黟县是全国重点产茶县,制茶历史悠久,产茶量巨大,且以绿茶、红茶、黑茶为主。其中“黟县黑茶”是黟县“五黑”特色农业产业,对农民增收和茶资源的利用具有重要意义。黟县黑茶主要是采摘春季后期当地的群体种鲜叶为原料,经杀青、揉捻、渥堆、初干、复堆、足干等工艺制作成黑毛茶,与湖南黑砖茶毛茶等制作工艺较为相似,但其渥堆程度较轻(一般12～16 h),其中渥堆对其品质的形成具有重要影响。

已有研究表明,黑茶渥堆受湿热和微生物的共同作用,能够促进茶叶中物质发生转化、裂解、聚合等反应。如脂质、类胡萝卜素裂解生成挥发性物质[1-3];儿茶素类物质发生酶促氧化、聚合形成茶黄素类(theaflavins, TFs)、茶红素类(thearubigins, TRs)以及茶褐素类(theabrownine, TB)物质[4];渥堆过程中咖啡碱及儿茶素类物质含量的降低、可溶性糖及游离氨基酸含量的上升等[5]。

真菌是黑茶渥堆中主要的微生物,可通过分泌胞外酶参与茶叶内物质的转化,对品质形成起重要作用[6-7]。杨吉霞等[8]研究显示,曲霉菌属是陕西茯砖茶渥堆中的主要优势真菌。郑鹏程等[9]在研究青砖茶渥堆真菌种类中指出黑曲霉、青霉菌属、塔宾曲霉等为主要优势菌。白飞荣等[10]研究表明,黑曲霉代谢产生的有机酸、多酚氧化酶、纤维素酶、单宁酶等,可显著促进普洱茶中粗纤维的软化以及大分子物质的转化。杨晓苹等[11]研究显示,酵母属真菌能分泌胞外酶,且在高温条件下表现出高活力,促进茶叶中多酚类物质的转化,对普洱茶香醇浓厚的品质形成具有重要意义。

渥堆过程中真菌的来源较为广泛,不同的原料、加工环境与工艺对黑茶渥堆过程中微生物群落组成均具有重要影响,从而影响了黑茶的品质特征[12-14]。黟县黑茶在地域、原料、工艺上与其他产区黑茶存在较大差异,其渥堆中真菌多样性与品质风味形成还缺少相关理论基础。因此,本研究拟对黟县黑茶渥堆中真菌多样性及品质形成进行研究,探究黟县黑茶渥堆中优势真菌及影响品质风味形成的关键化合物,以期为黟县黑茶加工与品质形成提供理论支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

样品取自于黄山市天方茶叶有限公司厂区的黑茶渥堆生产样,鲜叶原料来源于黟县当地的有性系群体种(即种子繁殖)茶树,以一芽二、三叶为主。

研究中7种儿茶素类物质标准品,包含没食子酸(gallic acid,GA)、儿茶素(catechin,C)、表儿茶素(epicatechin,EC)、表没食子儿茶素(epigallocatechin, EGC)、表儿茶素没食子酸酯(epicatechin gallate,ECG)、表没食子儿茶素没食子酸酯(epigallocatechin gallate,EGCG)和没食子儿茶素没食子酸酯(gallocatechin gallate,GCG),上海源叶生物科技有限公司;咖啡碱标准品(caffeine,CAF),北京海岸鸿蒙标准物质技术有限责任公司;游离氨基酸标准品、癸酸乙酯(99%),美国Sigma-Aldrich公司;茶氨酸标准品,北京百灵威科技有限公司;氨基酸分析缓冲试剂A(Buffer A-1, 0.12 mol/L, pH值2.9)、试剂B(Buffer B-1, 0.3 mol/L, pH值4.2)、试剂C(Buffer C-4, 0.3 mol/L, pH值8.0)、试剂D(500 mmol/L NaOH, 0.68 mmol/L EDTA),购于德国赛卡姆公司;茚三酮 购于上海麦克林生化科技有限公司。

