枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)等许多杆菌属和梭菌属的细菌在缺乏营养的条件下会形成休眠的芽孢[1]。低强度杀菌处理后食品中仍会有残存芽孢被检出,导致食源性疾病和食品腐败[2]。枯草芽孢杆菌属于需氧型非致病革兰氏阳性菌,广泛分布于各类加工食品中,其芽孢难以被杀灭,对包括热、化学物质和超高压在内的各种杀菌措施都具有极端抗性[3]。芽孢的极端抗性与多种因素有关,其中最主要的是芽孢的结构[4]。芽孢通常由7层结构组成,从里向外分别是核心、内膜、细胞壁、皮层、外膜、芽孢衣和孢外壁。由于芽孢核心中含有大量Ca2+-DPA(2,6-吡啶二羧酸,2,6-pyridinedicarboxylic acid,DPA)螯合物,使得芽孢核心的含水量极低,因而表现出极强的耐热性;芽孢核心中还存在着大量的小分子酸溶性蛋白,可与DNA结合并保护DNA。芽孢内膜位于皮层和细胞壁内侧,由磷脂双分子层组成,其脂质具有高度不流动性,甚至对水分子都具有极端不通透性,是芽孢的主要渗透屏障和重要保护结构[5-7]。

高压热杀菌(high-pressure thermal sterilization,HPTS)是通过超高压和热的协同处理,在较低的温度下有效灭活细菌芽孢的技术。在相同杀菌效果下,HPTS所用温度比传统热杀菌的温度更低,对食品营养和感官品质的影响更小[8-9]。食品成分和食品添加剂会影响HPTS的杀菌效果[10]。D-果糖作为常见食品成分,存在于水果、蜂蜜和一些加工食品中,其对HPTS处理过程中细菌芽孢的影响机制鲜有报道。在传统果酱中D-果糖含量可高达30%以上,常用的甜味剂果葡糖浆中也含有大量的D-果糖[11-12]。本研究拟选择质量分数为15%和30%的D-果糖溶液进行实验,同时为了拓展理论研究深度,设置了质量分数60%的D-果糖溶液组;高压杀菌压力以200 MPa和600 MPa作为中等高压(moderate high pressure,MHP)(50～300 MPa)和超高压(very high pressure,VHP)(350～900 MPa)的代表进行实验。以处理前后芽孢核心水化、孢内DPA释放、芽孢蛋白质结构的稳定性、内膜通透性和内膜磷脂相态变化等为主要检测指标,拟探究HPTS处理时不同质量分数D-果糖对枯草芽孢杆菌芽孢灭活的抑制机制。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)As 1.433,中国普通微生物菌种保藏管理中心;营养琼脂,广东环凯微生物科技有限公司;D-果糖(分析纯),西陇生物科技有限公司;硫酸锰(分析纯),上海易恩化学技术有限公司;DPA(分析纯),广州市江顺化工科技有限公司;胰酪胨大豆酵母浸膏琼脂(trypticase soy yeast extract agar,TSA-YE)培养基、碘化丙啶(propidium iodine,PI)(纯度99%)、醋酸钠(纯度99%)、抗坏血酸(纯度99%)、硫酸亚铁铵(纯度99%),南通飞宇生物科技有限公司;溴化钾(光谱级),美国Sigma-Aldrich公司。

1.2 仪器与设备

XFH-50CA型电热式压力蒸汽灭菌器,浙江新丰医疗器械有限公司;WB100-4型数显恒温水浴锅,浙江群安科学仪器有限公司;LDH型全自动生化培养箱,常州冠军仪器制造有限公司;GL-10C型高速冷冻离心机,上海安亭科学仪器有限公司;HPP-600 MPa-5 L型超高压设备(液体介质),包头科发高压科技有限公司;UV-9000S型紫外-可见分光光度计,上海元析仪器有限公司;HY-4D型往复式振荡器,常州亚特实验仪器有限公司;TC-15型真空冷冻干燥机,松源华兴科技发展有限公司;CJ-4A型流式细胞仪,日本Sysmex株式会社;IR-1600型傅里叶变换红外光谱仪,天津市精拓仪器科技有限公司;无菌聚乙烯真空袋封装,沧州景坤塑业有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 枯草芽孢杆菌芽孢悬浮液制备

