妊娠期和哺乳期是子代骨骼生长发育的关键时期,对于子代获得理想身高、降低成年后骨折风险以及预防骨骼退化相关疾病至关重要[1]。生命早期骨骼可塑性强,易受营养状况和环境的影响,从而改变发育轨迹和代谢进程,对成年后骨骼健康产生长期影响[2-3]。因此,通过膳食干预改善生命早期的营养状况对于促进骨骼发育、降低成年后骨骼疾病的患病风险具有重要意义。

乳脂肪球膜(milk fat globule membrane, MFGM)是包裹在乳脂肪球表面的3层膜结构,富含极性脂质、特异性膜蛋白等多种活性组分[4]。本研究团队前期研究证实,MFGM不仅具有调节高脂饮食小鼠肠道菌群[5]、促进脂肪棕色化进程[6]、缓解肥胖及相关代谢紊乱[4]等多种生物学功能,而且在妊娠期和哺乳期补充富含极性脂质的MFGM还能够增强肥胖母鼠子代的骨生成能力,促进其骨骼发育,缓解成年子代的骨质流失[7]。然而,MFGM对正常饮食母鼠子代骨骼发育和骨骼健康的影响尚不明确。

本研究在母鼠的妊娠期和哺乳期补充MFGM,探究其对断奶前子代骨骼纵向生长和高脂饮食成年子代骨骼健康的保护作用,以期为生命早期营养干预和MFGM的开发应用提供理论指导。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

Lacprodan® MFGM-10,丹麦Arla公司;苏木素伊红(hematoxylin eosin, H&E)染色试剂盒、质量分数为4%的多聚甲醛固定液、脱脂乳粉、含吐温的Tris缓冲盐(Tris buffered saline with Tween,TBST)溶液,北京索莱宝科技有限公司;X型胶原(collagen type X, COLX)、II型胶原(collagen type 2α, COL2α)、Runt相关转录因子2(runt-related transcription factor 2, Runx2)、骨形态发生蛋白2(bone morphogenetic protein 2, BMP2)、骨保护素(osteoprotegerin, OPG)一抗,美国Abcam公司;核因子κ B受体活化因子配体(receptor activator for nuclear factor-κ B ligand, RANKL)一抗,美国proteintech公司;β-actin一抗,北京博奥森生物技术有限公司;GAPDH一抗,上海碧云天生物技术有限公司;辣根过氧化物酶标记山羊抗兔二抗、BCA蛋白检测试剂盒、蛋白酶磷酸酶抑制剂混合物、RIPA裂解液和Wes-tern blot一抗稀释液,上海碧云天生物技术有限公司;0.45 μm聚偏二氟乙烯(polyvinylidene difluoride, PVDF)膜、增强化学发光(enhanced chemiluminescence,ECL)液,美国Millipore公司;其他试剂均为分析纯。

雌性和雄性SD大鼠,北京维通利华实验动物技术有限公司;大鼠生长繁殖饲料,北京科澳协力饲料有限公司。实验程序均经中国农业大学动物伦理委员会批准(动物实验伦理编号KY180026)。

1.2 仪器与设备

EC530型组织石蜡包埋机和HM315型石蜡切片机,德国Microm公司;ST5020型组织染色机,德国Leica公司;BH2型正置显微镜,日本Olympus公司;iMARK型酶标仪和165-8001型电泳仪,美国Bio-Rad公司;Tannon5200型凝胶成像仪,北京原平皓生物技术有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 实验动物饲养与分组

将12～14周龄SD雌性大鼠随机分为对照组(Control组)和MFGM组,两组大鼠均按照雌雄比2∶1的比例与健康的10周龄SD雄性大鼠合笼,于次日观察,若发现阴栓则视为受孕成功。在妊娠期和哺乳期,MFGM组母鼠每天灌胃MFGM(400 mg/kg),Control组母鼠则灌胃相应体积的生理盐水,其中MFGM的剂量参照本课题组前期的研究确定[5-7]。孕鼠自然分娩后,子代进行母乳喂养直至出生后21 d。于出生时(第0天)、出生后第10天和第21天每窝分别处死1只雄性子代,待子代断奶后,剩余雄性子代则饲喂45%高脂饲料(即饲料中有45%的能量来自脂肪)直至14周龄,饲养期间所有大鼠均自由进食和饮水。