1.2 仪器与设备

50型滚筒电热杀青机,浙江上洋机械有限公司;60型斗式烘干机,浙江春江茶叶机械有限公司;S-433D型氨基酸分析仪,德国Sykam公司;LC-2010C型岛津液相色谱仪,QP2020型气相色谱质谱联用仪(gas chromatography-mass spectrometry,GC-MS),日本岛津公司;DB-5 MS(30 m×0.25 mm×0.25 μm)色谱柱、InfintyLab Proshell 120 SB-C18(2.7 μm,150 mm×4.6 mm)色谱柱,美国安捷伦公司;SPME 萃取头(50/30 μm DVB/CAR/PDMS,57348-U),默克公司;ABI ProFlex PCR仪,美国爱普拜斯公司。

1.3 实验方法

1.3.1 样品的采集

用于真菌分析的样品采集方法。黑茶堆高 0.8 m、宽1 m、长1 m,上层样为茶堆上表层向下0.2 m平面空间内随机5点,各取样100 g,混匀后总计500 g;中层样为茶堆中心向上、向下各0.1 m平面空间取样(同上层);下层样为茶堆底表层向上至0.2 m平面空间取样(同上层),取样点位置测定相应温度,样品信息见表1。所有样品收集密封后立即储藏于-80 ℃冰箱内,待真菌多样性分析,取样过程的自封袋、手套等均经过无菌处理。

用于品质成分测定的样品制作方法。取渥堆0 h(未渥堆)和渥堆16 h(上层样、中层样、下层样及混合样)样品置于斗式烘干机中进行干燥,120 ℃初烘5 min,下机摊晾30 min,再90 ℃复烘20 min完成。用粉碎机对烘干后的样品进行粉碎,过80目筛,保存于-20 ℃冰箱内,待用于品质成分分析。

取样选取渥堆的4个不同阶段5个采样时间点,依次为渥堆的开始阶段(0 h),前期阶段(4 h),中期阶段(8 h和12 h),后期阶段(16 h)。

1.3.2 黟县黑茶渥堆中真菌分析

黟县黑茶渥堆中真菌多样性委托南京擎科生物科技有限公司使用Illumina HiSeq测序平台进行分析测定。

PCR扩增程序:98 ℃预变性2 min;98 ℃变性30 s,50 ℃退火30 s,72 ℃延伸60 s,30个循环;72 ℃稳定延伸5 min。PCR产物保存于-20 ℃冰箱用于后续分析。

1.3.3 挥发性化合物定性和定量分析

采用顶空固相微萃取(headspace-solid phase microextraction,HS-SPME)技术吸附香气成分,并经GC-MS对挥发性物质进行定性与定量分析。

HS-SPME法。准确称取0.1 g干燥粉碎后样品粉末置于20 mL萃取瓶中,加入5 mL 100 ℃水,加入10 μL癸酸乙酯(20 μg/mL,溶剂为甲醇)为内标化合物,于70 ℃水浴中平衡5 min,吸附30 min用于GC-MS分析。每个样品重复3次。

GC-MS分析条件[15]。SPME纤维在250 ℃温度下解吸,以10∶1的比例进行分流。GC梯度程序:40 ℃保留5 min,以3 ℃/min 速率上升到85 ℃并保留2 min;以3 ℃/min速率上升到110 ℃并保留1 min;以5 ℃/min速率上升到 200 ℃并保留1 min;以15 ℃/min速率上升到260 ℃并保留3 min。载气为高纯氦气,流速为1 mL/min。MS操作条件为 230 ℃离子源,接口温度250 ℃,0.1 kV电压,30～600 m/z扫描范围,5次扫描/s。

化合物于NIST数据库(NIST Chemistry Web Book)中检索比对进行化合物定性。定量采用癸酸乙酯(内标),根据化合物的峰面积与癸酸乙酯峰面积之比计算其相对含量。

1.3.4 主要滋味物质的含量测定

儿茶素类物质、咖啡碱和游离氨基酸的提取参考文献[16]。准确称取0.25 g干燥粉碎后样品粉末置于25 mL锥形瓶中,加入8 mL 100 ℃水,于90 ℃水浴7 min后,经漏斗脱脂棉过滤,收集茶汤,重复冲泡3次(3×8 mL),合并3次茶汤,定容至25 mL待分析。每个样品重复3次。

