述,YAP能改变微生物的群落组成,对结肠微生物具有一定的调节作用。

D0:基线第0天;H1、H5、H7:高剂量处理第1、5、7天;L1、L5、L7:低剂量处理第1、5、7天。*、**分别表示与D0时相比差异显著(P<0.05)、差异极显著(P<0.01)。

图3 连续发酵期间样品门水平微生物组成
Fig.3 Phylum-level microbial composition of samples during continuous fermentation

选择属水平相对丰度前15的微生物进一步分析AC、TC、DC反应器在NC组和OB组随发酵时间变化的微生物组成,结果见图4。在属水平上,YAP对2组3个结肠反应器的肠道菌群均有调节作用,其中乳球菌属(Lactococcus)和巨球菌属(Megasphaera)是肠道菌群中属水平的优势菌。在3个结肠反应器中,YAP对AC中的属水平微生物丰度群落变化影响最为明显。低剂量YAP的干预可显著降低NC组在TC反应器中多种菌群属水平上的丰度变化,如乳球菌属(Lactococcus)、拟杆菌属(Bacteroides)、不动杆菌属(Acinetobacter)、Clostridium_sensu_stricto_1和Clostridium_sensu_stricto_2;但对OB组在TC中的属水平菌群的丰度影响不大。低剂量YAP的干预可抑制2组DC反应器中相对丰度前15的菌群整体丰度水平,粪杆菌属(Faecalibacterium)在调节肥胖及代谢综合征中发挥了关键作用[13]。本研究中,高剂量YAP干预结束时(H7),OB组属水平优势菌的相对丰度均上升但仍低于发酵开始时的丰度值;而NC组除粪杆菌属(Faecalibacterium)和萨特菌(Sutterella)外,其他细菌的生长均被低剂量的YAP抑制,也低于发酵开始时的丰度值。在OB组的DC反应器中,高剂量YAP处理使得H5时较D0时所有属水平优势细菌的相对丰度达到最低,而随后其丰度又逐渐升高并在H7时恢复到了初始丰度(D0),说明高剂量YAP干预对OB组和NC组有相似的调节作用,2组菌群相对丰度均在7 d的发酵周期内达到稳定,而这一现象在DC反应器中表现最明显,这可能是由于粪便的菌种构成更接近于降结肠[14]。

图4 连续发酵期间样品属水平微生物的丰度堆叠面积
Fig.4 Stacked area of genus-level microbial abundance of samples during continuous fermentation

图5显示了OB组与NC组属水平丰度前30的肠道微生物聚类分析,从红色到蓝色表示物种的丰度降低,样品间距离和枝长表示按不同的方式分组时各物种丰度的相似程度。与D0相比,NC组和OB组的AC、TC和DC反应器在高低2种剂量的YAP处理后存在不同的微生物图谱,说明YAP能够改变属水平微生物的群落组成,对结肠微生物具有一定的调节作用。

D0:基线第0天;H1、H5、H7:高剂量处理第1、5、7天;L1、L5、L7:低剂量处理第1、5、7天。

图5 连续发酵期间样品的属水平微生物丰度分析
Fig.5 Analysis of genus-level microbial abundance of samples during continuous fermentation

2.5 结肠短链脂肪酸含量分析

在不同的肠道微生物群衍生代谢产物中,最具代表性的是膳食纤维发酵的终产物——SCFAs[15]。由膳食纤维发酵产生的SCFAs,主要是乙酸、丙酸和丁酸,是肠道微生物群促进结肠健康的功能成分[16]。为探究不同剂量YAP处理对NC组和OB组的肠道SCFAs的影响,利用GC-MS分析了各发酵液样品中SCFAs的含量(图6)。由图6(a)可知,与NC组相比,OB组在D0时的总SCFAs较低。低剂量YAP干预后,NC组和OB组的7种SCFAs含量均呈现先升高后降低的趋势,且在L1时,总SCFAs的含量显著增加(P<0.01)。经低剂量YAP处理并发酵7 d后,NC组和OB组中含量较高的SCFAs由高到低依次为乙酸、丁酸、丙酸、己酸;而经高剂量YAP处理并发酵7 d后,OB组含量较高的SCFAs由高到低依次为乙酸 、丙酸、丁酸、己酸;NC组为乙酸、丁酸、己酸、丙酸。低剂量YAP摄入7 d后,与D0时相比,OB组和NC组丁酸、戊酸、异戊酸、己酸的含量均显著升高,其中NC组的丁酸浓度从D0的0.116 2 μmol/mL上升到0.246 5 μmol/mL;OB组的丁酸浓度从D0的0.091 8 μmol/mL上升到0.269 9 mol/mL; OB组和NC组戊酸含量分别是发酵前的4.3倍和3.3倍,异戊酸的含量分别是发酵前的2.0倍和2.8倍。在高剂量YAP的干预下,与D0相比,己酸的含量在发酵的过程中显著增加。综上所述,YAP摄入可显著提高体外发酵过程中SCFAs的含量,表明YAP可促进结肠微生物对营养物质的吸收和利用,作为调节宿主肠道健康的潜在营养因子。