1.3.2 宏观生长指标的测定

断奶前子代处死后,利用天平测子代的体质量;利用游标卡尺测量子代的身长(鼻尖至肛门的距离)和尾长(肛门至尾尖的距离);分离子代的股骨和胫骨并剔除软组织后,利用游标卡尺测量子代的股骨和胫骨长度。

1.3.3 骨组织形态学观察

不同时期的子代处死后,快速分离股骨并剔除多余的软组织,置于4%多聚甲醛固定液中固定48 h。除出生时(第0天)子代股骨外,其余各时期子代股骨均利用10%EDTA脱钙液进行脱钙,直至大头针可以轻松戳穿。采用梯度酒精对其脱水后,进行石蜡包埋,并制成4 μm厚的石蜡切片,按照H&E染色试剂盒说明书对石蜡切片进行染色,利用正置光学显微镜进行观察。利用Image J软件对断奶前子代的生长板增殖区和肥大区软骨细胞的高度进行测量,对成年子代骨髓腔中脂肪细胞数目进行计数。

1.3.4 蛋白质相对表达量的测定

使用Western blot实验方法测定COL2α、COLX、Runx2、BMP2、OPG、RANKL蛋白的相对表达量。

取子代股骨远心端置于研钵中,加入液氮研磨成粉后,加入含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂的RIPA裂解液,在冰浴中进行匀浆,充分裂解细胞。在4 ℃、4 000 g的条件下离心15 min后吸取上清,利用BCA试剂盒测定蛋白质量浓度,然后利用5×(5倍)还原型上样缓冲液和裂解液调节各样本蛋白浓度至3 mg/mL,并于沸水中煮沸5 min。取15～20 μg蛋白进行SDS-PAGE电泳;电泳结束后,切取目标分子量蛋白胶条,利用湿转法将胶条上的蛋白转移至PVDF膜上;用0.05 g/mL的脱脂乳缓冲液封闭后,加入稀释后的一抗(所有一抗均利用一抗稀释液按照体积比1∶1 000稀释),于4 ℃下孵育过夜;用1×TBST液洗掉多余一抗后,加入辣根过氧化物酶标记的二抗,置于摇床上,室温下孵育1 h;利用1×TBST液洗掉多余抗体后,滴加ECL液,于凝胶成像仪中进行检测,并利用配套软件进行光密度分析。

1.3.5 白色脂肪组织含量的测定

检测成年子代的白色脂肪质量。取子代的腹股沟白色脂肪、附睾白色脂肪和肾周白色脂肪,测定脂肪指数,见式(1)。

脂肪指数=m(脂肪)/体质量×100%。

(1)

1.4 数据分析

实验数据以平均值±标准偏差表示。数据统计分析采用SPSS 23.0进行t Test分析,当P<0.05时,表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 MFGM对断奶前子代骨骼纵向生长的影响

为探究在母鼠妊娠期和哺乳期补充MFGM对断奶前子代骨骼生长发育的影响,分别测定了出生时(第0天)、出生后第10天和第21天子代的宏观生长指标,实验结果见图1。由图1可知,与Control组相比,MFGM组断奶前子代的体质量、身长、尾长、股骨长度和胫骨长度在各个时期均无显著性差异(P>0.05),说明在母鼠妊娠期和哺乳期补充MFGM对断奶前子代的骨骼纵向生长无显著影响。

图1 母鼠妊娠期和哺乳期补充MFGM对断奶前子代宏观生长指标的影响
Fig.1 Effects of maternal MFGM supplementation during pregnancy and lactation on macroscopic growth parameters of offspring before weaning

