岩藻多糖是海洋环境中特有的一类硫酸酯化多糖,其单糖组成和化学结构都十分复杂,主要来源于褐藻和一些海洋无脊椎动物。岩藻多糖具有抗凝血、抗肿瘤、抗血栓、抗病毒、抗氧化等多种生物学功能[1],在医药卫生、保健食品等领域具有广阔的应用前景。岩藻多糖分子结构的复杂性和多样性导致其生物功能与分子结构之间的关系不明确,严重制约了岩藻多糖在临床医药、保健食品等领域的应用[2]。与高分子质量的岩藻多糖相比,低分子质量的岩藻多糖在生物利用度和生物活性方面显示出一定的优势,具有极大的应用潜力[3]。因此,如何通过降解天然大分子质量的岩藻多糖获得具有多种生理功能的低分子质量的岩藻多糖引起了国内外科研工作者的关注[4]。目前,降解岩藻多糖制备低分子质量岩藻多糖的方法主要有物理、化学和酶解法,相较于前两种方法,酶解法被证明为较理想的岩藻多糖的降解方法[5]。

岩藻多糖酶是降解岩藻多糖的关键酶。由于岩藻多糖种类丰富,因此降解岩藻多糖的菌种和其产生的岩藻多糖酶也各有不同[6]。已报道的岩藻多糖酶产生菌主要包括黄杆菌属(Flavobacterium)、黄体杆菌属(Luteolibacter)、希瓦氏菌属(Shewanella)、海庄文颖氏菌属(Wenyingzhuangia)和嗜冷单胞菌属(Psychromonas)细菌。这些产岩藻多糖酶菌株存在产酶量低和产出酶的酶活力差的问题[7],通过优化培养基、培养条件和物理诱变的方式可以提升岩藻多糖酶的产酶量或者酶活力,但效果并不显著,仍然无法实现岩藻多糖酶的商品化[8]。

本研究团队前期已经从海带中筛选获得了一株可以降解岩藻多糖的黄杆菌Flavobacterium sp.RC2-3并完成了该细菌的全基因组测序。本实验以Flavobacterium sp.RC2-3为研究对象,拟通过与已报道的岩藻多糖酶氨基酸序列比对,并对其进行转录组学分析以及实时荧光定量PCR验证,希望在该菌株中挖掘出可能的岩藻多糖酶基因,通过生物信息学分析和基因工程手段将基因进行分子克隆和异源表达,并进一步探究其酶学性质和催化特性,以期获得新型岩藻多糖酶,丰富岩藻多糖酶基因家族。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

Flavobacterium sp.RC2-3菌株由青岛农业大学食品科学与工程学院发酵功能性食品研究与开发实验室保存;E.coli感受态细胞DH5α、E.coli感受态细胞BL21(DE3)、pLB-simple载体、pLB零背景快速连接试剂盒、质粒小提试剂盒、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(增强型)、1kb plus DNA Ladder(MD113)、RNAprep Pure培养细胞/细菌总RNA提取试剂盒、SuperReal荧光定量预混试剂,天根生化科技(北京)有限公司;大肠杆菌pET-28a(+) 载体,北京全式金生物技术有限公司;T4 DNA Ligase (1 U/μL),赛默飞世尔科技公司;NEB M0491V Q5 High-Fidelity DNA Polymerase,美国NEB公司;琼脂糖、葡萄糖、1×PBS缓冲液、4×分离胶缓冲液、4×浓缩胶缓冲液,北京索莱宝科技有限公司;酵母粉、胰蛋白胨,英国Oxoid公司;岩藻多糖,青岛明月海琳岩藻多糖生物有限公司。实验所用试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

TGL-16M型高速台式冷冻离心机,长沙湘仪离心机仪器有限公司; HH-6型恒温振荡水浴锅,常州国华企业有限公司;WFZUV-2000型紫外分光光度计,美国贝克曼公司;MJ Mini个人型PCR仪,美国伯乐公司;Quant Studio 3型实时荧光定量PCR仪,美国ABI公司;DYY-6D型电泳仪,北京市六一仪器厂;Quantum CX5型凝胶成像仪,法国Vilber Lourmat公司;AKTA purifier 100型蛋白纯化仪,美国通用公司;HisTrap HP型色谱柱,思拓凡公司;P200型超微量核酸蛋白分析仪,美国Pultton公司;Infinite 200 Pro型多功能酶标仪,帝肯奥地利有限责任公司。