枯草芽孢杆菌芽孢的培养与悬浮液制备参照Rao等[13]的方法并略加修改。在无菌操作条件下,将活化3代的枯草芽孢杆菌划线接种至含有硫酸锰的营养琼脂培养基,37 ℃下培养7 d。用无菌水洗涤斜面培养基上的芽孢,过筛(400目)以去除琼脂等杂质并收集到离心管中。于4 ℃、9 000 r/min 离心洗涤15 min,重复3次。通过控制无菌蒸馏水的添加量调节芽孢含量约为1.5×109 CFU/mL,在 4 ℃下保存。每次实验前对芽孢悬浮液进行80 ℃水浴处理15 min,杀灭残存的枯草芽孢杆菌营养体。

1.3.2 不同质量分数D-果糖的抑制作用测定

将30 mL枯草芽孢杆菌芽孢悬浮液加入离心管中,离心(4 ℃、9 000 r/min)15 min,弃去上清液,加入配制好的等体积D-果糖溶液(质量分数为0、15%、30%、60%),振荡使其充分混匀。制备好的样品用无菌聚乙烯真空袋密封包装,待超高压机器预热到指定条件后将其放入加压腔;在控制面板中设置输入6组处理参数(200 MPa-25 ℃、200 MPa-65 ℃、200 MPa-75 ℃、600 MPa-25 ℃、600 MPa-65 ℃、600 MPa-75 ℃),处理时间为20 min。压制完毕后立即进行冰水浴冷却,随即放入4 ℃冰箱保存。

1.3.3 枯草芽孢杆菌芽孢的菌落平板计数

活细胞平板计数参照Meng等[14]的方法并稍加修改。将处理前后的芽孢悬浮液进行梯度稀释,在37 ℃下于TSA-YE培养基上培养24～48 h,统计存活芽孢的数量。以GB 4789.2—2022《食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数测定》的方法进行计数。

1.3.4 枯草芽孢杆菌芽孢悬浮液浑浊度的测定

取不同处理后的芽孢悬浮液3.5 mL,充分振荡混匀后,于600 nm处测定吸光度,每个处理设置3个平行,以未处理组的芽孢悬浮液作为阳性对照,以无菌水为空白对照,测定前用蒸馏水校正仪器。

1.3.5 枯草芽孢杆菌芽孢悬浮液DPA泄漏率的测定

DPA的释放可以表征芽孢内膜通透性的变化,并引起芽孢核心的水化,所以对处理前后的芽孢悬浮液DPA含量进行检测,检测方法按照Zhang等[15]的文献并略加修改。分别配制10、20、40、80、120、160、200 μg/mL DPA标准溶液4 mL,向其中加入1 mL DPA色测反应液(100 mL 0.55 mol/L醋酸钠、1 g抗坏血酸、1 g硫酸亚铁铵,pH值为5.5),振荡混匀。静置1.5 h后,于440 nm处测定混合液吸光度,绘制标准曲线。将处理前后的芽孢悬浮液离心(4 ℃、9 000 r/min)15 min,取4 mL上清液与1 mL色测反应液混匀,静置1.5 h后,于440 nm处测定混合液吸光度,对照标准曲线计算DPA释放量。以121 ℃-30 min处理组的DPA释放量为阳性对照,DPA泄漏率计算见式(1)。

ρ=(ρb-ρa)/ρ0×100%。

(1)

式(1)中,ρb表示不同处理条件下样品上清液中DPA质量浓度,μg/mL;ρa表示未处理样品上清液中DPA质量浓度,μg/mL;ρ0表示121 ℃-30 min处理条件下样品上清液中DPA质量浓度,μg/mL。

1.3.6 枯草芽孢杆菌芽孢悬浮液紫外吸收物质泄漏量的测定

取5 mL处理前后的芽孢悬浮液离心(4 ℃、9 000 r/min)15 min,收集上清液,利用紫外-可见分光光度计分别测定260、280 nm处的吸光度,每个处理设置3个平行,以无菌水为空白对照。

1.3.7 枯草芽孢杆菌芽孢内膜完整性的测定

参照Mathys等[16]的方法并略加修改。将芽孢悬浮液的含量稀释为107 CFU/mL,取芽孢悬浮液 5 mL,调节PI染色液质量浓度为0.3 μg/mL,室温下避光孵育15 min。染色结束后,离心去上清液,加入等量无菌水洗涤2次,以去除游离的染色剂。用流式细胞仪在488 nm激发光、615 nm发射光处检测前向散射光(FSC)、侧向散射光(SSC)及荧光通道FL2。