儿茶素类物质、咖啡碱的测定分析方法。流动相A为体积分数为0.04%的磷酸水溶液,流动相B为乙腈,流动相C为甲醇;流速1.0 mL/min,检测波长280 nm,柱温箱温度40 ℃。洗脱条件为0～1 min(90% A、7.5% B、2.5% C);1～23 min(85% A、11.2% B、3.8% C);23～23.1 min(15% A、85% B);23.1～35 min(15% A、85% B);35～50 min(90% A、7.5% B、2.5% C);50～60 min(90% A、7.5% B、2.5% C)。

氨基酸的测定分析方法[17]。缓冲试剂A、试剂B、试剂C、试剂D为流动相。茚三酮缓冲液为衍生相,配制方法为20 g茚三酮加入600 mL甲醇和400 mL钾钠缓冲液。流动相和衍生相流速分别为0.45和0.25 mL/min。流动相梯度程序为0～1 min(80% A、20% B);1～3 min(79%A、21% B);3～8 min(61% A、39% B);8～20 min(43% A、57% B);20～24 min(43% A、57% B);24～36 min(100% B);36～42 min(100% C);42～47 min(76% C、24% D);47～61 min(76% C、24% D);61～61.1 min(100% D);61.1～68 min(100% D);68～68.1 min(100% A);68.1～84 min(100% A)。检测波长分别为570 nm和440 nm。

儿茶素类物质、咖啡碱和游离氨基酸依据标准品出峰时间定性,依据绘制的标准曲线分别进行定量。

1.4 数据统计

采用Excel软件进行数据统计分析;FLASH 1.2.11软件、Trimmomatic软件、UCHIME 8.1软件、Usearch软件、QIIME软件、UNITE(真菌)等用于真菌多样性分析[18-19];用SPSS 19.0软件的Duncan (D)方差分析方法分析不同绿茶样品中代谢物含量差异,P<0.05表示具有显著性差异; SMICA.P软件用于样品间的PLS-DA和VIP值分析。

2 结果与分析

2.1 黟县黑茶渥堆中堆温变化分析

渥堆是黟县黑茶品质形成的关键工艺,其中堆温、茶叶含水量等渥堆条件对品质风味的形成具有重要影响。渥堆过程中不同层间温度变化见图1。由图1可知,不同层间温度保持在38～55 ℃,总体表现出中层温度高于下层温度、下层温度高于上层温度。渥堆开始时温度最高,可达到55 ℃,主要是杀青叶的余热。随着渥堆进行不同层间温度呈现逐渐下降趋势。

2.2 黟县黑茶渥堆中真菌多样性分析

2.2.1 渥堆中真菌的高通量测序分析

样品中真菌的高通量测序分析结果见图2。利用稀释曲线可反映新OTU(operational taxonomic unit,操作性分类单元)出现速率,由图2(a)可知,随测序序列数量增加,曲线表现急剧上升,后趋于平缓,表明测序数据量足以反映黟县黑茶渥堆中真菌的丰富度。依据Shannon稀释曲线,说明样品中OTU种类的丰富度[20],即Shannon指数越高,OTU种类越丰富。由图2(b)可知渥堆初始(HC0)真菌多样性较低,而在渥堆中期真菌多样性最高(HC4、HC6、HC7)。基于0.97的相似水平下检索数据库分析真菌多样性指数,见图2(c),在门水平下,共检索出6个门;在属水平下,共检索出191个属,见图2(d),渥堆开始真菌多样性在80多种属以内,渥堆中期(8～12 h)最丰富,且渥堆过程中上层多样性高于下层,下层高于中层,这与堆温的温度分布正好相反,表明高温可能抑制了真菌多样性生长。

2.2.2 渥堆中真菌多样性分析

黟县黑茶渥堆中真菌的多样性分析结果见图3。分析渥堆中门水平下真菌多样性,由图3(a)可知,渥堆过程中真菌多样性主要集中于子囊菌门、球囊菌门、被孢霉门、壶菌门、担子菌门、油壶菌门,其中子囊菌门(Ascomycota)在渥堆4 h中层样中最为丰富;球囊菌门(Glomeromycota)在渥堆8 h的上、中、下层样品中较丰富;被孢霉门(Mortierellomy-cota)、壶菌门(Chytridiomycota)、担子菌门(Basidiomycota)和油壶菌门(Olpidiomycota)均在渥堆12 h后的上层样中最为丰富,这表明随着渥堆时间的推移,门水平下真菌多样性变化较大。