2.2 MFGM对断奶前子代长骨生长板组织形态和功能的影响

为进一步明确母鼠妊娠期和哺乳期补充MFGM对断奶前子代长骨生长的作用,分别观察了出生时(第0天)、出生后第10天和第21天子代股骨生长板组织形态,结果见图2。由图2(a)～(c)可知,母鼠妊娠期和哺乳期补充MFGM对各个时期断奶前子代生长板的增殖区和肥大区软骨细胞高度均无显著性影响(P>0.05)。为进一步探究母鼠补充MFGM对子代生长板软骨细胞功能的影响,测定了出生后第21天子代股骨干骺端COL2α和COLX的蛋白表达,见图2(d)。与Control组相比,MFGM组断奶子代股骨干骺端COL2α和COLX的蛋白表达无显著差异(P>0.05)。以上实验结果说明,在母鼠妊娠期和哺乳期补充MFGM对断奶前子代长骨生长板软骨细胞结构和功能无明显影响。

图2 母鼠妊娠期和哺乳期补充MFGM对断奶前子代生长板组织形态和功能的影响
Fig.2 Effects of maternal MFGM supplementation during pregnancy and lactation on morphology and function of growth plate of offspring before weaning

2.3 MFGM对高脂饮食成年子代肥胖的影响

为探究母鼠妊娠期和哺乳期补充MFGM对高脂饮食成年子代脂质积累的影响,分别检测了成年子代的体质量和白色脂肪指数,结果见图3。由图3可知,与Control组相比,在母鼠妊娠期和哺乳期补充MFGM能够显著减少成年子代由高脂饮食造成的体质量增加(P<0.05),降低腹股沟白色脂肪指数和附睾白色脂肪指数(P<0.05),但对肾周白色脂肪指数无显著性影响(P>0.05)。结果说明,在母鼠妊娠期和哺乳期补充MFGM能够显著缓解成年子代由高脂饮食导致的肥胖。

#表示与Control组相比存在显著性差异,P<0.05。

图3 母鼠妊娠期和哺乳期补充MFGM对成年子代体质量和脂肪指数的影响
Fig.3 Effects of maternal MFGM supplementation during pregnancy and lactation on body weight and fat index of adult offspring

2.4 MFGM对高脂饮食成年子代骨髓腔脂肪细胞积累的影响

为探究母鼠妊娠期和哺乳期补充MFGM对高脂饮食成年子代骨微结构的影响,对成年子代股骨骨髓腔脂肪细胞蓄积情况进行了检测,结果见图4。由图4可知,与Control组相比,MFGM组成年子代骨髓腔中脂肪细胞(绿色箭头所示)数目明显减少(P<0.05),说明在母鼠妊娠期和哺乳期补充MFGM能够有效减少成年子代由高脂饮食导致的骨髓腔脂质积累。

#表示与Control组相比存在显著性差异,P<0.05。

图4 母鼠妊娠期和哺乳期补充MFGM对成年子代骨髓腔脂肪细胞积累的影响
Fig.4 Effects of maternal MFGM supplementation during pregnancy and lactation on bone marrow adipocytes accumulation of adult offspring

2.5 MFGM对高脂饮食成年子代骨代谢的影响

为探究母鼠妊娠期和哺乳期补充MFGM对高脂饮食成年子代骨代谢的影响,分别对成年子代骨生成指标Runx2和BMP2以及骨吸收相关指标OPG和RANKL的蛋白表达进行检测,结果见图5。由图5可知,与Control组相比,MFGM组成年子代骨组织中Runx2的蛋白表达显著升高(P<0.05),BMP2的蛋白表达无显著性差异(P>0.05),可见MFGM可以有效促进高脂饮食成年子代的骨生成能力;同时,MFGM组骨组织中OPG的蛋白表达显著升高(P<0.05),而RANKL的蛋白表达显著下降(P<0.05),说明MFGM组成年子代的骨吸收能力降低。结果说明,母鼠妊娠期和哺乳期补充MFGM可以有效改善高脂饮食成年子代的骨代谢。

#表示与Control组相比存在显著性差异,P<0.05。

图5 母鼠妊娠期和哺乳期补充MFGM对成年子代骨代谢的影响
Fig.5 Effects of maternal MFGM supplementation during pregnancy and lactation on bone metabolism of adult offspring