1.3.8 枯草芽孢杆菌芽孢蛋白质结构和膜脂质相态变化的测定

通过傅里叶变换红外光谱(Fourier transform infrared spectrometer,FT-IR)分析处理前后枯草芽孢杆菌芽孢蛋白质结构和膜脂质相态的变化情况。检测方法参照Liu等[17]的研究并略加修改。将处理前后的芽孢悬浮液离心去除上清液后真空冻干,将样品与干燥溴化钾粉末以质量比1∶150研磨混匀后,用压片机压制成片。以纯溴化钾压片为背景,于 4 000～500 cm-1处进行扫描,扫描次数为32次,分辨率为4 cm-1。由于二阶导数谱图可以将原谱图中微小的差别区分得更为明显[18],所以对原谱图数据进行了二阶导数处理。

1.4 数据处理

所有实验至少重复3次,使用IBM SPSS 19软件进行数据分析,使用Origin 2022和Peakfit软件绘图。实验结果以平均值±标准偏差表示,通过单因素ANOVA检验进行显著性分析(P<0.05)。

2 结果与分析

2.1 D-果糖对HPTS处理后枯草芽孢杆菌芽孢存活数量的影响

图1比较了不同质量分数D-果糖对HPTS处理的枯草芽孢杆菌芽孢存活数量的影响。在25 ℃时,单独高压处理对芽孢基本无灭活效果,且加入不同质量分数D-果糖后,对芽孢的存活数量无显著影响(P>0.05)。未添加D-果糖时,200 MPa结合65、75 ℃热处理后芽孢存活数量分别为5.20、4.01 lg(CFU/mL); 600 MPa结合65、75 ℃热处理后芽孢存活数量分别为4.12、2.87 lg(CFU/mL),由对照组芽孢存活数量可知,芽孢分别死亡了4.06、5.31 lg(CFU/mL)。表明相同压力条件下,随着温度的升高,枯草芽孢杆菌芽孢存活数量显著下降 (P<0.05)。当D-果糖质量分数增加至60%时,200 MPa 结合65、75 ℃热处理后芽孢存活数量分别为6.36、5.16 lg(CFU/mL),较未添加D-果糖处理组上升了1.16、1.15 lg(CFU/mL);600 MPa结合65、75 ℃热处理后芽孢存活数量分别为5.62、4.56 lg(CFU/mL),较未添加D-果糖处理组上升了1.50、1.69 lg(CFU/mL)。在同一处理温度下,随着压力的升高,D-果糖对芽孢灭活的抑制效果更大,这可能与D-果糖引起的渗透压变化有关。张变飞等[10]研究发现,吐温80能够削弱HPTS对枯草芽孢杆菌芽孢的灭活效果,在200 MPa、75 ℃处理下,质量分数为0.5%的吐温80对芽孢灭活产生了抑制作用。实验表明,HPTS处理时,随着D-果糖质量分数的增加,枯草芽孢杆菌芽孢存活数量显著上升(P<0.05)。即D-果糖在温压结合处理的物理场中对枯草芽孢杆菌芽孢灭活有抑制作用,陈翔[19]研究发现,HPTS结合饱和氯化钠对枯草芽孢杆菌芽孢灭活也具有抑制作用,且随着温度压力的提升而增强。Reineke等[20]的研究表明,压力和温度的组合 (0.1～600.0 MPa和50～70 ℃)直接影响枯草芽孢杆菌芽孢内膜或膜通道蛋白,导致芽孢核心水化,抗性极度降低,随后失活。申瑾等[21]研究发现,HPTS处理对芽孢内膜造成了严重的损伤,并使其通透性增大,芽孢的存活率下降。HPTS处理时,添加不同质量分数D-果糖使芽孢存活率增大,这可能是D-果糖对芽孢内膜作用的结果。因此,针对芽孢内膜的通透性及完整性进行进一步研究,探究不同质量分数D-果糖对芽孢灭活的抑制作用机制。