由图3(b)可知,属水平下真菌多样性中,枝孢菌属(Cladosporium)、Setophoma、链格孢菌属(Alternaria)、葡萄孢菌属(Botrytis)在渥堆刚开始更丰富,随着渥堆时间增加,这4类菌属丰度下降;镰刀霉属(Fusarium)在渥堆4 h后中层样中最丰富,而Articulospora在渥堆4 h后下层样中最丰富。拟盘多毛孢属(Pestalotiopsis)、枝顶孢霉属(Acremonium)、Castanediella、Ilyonectria、Arcopilus、Lentinus以及粗糙孔菌属(Trechispora)在渥堆8 h下层样中显著丰富于其他样品。在渥堆4 h和8 h上层样中含有的菌属较为接近,但Humicola菌属在渥堆4 h后上层样中最为丰富,随着渥堆时间增加该类菌属丰富度下降,同时尾柄孢壳属(Cercophora)和Lasiobolidium等菌属丰富度增加,这表明不同菌属丰富度随着渥堆的进行而改变。

2.2.3 渥堆中优势真菌分析

黟县黑茶渥堆中优势真菌分析结果见图4。由图4可知,通过真菌分类学鉴定,将黟县黑茶渥堆样中真菌分为主要优势真菌、其他真菌(others)、未确定种类真菌(unclassified)3大类。其中,主要优势真菌有9种,分别为亚隔孢壳属、枝孢属、Setophoma、链格孢属、白布勒担孢酵母、Zymoseptoria、镰孢霉属、Strelitziana、青霉菌属,其中亚隔孢壳属、枝孢属、Setophoma、链格孢属、白布勒担孢酵母在渥堆过程中占比超过50 %。

渥堆过程中不同层间主要优势真菌呈现动态变化趋势,比如上层渥堆样中,亚隔孢壳属、枝孢属、Setophoma、链格孢属占主要优势真菌的70%以上,后随着渥堆进行,丝孢菌属、Pseudallescheria、青霉菌属、球腔菌属等优势菌属占比增加[图4(a)];中层渥堆样中,亚隔孢壳属、枝孢属、Setophoma、链格孢属、白布勒担孢酵母、Zymoseptoria是主要的优势真菌(约占75%),后随着渥堆进行,曲霉菌属出现,且镰孢霉属占比显著提高[图4(b)];下层渥堆样中,亚隔孢壳属、枝孢属、Setophoma、链格孢属、白布勒担孢酵母、Zymoseptoria、Strelitziana占主要优势真菌90%以上,其中青霉菌属在渥堆中期(HC6)占比显著增加[图4(c)]。

不同层间优势真菌差异分析表明,在属水平下各层主要优势真菌种类基本相同,亚隔孢壳属、枝孢属、Setophoma、链格孢属等在渥堆过程中各层间占比都较高,其中在上层可检测到丝孢菌属、球腔菌属、Pseudallescheria,在中层可检测到曲霉菌属,在下层可检测到掷孢酵母属,表明渥堆过程中不同层间主要优势真菌相同,同时也存在一定特有的优势菌属。

2.3 渥堆对黟县黑茶品质成分的影响

2.3.1 渥堆对黟县黑茶挥发性化合物的影响分析

对黟县黑茶挥发性化合物进行分析,共检测出84种挥发性化合物,见附表1。其中未渥堆样品(HC0)与渥堆完成混合样品间(HC13)有27种化合物的相对含量呈现显著差异(P<0.05)。渥堆结束后,相对含量显著降低的挥发性成分共有8种,为正戊醛、(E)-4,8-二甲基壬-1,3,7-三烯、cis-3-己烯醇 2-甲基丁酸酯、茉莉酮、邻苯二甲酸二甲酯、γ-杜松烯、α-法呢烯、1,6-二甲基-4-(1-甲基乙基)萘;相对含量显著增加的化合物有19种,为2-甲基丁醛、(E)-2-庚烯醛、1-辛烯-3-酮、6-甲基-5-庚烯-2-酮、月桂烯、(+)-柠檬烯、苯乙醛、茶吡咯、芳樟醇、苯乙醇、水杨酸甲酯、藏红花醛、β-环柠檬醛、茶香螺烷、2-十一烯醛、β-紫罗兰酮、金合欢基乙醛、邻苯二甲酸二异丁酯、棕榈酸异丙酯。