3 讨 论

骨骼发育起始于胚胎时期,一直持续至成年。四肢骨发育以软骨内成骨的方式进行,位于生长板区域的软骨细胞不断经历增殖、肥大,分泌增殖软骨细胞特异性蛋白COL2α和肥大软骨细胞特异性蛋白COLX等胶原蛋白,合成软骨基质;同时成骨细胞通过血管潜入软骨基质进行骨生成作用,随后软骨基质逐渐被成熟骨代替,从而完成骨骼的生长[8]。生长板区域增殖软骨细胞以及肥大软骨细胞的形态与功能是决定长骨生长的主要因素之一。在本研究中,大鼠在妊娠期和哺乳期补充MFGM对断奶前子代的身长、尾长、股骨长度和胫骨长度均无显著影响,并且增殖软骨细胞和肥大软骨细胞的形态和功能也无明显变化,说明妊娠期和哺乳期补充MFGM对大鼠断奶前子代的骨骼纵向生长无显著作用。

成年后,骨骼发育停止,进入骨重建,即由成骨细胞介导的骨生成作用和破骨细胞介导的骨吸收作用维持骨量的动态平衡[9]。高脂饮食是影响成年后骨骼健康的重要因素之一。长期高脂饮食会导致骨髓腔脂肪细胞(bone marrow adipocytes, BMAs)过度积累[10]。BMAs是骨髓腔微环境的重要组成部分,BMAs数目与骨量呈负相关,是评价骨微结构的重要指标[11-12]。BMAs和成骨细胞均由骨髓间充质干细胞分化而来。当骨髓间充质干细胞向脂肪细胞分化增加时,其向成骨细胞分化的潜能下降,导致骨生成能力下降[13];此外,BMAs能够表达和分泌RANKL,刺激破骨细胞的生成和分化,加剧骨流失。生命早期的营养状况会对成年后的骨骼健康产生长远影响[14-15]。在母鼠妊娠期和哺乳期补充橘皮苷和柚皮苷,成年子代的皮质骨和松质骨质量显著增加[16];妊娠期和哺乳期补充橄榄油能够降低成年子代骨组织中脂肪细胞生成相关转录因子PPARγ的表达,增加骨生成相关因子β-catenin的表达,增加OPG/RANKL的比值,改善成年子代的骨代谢进程[17]。在本研究中,MFGM组高脂饮食成年子代骨髓腔中脂肪细胞的积累明显减少,骨生成关键蛋白Runx2和OPG的表达显著升高,骨吸收相关蛋白RANKL的表达显著下降,说明妊娠期和哺乳期补充MFGM能够有效预防子代由高脂饮食引起的骨代谢紊乱和骨微结构破坏。

在本研究中,大鼠在妊娠期和哺乳期补充MFGM显著改善了成年子代由高脂饮食导致的肥胖和白色脂肪蓄积。这一结果与Wang等[18]的研究相似,即妊娠期和哺乳期补充鱼油可以有效防止成年子代由高脂饮食导致的肥胖及相关代谢紊乱。白色脂肪组织可以通过分泌瘦素等脂肪细胞因子,参与调控成骨细胞的生成和破骨细胞的功能,从而对松质骨质量和骨代谢发挥调节作用[19]。因此,妊娠期和哺乳期补充MFGM对成年高脂饮食子代骨健康的保护作用在一定程度上与其调节脂代谢、减少脂质积累有关。另外,表观遗传学是生命早期营养状况影响骨骼发育和长期骨骼健康的重要调控机制之一[20]。妊娠期和哺乳期补充MFGM能否通过调控骨代谢相关蛋白的表观遗传修饰来直接发挥对子代骨骼的长远保护作用仍需进一步探究。

4 结 论

在母鼠妊娠期和哺乳期补充MFGM对断奶前子代的骨骼纵向生长无显著影响,但是可以有效缓解成年子代由高脂饮食导致的骨髓腔脂肪细胞积累,改善骨代谢进程,对成年子代的骨骼健康发挥长期保护作用。希望本研究可为MFGM在孕产妇乳粉中的应用提供理论依据和参考。

参考文献：

[1] ZHENG J, FENG Q Y, ZHENG S, et al. Maternal nutrition and the developmental origins of osteoporosis in offspring: potential mechanisms and clinical implications[J]. Experimental Biology and Medicine, 2018, 243(10): 836-842.