不同小写字母表示组间差异显著(P<0.05)。

图1 D-果糖不同质量分数时HPTS处理前后枯草芽孢杆菌芽孢存活数量的变化

Fig.1 Changes in survival quantity of Bacillus subtilis spores before and after HPTS treatment with different mass fractions of D-fructose

2.2 D-果糖对HPTS处理后枯草芽孢杆菌芽孢悬浮液浑浊度的影响

芽孢核心水化程度与其折光性及抗逆性呈负相关[5]。通过测定HPTS处理前后芽孢悬浮液在 600 nm 处的吸光度可表征不同质量分数D-果糖对HPTS处理的枯草芽孢杆菌芽孢核心水化程度的影响(图2)。由图2可知,未处理样品的OD600为0.99。在未添加D-果糖的条件下,单独HPTS处理后芽孢核心水化的程度增加,OD600显著下降(P<0.05),在600 MPa-75 ℃条件下出现最低值为0.41。这可能是因为HPTS破坏了芽孢内膜的通透性,使得大量水分子进入芽孢造成核心水化和芽孢死亡[22-23]。600 MPa-75 ℃条件下,不同质量分数D-果糖(15%、30%、60%)处理后,芽孢悬浮液OD600分别为0.45、0.48、0.50,较未添加D-果糖处理分别上升了0.04、0.07、0.09。随着D-果糖质量分数的增加,芽孢悬浮液OD600显著上升(P<0.05),说明内膜对水分子的通透性以及核心水化程度下降。陈翔[19]研究发现,在相同HPTS处理条件下,氯化钠质量分数为15%时,枯草芽孢杆菌死亡量最大,芽孢悬浮液的OD600最低,但在质量分数25%和饱和氯化钠溶液中,芽孢死亡量下降,芽孢悬浮液的OD600上升。随着氯化钠质量分数的提高,芽孢悬浮液的OD600呈现先下降后上升的趋势,这与本研究结果有差异,可能是因为D-果糖是非电解质,而氯化钠是电解质,两者对枯草芽孢杆菌芽孢的作用机制不同。

不同小写字母表示组间差异显著(P<0.05)。

图2 D-果糖不同质量分数时HPTS处理前后枯草芽孢杆菌芽孢悬浮液浑浊度的变化

Fig.2 Changes in turbidity of suspensions of Bacillus subtilis spores before and after HPTS treatment with different mass fractions of D-fructose

2.3 D-果糖对HPTS处理后枯草芽孢杆菌芽孢DPA泄漏率的影响

DPA是细菌芽孢的特有物质,当芽孢萌发或内膜受到破坏时会从核心释放,使得芽孢杀菌抗性丧失,最终经HPTS处理后杀灭。以200～500 MPa和500 MPa以上压力处理时,DPA的释放机制有所不同。200～500 MPa时,压力激活萌发受体诱导芽孢萌发并释放DPA;超过500 MPa时,压力直接打开了DPA的膜蛋白释放通道[1,24-26]。图3为不同质量分数D-果糖对HPTS处理的枯草芽孢杆菌芽孢DPA泄漏率的影响。由图3可知,当处理条件为 200 MPa 结合25、65、75 ℃热处理时,未添加D-果糖的芽孢DPA泄漏率分别为21.33%、62.31%、78.07%;25 ℃时,200 MPa处理会诱导芽孢萌发而释放DPA,当温度升高到65、75 ℃时,压力和热耦合后,DPA的泄漏由芽孢内膜损伤引起。处理压力上升到600 MPa时,未添加组芽孢DPA泄漏率分别为37.23%、86.65%、93.56%。随着压力、温度的升高,枯草芽孢杆菌芽孢DPA泄漏率均显著上升(P<0.05)。200 MPa结合25、65、75 ℃热处理条件下,60% D-果糖添加组较15% D-果糖添加组的DPA泄漏率分别下降了3.41%、8.29%、11.68%。600 MPa处理组添加D-果糖后同样呈现下降趋势。结果表明,添加D-果糖阻止了DPA的泄漏,进而减少了芽孢萌发和水化情况,使芽孢在HPTS处理后存活率上升,这与芽孢存活数量和芽孢悬浮液浑浊度的结果吻合。与张变飞等[10]发现质量分数0.5%吐温80溶液降低了DPA的释放的研究结果一致。