渥堆对黟县黑茶挥发性化合物的影响见图5。由图5(a)可知,渥堆结束后,挥发性物质种类与渥堆前差异不大,但挥发性成分总量显著增加约1.39倍。糖苷类化合物芳樟醇、二氢芳樟醇、月桂烯、香叶醇、水杨酸甲酯在渥堆过程中显著增加,这可能是由于渥堆中高湿热和酶的作用,使得糖苷类物质发生水解导致[21],其中月桂烯对陈香、木香风味形成具有重要作用[22]。

基于PLS-DA模型对样品进行聚类分析[图5(b)],表明渥堆0 h(未渥堆)和16 h(渥堆完成)样品分别聚为一类,其中VIP值大于1挥发性物质共有16种[图5(c)],是渥堆导致样品间差异的关键物质。计算这16种挥发性物质的OAV,OAV大于1的化合物及其风味特征见表2。苯乙醛、芳樟醇氧化物Ⅱ、芳樟醇、二氢芳樟醇、壬醛、癸醛、香叶醇等主要呈现甜花香特征;月桂烯呈现木香与草药香;正戊醛、香叶基丙酮、水杨酸甲酯等以青草气特征为主,而N-乙吡啶、茶吡咯、萘等物质具有烘烤香特征(表2[23])。以7种关键香气物质(芳樟醇、二氢芳樟醇、月桂烯、香叶醇、苯乙醛、正戊醛、水杨酸甲酯含量)占总含量的百分比,构建样品香气风味轮(图6)。由图6可知,渥堆提升了成品茶花香和木香的风味特征,降低了青草气的风味特征。结果表明,渥堆有利于花香、木香类挥发性物质的增加,形成黟县黑茶香气风味特征。

2.3.2 渥堆对黟县黑茶主要滋味物质的影响分析

游离氨基酸、儿茶素、咖啡碱是茶叶中重要的滋味成分,尤其是儿茶素类物质在高温、湿热及酶的作用下,易发生氧化、降解、聚合等反应,对黑茶特征滋味形成具有重要贡献[24]。黟县黑茶渥堆前后主要滋味物质的含量变化见表3。研究表明,渥堆后儿茶素总量、酯型儿茶素总量显著降低,而游离氨基酸总量与咖啡碱含量变化不显著。渥堆使简单儿茶素含量与酯型儿茶素含量比值由0.82升至0.92,表明渥堆使得收敛性低的非酯型儿茶素类物质占比升高,可能对黟县黑茶苦涩滋味属性变化产生影响。通过PLA-DA对样品进行聚类分析(表4[25]),可知EGC、EGCG、CAF等为关键滋味物质,且主要呈现苦涩滋味属性。渥堆后EGCG含量显著降低,EGC、CAF有降低趋势但未达到显著性。为进一步分析渥堆对滋味风味的改变,以剂量比阈因子(dose-over-threshold factors,DOT)值将游离氨基酸、儿茶素、咖啡碱等物质呈味特性进行量化,分别计算样品中鲜甜、苦味、涩味的总DOT值,建立以鲜甜、苦味及涩味的DOT值占比样品总DOT值的滋味风味轮(图7)。结果显示,渥堆能够降低苦味,增加涩感和鲜甜风味。

3 讨 论

对黟县黑茶渥堆过程中真菌多样性分析发现,渥堆过程中主要的优势真菌为亚隔孢壳属、枝孢属、Setophoma、链格孢属、白布勒担孢酵母、Zymoseptoria、镰孢霉属、Strelitziana、青霉菌属。渥堆前后主要优势真菌相同,多为茶树内生真菌[26-27],推测渥堆中优势真菌来源于茶鲜叶。四川黑茶、普洱茶及六堡茶等渥堆工艺中优势真菌,主要为酵母、曲霉、青霉、根毛霉、塔宾曲霉、热带假丝酵母、烟曲霉[28-31],与本研究结果差异较大,推测是原料、渥堆工艺及外源环境等因素影响。Li等[32]在研究黑茶渥堆中微生物群落与内含成分的相关性,显示0～12 h的渥堆样中真菌多样性降低。张丹丹等[6]通过研究青砖茶渥堆发酵微生物的变化,表明渥堆3 d内霉菌及中、下层酵母数量呈现下降趋势,即物质变化主要以湿热反应为主。此外,Li等[33]研究表明,普洱茶渥堆发酵中在无微生物影响下,糖苷类、氨基酸及儿茶素类物质含量显著变化。黟县黑茶渥堆时间较短(16 h左右),真菌对品质形成的影响可能较弱,而渥堆中高湿热作用,可能是导致内含成分水解、氧化反应的重要因素,对黟县黑茶品质形成的影响较大。