[2] SHI Y, SABEN J L, HE G X, et al. Diet-induced metabolic dysregulation in female mice causes osteopenia in adult offspring[J]. Journal of the Endocrine Society, 2020, 4(4): bvaa028.

[3] BUCKELS E J, BOLAM S M, TAY M L, et al. The impact of maternal high-fat diet on bone microarchitecture in offspring[J]. Frontiers in Nutrition, 2021, 8: 730037.

[4] LI T G, YUAN Q C, GONG H, et al. Gut microbiota mediates the alleviative effect of polar lipids-enriched milk fat globule membrane on obesity-induced glucose metabolism disorders in peripheral tissues in rat dams[J]. International Journal of Obesity, 2022, 46(4): 793-801.

[5] LI T G, GAO J, DU M, et al. Milk fat globule membrane supplementation modulates the gut microbiota and attenuates metabolic endotoxemia in high-fat diet-fed mice[J]. Journal of Functional Foods, 2018, 47: 56-65.

[6] LI T G, GAO J, DU M, et al. Milk fat globule membrane attenuates high-fat diet-induced obesity by inhibiting adipogenesis and increasing uncoupling protein 1 expression in white adipose tissue of mice[J]. Nutrients, 2018, 10(3): 331.

[7] HAN L H, DU M, REN F Z, et al. Milk polar lipids supplementation to obese rats during pregnancy and lactation benefited skeletal outcomes of male offspring[J]. Molecular Nutrition &Food Research, 2021, 65(15): e2001208.

[8] FERGUSON J W, ATIT R P. A tale of two cities: the genetic mechanisms governing calvarial bone development[J]. Genesis, 2019, 57(1): e23248.

[9] RAMASWAMY G, KIM H, ZHANG D Y, et al. Gsα controls cortical bone quality by regulating osteoclast differentiation via cAMP/PKA and β-catenin pathways[J]. Scientific Reports, 2017, 7: 45140.

[9] SCHELLER E L, KHOURY B, MOLLER K L, et al. Changes in skeletal integrity and marrow adiposity during high-fat diet and after weight loss[J]. Frontiers in Endocrinology, 2016, 7: 102.

[10] SHEN W, VELASQUEZ G, CHEN J, et al. Comparison of the relationship between bone marrow adipose tissue and volumetric bone mineral density in children and adults[J]. Journal of Clinical Densitometry, 2014, 17(1): 163-169.

[11] WANG L P, ZHANG H, WANG S C, et al. Bone marrow adipocytes: a critical player in the bone marrow microenvironment[J]. Frontiers in Cell and Developmental Biology, 2021, 9: 770705.

[12] CAO J J, GREGOIRE B R, MICHELSEN K G, et al. Deficiency of PPARγ in bone marrow stromal cells does not prevent high-fat diet-induced bone deterioration in mice[J]. The Journal of Nutrition, 2021, 151(9): 2697-2704.

[14] FAN R, TONEY A M, JANG Y, et al. Maternal n-3 PUFA supplementation promotes fetal brown adipose tissue development through epigenetic modifications in C57BL/6 mice[J]. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Molecular and Cell Biology of Lipids, 2018, 1863(12): 1488-1497.

[15] GARCEZ M L, MINA F, BELLETTINI-SANTOS T, et al. Folic acid supplementation in the gestational phase of female rats improves age-related memory impairment and neuroinflammation in their adult and aged offspring[J]. The Journals of Gerontology Series A, Biological Sciences and Medical Sciences, 2021, 76(6): 991-995.

[16] SACCO S M, SAINT C, LEBLANC P J, et al. Nutritional programming of bone structure in male offspring by maternal consumption of Citrus flavanones[J]. Calcified Tissue International, 2018, 102(6): 671-682.

[17] MOUSAVI S N, KOOHDANI F, ESLAMINEJAD M B, et al. Extra virgin olive oil in maternal diet increases osteogenic genes expression, but high amounts have deleterious effects on bones in mice offspring at adolescence[J]. Iranian Journal of Basic Medical Sciences, 2016, 19(12): 1299-1307.