不同小写字母表示组间差异显著(P<0.05)。

图3 D-果糖不同质量分数时HPTS处理后枯草芽孢杆菌芽孢DPA泄漏率的变化

Fig.3 Changes in DPA leakage rate of Bacillus subtilis spores after HPTS treatment with different mass fractions of D-fructose

2.4 D-果糖对HPTS处理后枯草芽孢杆菌芽孢紫外吸收物质泄漏量的影响

孢内大分子如紫外吸收物质(核酸和蛋白质)的泄漏情况常被用来表征细胞膜通透性,其中核酸在260 nm处有最大紫外吸收峰,蛋白质在280 nm处有最大紫外吸收峰。图4为不同质量分数 D-果糖对HPTS处理的枯草芽孢杆菌芽孢紫外吸收物质泄漏量的影响。处理前芽孢悬浮液的OD260、OD280分别为0.06、0.04。由图4可知,在未添加D-果糖时,相同压力条件下,随着温度的升高芽孢紫外吸收物质泄漏量显著增加(P<0.05),表明枯草芽孢杆菌芽孢内膜的通透性增加。600 MPa-75 ℃处理后,芽孢的紫外吸收物质出现最大泄漏量(OD260=0.50、OD280=0.46)。添加D-果糖后,芽孢的紫外吸收物质泄漏量与单独HPTS处理组相比显著下降 (P<0.05),且随着D-果糖质量分数的上升而下降。表明D-果糖的添加可以降低芽孢内膜的通透性,且D-果糖的质量分数越高效果越好,这与芽孢悬浮液浑浊度的变化情况一致。

不同小写字母表示组间差异显著(P<0.05)。

图4 D-果糖不同质量分数时HPTS处理前后枯草芽孢杆菌芽孢紫外吸收物质泄漏量的变化

Fig.4 Changes in leakage of ultraviolet absorbing substances of Bacillus subtilis spores before and after HPTS treatment with different mass fractions of D-fructose

2.5 D-果糖对HPTS处理后枯草芽孢杆菌芽孢内膜完整性的影响

芽孢内膜通透性的变化可能与芽孢内膜的损伤有关,而PI能够穿过受损的细胞膜并与DNA结合发出强烈的红色荧光,所以可采用流式细胞术来检测芽孢内膜的受损情况[27]。图5为HPTS处理后不同质量分数D-果糖添加组的枯草芽孢杆菌芽孢流式细胞仪检测结果,其中M1为阴性区域,表示芽孢内膜未受损,M2为阳性区域,表示芽孢内膜受损。对照组M2区域占比为1.73%,说明此时芽孢内膜较为完整,PI无法透过芽孢内膜与DNA结合。与对照组相比,200 MPa结合75 ℃和600 MPa结合 75 ℃ 处理后芽孢内膜被严重破坏,M2区域占比均显著增大(P<0.05)。实验表明,处理压力和温度可以直接影响枯草芽孢杆菌芽孢内膜的完整性。在添加D-果糖后,芽孢样品荧光强度减弱,荧光分布直方图整体左移。特别是600 MPa-75 ℃条件下,较单独HPTS处理,添加质量分数为60% D-果糖后,M2区域芽孢比率显著降低了20.74个百分点。其他处理组的实验结果同样表明:添加D-果糖后M2区域芽孢比率较单独HPTS处理都有不同程度的下降,说明内膜受损的芽孢数量减少。张变飞等[10]研究结果也表明,加入不同质量分数吐温80后均能降低HPTS对芽孢内膜完整性的破坏,与本研究结果相似。芽孢内膜损伤是引起芽孢死亡的主要原因[23],流式细胞术检测结果和芽孢存活数量实验结果一致。

M1为阴性区域,表示芽孢内膜未受损,M2为阳性区域,表示芽孢内膜受损。

图5 D-果糖不同质量分数时HPTS处理前后枯草芽孢杆菌芽孢内膜完整性的变化

Fig.5 Changes in intima integrity of Bacillus subtilis spores before and after HPTS treatment with different mass fractions of D-fructose