D0:基线第0天;H1、H5、H7:高剂量处理第1、5、7天;L1、L5、L7:低剂量处理第1、5、7天。#、##分别表示与NC组D0时比较差异显著(P<0.05)、差异极显著(P<0.01);&、&&分别表示与OB组D0时比较差异显著(P<0.05)、差异极显著(P<0.01);*、**分别表示OB组与NC组间差异显著(P<0.05)、差异极显著(P<0.01)。

图6 连续发酵期间样品的SCFAs含量
Fig.6 Short-chain fatty acid content of samples during continuous fermentation

通过微生物与SCFAs之间的斯皮尔曼相关性分析发现,结肠中某些细菌的增加促进了SCFAs的产生,结果见图7。属水平相对丰度水平前30的微生物中,能显著正向调节部分SCFAs生成的细菌为Lachnoclostridium、Bacteroides、Hungatella、Eisenbergialla、Cloacibacillus、Clostridium_sensu_strricto_2、Clostridium_sensu_strricto_1、Schleiferilactobacillus等,其中,Lachnoclostridium对SCFAs的生成影响最大,显著促进除己酸外的6种SCFAs的生成;而Clostridium_sensu_strricto_2、Clostridium_sensu_strricto_1和Schleiferilactobacillus主要对丁酸和戊酸的生成有显著的正向调节作用。Acidaminococcus 被证实与肥胖相关,高脂饮食能够引起其相对丰度的增加,提示其不利于SCFAs的生成[17]。Acidaminococcus与丙酸、丁酸、戊酸等SCFAs生成量呈显著负相关;而Megasphaera、Slackia有助于肥胖及代谢紊乱的发展[18]。研究发现,Megasphaera、 Olsenell、Slackia、Weissell、unclassified_ Enterobacteriaceae等有害菌与7种SCFAs的生成量呈显著负相关。其中,与丁酸生成量呈显著负相关(P<0.05)的共有8种,如 Slackia、Faecalibacterium等;而Weissella和unclassified_Enterobacteriaceae主要起到显著负向调节乙酸生成的作用(P<0.05)。因此,YAP中功能成分的协同摄入能够调节结肠微生物群,从而生成较多的 SCFAs。

*为P<0.05,**为P<0.01。

图7 SCFAs与属水平微生物相关性分析
Fig.7 Correlation analysis of short-chain fatty acids and genus-level microorganisms

3 讨 论

人类肠道包含了广泛的细菌群落,不仅是消化吸收的场所,更被认为是一个高度特异化的器官,维持肠道微生物群的平衡与人体健康密切相关[19]。然而,直接对人体或动物模型肠道内容物进行取样研究,往往操作繁琐且易受道德伦理约束,因此人体肠道菌群的体外发酵模型逐渐受到广泛关注,在进行动物实验之前进行体外模拟肠道发酵的研究很有必要。该技术通过长期连续发酵形成接近人体的体外结肠菌群,是研究不同食物成分影响人群肠道微生物组成及结构的重要工具。传统的批式发酵模型仅适用于短期发酵(48 h)的相关研究,但对微生物群的评价和微生物代谢调控等复杂性实验需要连续补充底物,否则,发酵时间不足无法达到体外稳定的条件。而多相连续发酵装置配有不同的发酵罐用于模拟肠道内不同阶段的生态环境,发酵罐成分、pH值、温度、体积等参数均按照人体的生理情况设定,实现发酵过程在时间、空间和理化特性上的准确合理。目前的体外研究表明,苹果多酚提取物可显著提高小鼠盲肠微生物群的丰富度[20],而补充苹果可溶性膳食纤维也可在一定程度上恢复小鼠肠道微生物多样性[21]。然而,当利用苹果全果时,由于其多酚与膳食纤维的相互作用,可能对单一化合物的生物活性和生物利用度产生影响。因此,本研究通过探究苹果幼果果粉对人类粪便生物群的组成结构和代谢的影响,增强对苹果幼果的功能研究和综合利用。