[18] WANG D D, WU F, ZHANG L Y, et al. Effects of dietary n-3 PUFA levels in early life on susceptibility to high-fat-diet-induced metabolic syndrome in adult mice[J]. The Journal of Nutritional Biochemistry, 2021, 89: 108578.

[19] FRECHETTE D M, KRISHNAMOORTHY D, PAMON T, et al. Mechanical signals protect stem cell lineage selection, preserving the bone and muscle phenotypes in obesity[J]. Annals of the New York Academy of Sciences, 2017, 1409(1): 33-50.

[20] BELLVER J, MARIANI G. Impact of parental over-and underweight on the health of offspring[J]. Fertility and Sterility, 2019, 111(6): 1054-1064.

Effects of Milk Fat Globule Membrane Supplementation to Rats During Pregnancy and Lactation on Bone Growth and Bone Health of Offspring

HAN Lihua1, 2, MAO Xueying 1, *
(1.College of Food Science and Nutritional Engineering/Key Laboratory of Functional Dairy, Ministry of Education, China Agricultural University, Beijing 100083, China; 2.Culinary Science and Technology Department, Jiangsu College of Tourism, Yangzhou 225000, China)

Abstract：The effects of maternal milk fat globule membrane (MFGM) supplementation on skeletal growth and bone health of offspring were investigated. During pregnancy and lactation, SD female rats were orally administrated with MFGM at a dose of 400 mg/kg. Offspring were weaned at postnatal day 21 and subsequently fed a high-fat diet until postnatal week 14 (adulthood). The longitudinal bone growth parameters of offspring were determined at birth (postnatal day 0), postnatal day 10 and 21. Obesity and bone health state of adult offspring rats were determined at postnatal week 14. Compared with the control group, no significant differences in body weight, body length, tail length, femur length and tibia length of offspring before weaning were found in maternal MFGM supplemented group. Similarly, there were no marked changes in the heights of proliferative and hypertrophic chondrocytes in the growth plate, nor in the expression levels of collagen type 2α (COL2α) and collagen type X (COLX), which are specific to proliferative and hypertrophic chondrocytes, respectively. However, maternal MFGM supplementation during pregnancy and lactation significantly reduced the body weight gain and accumulation of white adipose tissue caused by the high-fat diet in adult offspring compared to the control group. The number of bone marrow adipocytes was notably decreased, while the protein expression of Runx2 and OPG was upregulated significantly, and RANKL expression was downregulated significantly in the MFGM group. Although maternal MFGM supplementation had no significant effect on the longitudinal skeletal growth of pre-weaning offspring, it effectively mitigated the high-fat diet-induced accumulation of bone marrow adipocytes and improved bone metabolism in adult offspring. The study suggested that maternal supplementation with MFGM provided long-term protective effects on bone health of adult offspring.

Keywords：milk fat globule membrane; early life; maternal nutrition; bone growth; bone health

中图分类号：TS252.1

文献标志码：A

doi：10.12301/spxb202200936

文章编号：2095-6002(2024)05-0033-08

引用格式：韩立华, 毛学英. 母鼠妊娠期和哺乳期补充乳脂肪球膜对其子代骨骼生长和骨骼健康的影响[J]. 食品科学技术学报,2024,42(5):33-40.
HAN Lihua, MAO Xueying. Effects of milk fat globule membrane supplementation to rats during pregnancy and lactation on bone growth and bone health of offspring [J]. Journal of Food Science and Technology, 2024,42(5):33-40.

收稿日期：2022-06-05

基金项目：国家自然科学基金资助项目(31871806); 家畜产业技术体系北京市创新团队项目(BAIC05-2022)。

Foundation： National Natural Science Foundation of China (31871806); Beijing Livestock Industry Innovation Team Project (BAIC05-2022).

第一作者：韩立华,女,讲师,博士,主要从事功能乳品方面的研究。

*通信作者：毛学英,女,教授,博士,博士生导师,主要从事功能乳品方面的研究。

(责任编辑：李 宁)