2.6 D-果糖对HPTS处理后枯草芽孢杆菌芽孢蛋白质结构和膜脂质相态变化的影响

FT-IR可检测细菌膜脂质、蛋白质和核酸中含有的极性分子振动吸收峰的变化,峰强可以定量分析生物分子,而峰位置(波数)可以定性分析生物分子[28]。因此,利用FT-IR测定不同处理前后膜脂质(3 000～2 800 cm-1)、蛋白质(1 700～1 600 cm-1) 和核酸(1 300～900 cm-1)的变化情况[29],见图6。傅里叶红外光谱数据表明:位于 1 300～900 cm-1波段中表征芽孢核酸骨架振动变化的特征吸收峰,在处理前后其峰强、峰位均未发生明显的、有规律的变化;而3 000～2 800 cm-1和1 700～1 600 cm-1 波段的傅里叶红外光谱在不同处理条件下表现出有规律的变化。

图6 D-果糖不同质量分数时HPTS处理后枯草芽孢杆菌芽孢的红外二阶导数分析

Fig.6 Infrared second-order derivative analysis of Bacillus subtilis spores after HPTS treatment with different mass fractions of D-fructose

2.6.1 芽孢膜脂质的变化分析

未添加组经HPTS处理后,在2 874、2 962 cm-1处甲基(—CH3)的对称和反对称伸缩振动吸收峰没有明显变化;2 852、2 922 cm-1处亚甲基(CH2)的对称和反对称伸缩振动吸收峰随温度升高峰强减弱、发生蓝移,表明HPTS处理使细胞膜脂质的脂肪酰基链被破坏,进而导致芽孢内膜脂质相态改变、流动性增加。D-果糖不同质量分数时,2 852 cm-1处的吸收峰峰位置无明显变化,但随着D-果糖质量分数的增加峰强显著下降,表明D-果糖的加入,使膜脂质的稳定性增强。其中,D-果糖质量分数为60%时,600 MPa-75 ℃处理后,2 922 cm-1处的吸收峰蓝移至2 926 cm-1处,峰强明显减弱。结果表明,D-果糖的加入使得HPTS处理后芽孢内膜脂质酰基化程度更显著,相态由液晶态转变为凝胶态,稳定性增强、流动性降低,进一步证实了D-果糖对芽孢灭活的抑制作用。

2.6.2 芽孢蛋白质二级结构含量的变化分析

位于1 700～1 600 cm-1处的红外吸收峰主要表征蛋白酰胺Ⅰ带的变化,涉及肽链CO伸缩振动和N—H面内弯曲振动等[30]。Baltacolu等[30]发现,α-螺旋集中于1 660～1 650 cm-1处,β-折叠集中于 1 640～1 600 cm-1处,β-转角集中于1 690～1 660 cm-1处,无规卷曲集中于1 650～1 640 cm-1处。对不同处理组1 700～1 600 cm-1处的红外光谱进行分峰拟合,定量分析芽孢蛋白质二级结构的变化情况,结果见图7。由图7可以看出,未处理的枯草芽孢杆菌芽孢酰胺Ⅰ带中有序二级结构(α-螺旋、β-折叠)的含量为60%;经HPTS处理后,未添加D-果糖处理组中蛋白质的α-螺旋与β-折叠均减少,600 MPa-75 ℃处理条件下,有序二级结构含量显著下降了27个百分点。说明HPTS使得芽孢蛋白质变性,结构由有序状态向无序状态转变。蛋白质二级结构的改变,会直接影响其功能特性,使得芽孢抗性降低,最终被灭活。HPTS处理下,随着D-果糖质量分数的增加,芽孢蛋白质α-螺旋、β-折叠结构含量增加,β-转角、无规卷曲结构含量减少。表明D-果糖削弱了HPTS对芽孢蛋白质的损伤效果,有效维持了蛋白质二级结构的有序状态,增加了蛋白质的稳定性。张变飞等[10]研究发现不同质量分数的吐温80降低了HPTS对芽孢蛋白质二级结构的影响,这与本研究实验结果类似。

图7 D-果糖不同质量分数时HPTS处理后枯草芽孢杆菌芽孢蛋白质二级结构含量的变化

Fig.7 Changes in protein secondary structure content of Bacillus subtilis spores after HPTS treatment with different mass fractions of D-fructose