厚壁菌门和拟杆菌门是人类肠道微生物群的优势类群,其比例与肥胖的发生有关,但也有结论称厚壁菌门与拟杆菌门的比例并不能作为决定人类肥胖的依据[22],此结论存在争议。本研究发现,YAP干预不能显著影响各组结肠微生物中厚壁菌门与拟杆菌门的比例,可能是由于将粪便物质接种到体外动态模型后,主要肠道微生物群的相对丰度可能会发生变化。因此,认为YAP对肠道微生物群的调节作用能够独立于厚壁菌门与拟杆菌门比值的降低,并仍能引起一些代表性菌的丰度水平发生变化。此外,拟杆菌属(Bacteroides)成为DC反应器中OB组和NC组含量最丰富的菌属,表明YAP促进了拟杆菌属(Bacteroides)的生长且这种作用对降结肠影响最为明显。

SCFAs是肠道微生物产生的重要代谢产物,在维持人体肠道的正常生理功能和健康方面起着关键作用[23]。YAP中富含膳食纤维和多酚成分,而未被上消化道吸收的膳食纤维及多酚,可以在结肠部位被微生物群发酵产生 SCFAs,乙酸、丙酸和丁酸是不同剂量下发酵YAP过程中OB组和NC组结肠中的主要产物,且乙酸是肠道中含量最多的SCFAs。丙酸是一种葡萄糖生成剂,与抑制胆固醇合成有关[24]。丁酸是肠道细胞的代谢能量来源,在维持肠道稳态和上皮细胞完整性方面发挥关键作用[25]。同时,丁酸盐也被证明可以促进能量消耗和提高胰岛素敏感性[26]。本研究发现,OB组和NC组在低剂量YAP干预后,均观测到粪便中丁酸、戊酸和己酸的浓度显著增加,表明YAP可作为潜在营养因子促进结肠微生物对营养物质的吸收和利用。拟杆菌(Bacteroides)是一种产SCFAs菌,可以利用多种膳食纤维,并在改善肥胖个体的代谢和免疫紊乱方面发挥着重要作用[27]。本研究发现,拟杆菌(Bacteroides)能够促进多种SCFAs的生成,尤其是乙酸、丙酸和异丁酸(P<0.01)。 Lachnoclostridium是肥胖人群肠道微生物中潜在的有益群体,有助于肠道健康[28]。本研究中,Lachnoclostridium丰度与乙酸、丙酸、丁酸、戊酸的生成量呈显著正相关(P<0.05)。但是,也有研究发现,Lachnoclostridium水平的增加降低了乙酸盐的水平并增加了内脏脂肪堆积[29],但其研究是在人体内进行的,并且只评估了关于乙酸盐的变化,而不包括其他的SCFAs。因此,还需要对Lachnoclostridium在肥胖症中的作用进行更多体外及体内的研究。