分析渥堆对黟县黑茶香气风味形成的影响发现,渥堆使糖苷类香气物质发生水解,释放出芳樟醇氧化物Ⅱ、芳樟醇、二氢芳樟醇、香叶醇、月桂烯、水杨酸甲酯等香气物质,显著提升了花果香、木香等香气类型的占比,从而形成黟县黑茶香气风味。已有研究表明:枝孢属、链格孢属等能够产生与萜类代谢相关的功能酶[34-37]。孙一帆[38]通过研究6株野生甘草内生真菌特异性糖基酶,发现链格孢属等内生真菌能够产生与糖基代谢转移相关的酶。因此,枝孢属、链格孢属等内生真菌,在渥堆中可能参与了香气物质的代谢变化。同时,陈香、木香是黑茶特征香气风味,在渥堆中呈现陈香、木香的月桂烯含量显著增加,渥堆后香气百分占比增加,而水杨酸甲酯虽然渥堆后含量增加,但香气百分占比降低。由此说明,渥堆工艺使糖苷类香气物质发生了水解,从而改变了香气物质的含量与比值,向花香、木香风味生成,最终形成了黟县黑茶香气风味特征。

苦、涩、回甘等呈味物质赋予了黑茶醇香浓厚滋味,研究发现在黑茶渥堆高湿热环境下,苦涩味儿茶素发生剧烈氧化,含量显著降低,鲜甜类氨基酸与苦味咖啡碱未发生显著变化,通过滋味物质呈味重组,形成了黟县黑茶滋味风味。通过分析渥堆前后滋味风味轮和关键滋味物质,发现渥堆降低了苦味风味,增加了涩感和鲜甜风味。目前,普遍认为茶叶中苦、涩感物质主要为儿茶素、咖啡碱及黄酮苷类[39]。因而,实验研究中苦味的降低,与关键滋味物质EGCG在渥堆后显著降低有关,涩感的增加可能是黄酮苷类等物质转化生成导致,且黄酮苷类物质的涩感阈值比儿茶素类低很多。Wang等[40]在藏茶的渥堆研究中,阐述了EGCG是渥堆中关键代谢物,且显著降低,这与本研究结果相同。同时,张厅在研究四川黑茶中指出,槲皮素-3-葡萄糖苷在渥堆过程中呈现增加,是茶叶中涩味重要贡献物[2, 41]。由此说明:渥堆中滋味物质含量发生显著变化,通过滋味重组,形成了黟县黑茶滋味风味特征,其中EGCG为渥堆中变化的关键滋味物质,可降低茶汤的苦味风味。

4 结 论

利用高通量测序、气相色谱质谱、液相色谱及氨基酸分析仪对黟县黑茶渥堆中真菌多样性及品质成分分析,结果表明:黟县黑茶渥堆堆温在渥堆过程中呈现降低;渥堆中期真菌多样性最丰富,且上层多样性高于下层高于中层,亚隔孢壳属(Didymella)、枝孢属(Cladosporium)、Setophoma、链格孢属(Alter-naria)、白布勒担孢酵母(Bulleromyces)、Zymoseptoria、镰孢霉属(Fusarium)、Strelitziana、青霉菌属(Penicillium)等是黟县黑茶渥堆中的优势真菌,其中亚隔孢壳属、枝孢属、Setophoma、链格孢属、白布勒担孢酵母在渥堆过程中占比超过50 %;挥发性化合物分析显示,渥堆后挥发性物质总量显著增加(增加约1.39倍),其中芳樟醇、二氢芳樟醇、香叶醇、月桂烯、水杨酸甲酯等糖苷类香气物质相对含量显著增加,是影响香气变化的关键因子;主要滋味物质的变化显示,渥堆对游离氨基酸总量及咖啡碱含量的影响较小,对儿茶素类物质的影响较大,渥堆中儿茶素类物质总量下降了13%,且主要是酯型儿茶素类物质的降低。研究旨在为黟县黑茶加工与品质形成提供一定的理论基础。