3 结 论

D-果糖对枯草芽孢杆菌芽孢灭活具有抑制作用,且抑制效果随D-果糖质量分数的升高而增强。与HPTS(600 MPa-75 ℃)单独处理相比,添加质量分数为60%的D-果糖后,芽孢存活数量上升了1.69 lg(CFU/mL)。D-果糖显著减少了HPTS处理后芽孢内容物的泄漏(P<0.05);流式细胞术结果表明,D-果糖能够保护芽孢内膜的完整性,且质量分数越高,效果越好。随着D-果糖质量分数升高,HPTS处理后,芽孢膜脂质由液晶态转变为凝胶态,内膜稳定性增强、流动性降低,芽孢蛋白质有序结构增加,但D-果糖对核酸无明显的效果。研究结果揭示了HPTS处理时D-果糖对枯草芽孢杆菌芽孢灭活的抑制作用及机制。在实际生产中,可以根据D-果糖添加量来选择HPTS处理的压力与温度,以杀灭足够数量的芽孢,确保食品质量和安全。研究希望为HPTS技术在含D-果糖食品中的应用提供一定参考。

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Inhibitory Mechanism of D-Fructose on Inactivation of Bacillus subtilis Spores During High-Pressure Thermal Sterilization Treatment

LI Qinghuan, XIN Weishan, LI Jiajia, LIU Yongxia, LIU Yichang, ZHANG Zhong*

(School of Food Science and Engineering,Ningxia University,Yinchuan 750021,China)

Abstract：The protective effect of D-fructose on spores of Bacillus subtilis treated by high-pressure thermal sterilization (HPTS) was studied.The treatment pressure of HPTS was 200 and 600 MPa,the treatment temperatures were 25,65,and 75 ℃,the treatment time was 20 min,and the mass fractions of D-fructose were 0,15%,30%,60%.At these conditions,flow cytometry was used to detect the damage of spore inner membrane before and after treatment,and Fourier infrared spectroscopy was used to analyze spore protein and inner membrane lipids before and after treatment to reveal the changes in protein structure and inner membrane lipid phase.After HPTS treatment,the permeability of spore inner membrane increased and the integrity of spore inner membrane was damaged.However,with the increase of D-fructose mass fraction,the phase state of spore inner membrane lipids gradually changed from liquid crystal state to gel state,stability of inner membrane increased,permeability decreased,integrity improved,and the content of ordered secondary structure of spore protein increased.When D-fructose was not added,after treatment at 600MPa and 75 ℃ for 20 min,the 5.31 lg(CFU/mL) spores died,and the OD600 of spore suspension decreased to 0.41,the leakage rate of 2,6-pyridinedicarboxylic acid (DPA) reached 93.56%,the proportion of spores with inner membrane damage reached 80.95%,and the content of α-helix and β-fold structures in spore proteins decreased to 16% and 17%,respectively.When the mass fraction of D-fructose increased to 60%,the number of viable spores increased by 1.69 lg(CFU/mL) under the same HPTS treatment conditions,the OD600 of spore suspension increased by 0.09,the proportion of spores with inner membrane damage decreased by 20.74%,and the contents of α-helix and β-fold structures of spore proteins increased to 25% and 28%,respectively.D-fructose protected the spore structure and key substances in spores during HPTS treatment,and this protective effect was positively correlated with the mass fraction of D-fructose.

Keywords：high-pressure thermal sterilization; D-fructose; Bacillus subtilis; spore; inactivation; inhibitory mechanism; inner membrane

中图分类号：TS201.3

文献标志码：A

doi：10.12301/spxb202300477

文章编号：2095-6002(2024)04-0145-11

引用格式：李青桓,辛伟山,李佳佳,等.高压热杀菌处理时D-果糖对枯草芽孢杆菌芽孢灭活的抑制机制[J].食品科学技术学报,2024,42(4):145-155.

LI Qinghuan,XIN Weishan,LI Jiajia,et al.Inhibitory mechanism of D-fructose on inactivation of Bacillus subtilis spores during high-pressure thermal sterilization treatment[J].Journal of Food Science and Technology,2024,42(4):145-155.

收稿日期：2023-08-03

基金项目：国家自然科学基金资助项目(32260633;31760474)。

Foundation：National Natural Science Foundation of China (32260633;31760474).

第一作者：李青桓,男,硕士研究生,研究方向为新型食品杀菌技术。

*通信作者：章 中,男,教授,博士,主要从事新型食品杀菌技术、农产品加工及贮藏方面的研究。

(责任编辑：张逸群)