本研究中,尽管捐赠者年龄相仿且没有胃肠道疾病,但是其他特征可能影响肠道微生物群组成,例如饮食、运动和压力水平,因此在未来的研究中可以做进一步探究。

4 结 论

研究通过16S rRNA高通量测序研究了YAP在体外结肠发酵过程中对结肠微生物的调节作用。YAP在发酵过程中可被人体粪便中的结肠微生物群利用,从而影响微生物群的组成和丰度,并正向调节结肠微生物群的代谢产物——短链脂肪酸的生成。体外发酵的结果表明,YAP的干预未对健康和肥胖志愿者结肠微生物群的Alpha多样性产生显著影响,但不同剂量的YAP使Beta多样性发生显著变化。低剂量YAP的干预显著增加了OB组放线菌门(Actinobacteria)的相对丰度,提高了NC组拟杆菌门(Bacteroidota)的相对丰度并降低了变形菌门(Proteobacteria)的相对丰度;但高剂量YAP的干预对结肠微生物群在门水平的相对丰度变化无显著影响。YAP富含多酚和膳食纤维,在结肠微生物群的作用下能够产生较多的SCFAs(乙酸、丙酸、丁酸、异丁酸、戊酸、异戊酸和己酸),其中乙酸的含量最高。YAP的干预可显著提高健康和肥胖志愿者结肠中丁酸、戊酸和己酸的浓度。与基线(D0)相比,YAP的干预可能通过调节产短链脂肪酸菌,如Lachnoclostridium、Bacteroides、Hungatella、Eisenbergiella和Cloacibacillus的相对丰度,从而促进SCFAs生成,对人类健康产生积极影响。本研究结果旨在为肠道微生物群饮食调控提供理论依据,为YAP作为功能性食品开发和利用提供新思路,未来应通过体内实验进一步验证研究结果。

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Effects of Young Apple Powder on Simulated Human Colonic Microbiota in vitro

YANG Yali1,2, ZHOU Xueru2, CHEN Lei3, GUO Yurong2,*
(1.School of Light Industry, Beijing Technology and Business University, Beijing 100048, China;2. School of Food Engineering and Nutritional Science, Shaanxi Normal University, Xi’an 710119, China;3.Institute of Nutrition &Health, Qingdao University, Qingdao 266071, China)

Abstract：Using young apple fruits as raw materials, young apple powder (YAP) was prepared by vacuum freeze-drying technology, and the content of major components including polyphenols and dietary fiber was determined. A three-stage continuous fermentation system was used to simulate colonic fermentation, and combined with high-throughput 16S rRNA high-throughput sequencing and GC-MS analysis, the effects of YAP on the composition of colon microbiota and short-chain fatty acids in healthy and obese volunteers were explored. The results showed that YAP was rich in dietary fiber [(417.50±0.40) mg/g] and total polyphenolic substances [(57.10±0.03) mg/g]. YAP altered the microbiota composition in colonic reactors of healthy and obese volunteers, with no significant changes in Alpha diversity but significant differences in Beta diversity. Low-dose YAP had a significant effect on the relative abundance of different bacterial groups in the colon. YAP significantly increased the relative abundance of Bacteroidota and decreased the relative abundance of Proteobacteria in the healthy group. In the obese group, YAP significantly increased the relative abundance of Actinobacteriota. Within a 7 d fermentation period, YAP had a regulatory effect on both experimental groups of genus-level colonic microbiota, resulting in their relative abundance reaching a stable value. YAP promoted the production of bacteria which could produce short-chain fatty acids and increased the total content of short-chain fatty acids in the colon of healthy and obese volunteers, with the highest content of acetic acid in short-chain fatty acids. Low-dose YAP significantly increased the concentration of valeric acid, butyric acid and caproic acid in colon samples (P<0.05). The results of simulated colonic fermentation in vitro showed that YAP rich in polyphenol-dietary fiber could significantly regulate the composition of colon microbiota and short-chain fatty acids in healthy and obese volunteers. This study aimed to provide new ideas and theoretical basis for dietary regulation of gut microbiota.

Keywords：young apple powder; polyphenols; dietary fiber; fermentation in vitro; colonic microbiota; short-chain fatty acids

中图分类号：TS255.4; TS201.4; R151.3

文献标志码：A

doi：10.12301/spxb202300038

文章编号：2095-6002(2024)05-0081-12

引用格式：杨雅利,周雪如,陈磊,等.苹果幼果果粉对体外模拟人体结肠微生物群的影响[J]. 食品科学技术学报,2024,42(5):81-92.
YANG Yali, ZHOU Xueru, CHEN Lei, et al. Effects of young apple powder on simulated human colonic microbiota in vitro[J]. Journal of Food Science and Technology, 2024,42(5):81-92.

收稿日期：2023-01-08

基金项目：陕西省科技厅一般项目(2023-XCZX-09)。

Foundation： Shaanxi Provincial Department of Science and Technology Project (2023-XCZX-09).

第一作者：杨雅利,女,副教授,博士,主要从事果蔬加工及副产物综合利用方面的研究。

*通信作者：郭玉蓉,女,教授,博士,主要从事果蔬贮藏与加工方面的研究。

(责任编辑：张逸群)