附录:补充数据

与本文相关的补充数据可以在http:∥dx.doi.org/10.12301/spxb202300500在线版本中找到。

Appendix：supplementary data

Supplementary data associated with this article can be found in the online version, at http:∥dx.doi.org/10.12301/spxb202300500.

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Analysis of Fungi Diversity and Quality Formation of Yixian Dark Tea Pile-Fermentation

WANG Hui, ZHOU Hanchen, LIU Yaqin, YANG Jihong, LEI Pandeng*
(Tea Research Institute, Anhui Academy of Agricultural Sciences, Huangshan 245000, China)

Abstract：High-throughput sequencing was used to analyze the fungi diversity and dominant genera in Yixian dark teapile, and gas chromatography mass spectrometry (GC-MS), liquid chromatography (LC) and amino acid analyzer (AAC) were used to analyze the changes of volatile compounds and major taste substances in the samples before and after pile-fermentation.The results showed that the temperature of Yixian dark tea was the highest at the beginning of pile-fermentation, and then the temperature between the layers gradually decreased. The diversity of fungi was low at the beginning of pile-fermentation, and was the richest in the middle period (8-12 h), and the diversity of the upper layer of the pile-fermentation was higher than that of the lower layer, and the lower layer is higher than the middle layer. A total of nine dominant fungi including Didymella, Cladosporium, Setophoma, Alternaria, Bulleromyces, Zymoseptoria, Fusarium, Strelitziana and Penicillium were detected in pile-fermentation, with the Didymella, Cladosporium, Setophoma, Alternaria and Bulleromyces accounted for more than 50% of the total number of fungi in pile-fermentation.The study of volatile components and main taste substances of Yixian dark tea before and after pile-fermentation found that the total amount of volatile substances increased significantly after pile-fermentation, among which the relative content of glycosidic aromatic substances, such as dihydrolinalool, linalool, geraniol, lauric acid, methyl salicylate, and etc., increased significantly, which was a key factor influencing the change of aroma. The effect of pile-fermentation on the total amount of free amino acids and caffeine content was small, but the effect on catechin substances was big, and its total amount decreased by 13%, which was mainly decreased in ester-type catechin substances. The research explored the fungi diversity in Yixian dark tea pile-fermentation and the influence of pile-fermentation on quality formation, which provided a theoretical basis for the processing and quality formation of Yixian dark tea.

Keywords：dark tea; pile-fermentation; taste substance; fungi diversity; quality component

中图分类号：TS272.5

文献标志码：A

doi：10.12301/spxb202300500

文章编号：2095-6002(2024)05-0068-13

引用格式：王辉, 周汉琛, 刘亚芹, 等. 黟县黑茶渥堆中真菌多样性及品质形成分析[J]. 食品科学技术学报,2024,42(5):68-80.
WANG Hui, ZHOU Hanchen, LIU Yaqin, et al. Analysis of fungi diversity and quality formation of Yixian dark tea pile-fermentation[J]. Journal of Food Science and Technology, 2024,42(5):68-80.

收稿日期：2023-08-16

基金项目：黟科科技助力乡村振兴计划项目(2021KN-03);黄山市科技计划项目(2022KN-07);安徽省农业科学院成果转化项目(2023YL034);国家现代农业产业技术体系建设专项(CARS-19)。

Foundation： Yike Technology Helps Rural Revitalization Program (2021KN-03); Huangshan Science and Technology Plan Project(2022KN-07); Achievement Transformation Project of Anhui Academy of Agricultural Sciences(2023YL034); National Modern Agricultural Industry Technology System Construction Special Project (CARS-19).

第一作者：王 辉,男,助理研究员,主要从事茶叶加工与品质控制方面的研究。

*通信作者：雷攀登,男,副研究员,主要从事茶叶加工与生物化学方面的研究。

(责任编辑：李 宁)