1.3 培养基的配制

种子培养基配制:0.2 g岩藻多糖或0.2 g岩藻糖,2 g牛肉膏,使用100 mL海水过滤后配制。

发酵培养基配制:0.5 g岩藻多糖或0.5 g岩藻糖,2 g牛肉膏,使用100 mL海水过滤后配制。

LB培养基配制:0.5 g酵母粉,1.0 g胰蛋白胨,1.0 g NaCl,若固体培养基需添加2.0 g的琼脂,加入100 mL蒸馏水配制。

TB培养基配制:

1)胰蛋白胨12 g,酵母提取物24 g,甘油4 mL,加去离子水至900 mL,完全溶解,灭菌。

2)KH2PO4 2.31 g,K2HPO4 12.54 g,加去离子水至100 mL,完全溶解,灭菌。灭菌结束后,在无菌环境下将1)和2)溶液混匀。

1.4 实验方法

1.4.1 RC2-3菌株的培养

将海洋黄杆菌Flavobacterium sp.RC2-3菌株分别接种到100 mL含0.2 g岩藻多糖或岩藻糖的种子培养基中,振荡培养24 h,按照体积分数5%的接种量分别接种于含0.5 g岩藻多糖或岩藻糖的100 mL发酵培养基中,于25 ℃,150 r/min条件下培养48 h[9]。发酵结束后将发酵液分装至离心管中,于4 ℃,5 000 r/min离心15 min,取沉淀用适量预冷(4 ℃)海水清洗菌体,重复清洗3次,获得菌体沉淀。将由岩藻多糖培养基培养获得的3组平行 RC2-3 菌体沉淀命名为P组(P1、P2、P3),将由岩藻糖培养基培养获得的3组平行RC2-3菌体沉淀命名为M组(M1、M2、M3)。

1.4.2 目的基因的挖掘

1.4.2.1 RC2-3菌株的转录组学测序

为了挖掘RC2-3菌株中可以降解岩藻多糖的关键基因,将由岩藻多糖培养基培养获得的3组平行RC2-3菌体沉淀P1、P2、P3和由岩藻糖培养基培养获得的3组平行RC2-3菌体沉淀M1、M2、M3委托南京派森诺基因科技有限公司进行转录组学测序,基于Illumina平台,构建长度约为380 bp的片段文库并进行高通量测序。高通量测序中产生的原始数据为fastq格式序列[10]。对原始数据进行质量过滤得到可进行后续分析的高质量数据。将高质量数据比对到物种的参考基因组,通过基因组的比对率评估样本的情况。高质量数据与参考基因组比对的结果,以二进制文件进行储存。在计算基因表达量的差异时,利用HTSeq计数软件得到落到各个样本中基因的数据数目,采用DESeq软件对基因表达进行差异分析。

1.4.2.2 岩藻多糖降解酶基因的实时荧光定量检测

为了验证转录组学测序挖掘得到的岩藻多糖降解酶基因,采用实时荧光定量PCR检测各个基因在不同组的相对表达量。根据总RNA提取试剂盒说明书提取总RNA,超微量分光光度计检测RNA纯度。在8联管中加入3 μL cDNA和17 μL PCR反应液(10 μL预混液,0.6 μL正向引物,0.6 μL反向引物,5.8 μL双蒸水),置于PCR仪扩增,GAPDH作为内参校正,通过2-ΔΔCt法计算各基因的相对表达量[11]。

1.4.3 目的基因的异源表达

1.4.3.1 目的基因的生物信息学分析

根据前期对Flavobacterium sp.RC2-3菌株全基因组测序分析获得的结果,利用BioEdit软件建立Flavobacterium sp.RC2-3菌株基因组数据库和蛋白质数据库[12]。将Flavobacterium sp.RC2-3菌株基因组数据库和蛋白质数据库分别与NCBI数据库中已经发布的岩藻多糖酶的基因序列和蛋白序列比对,分别利用Prot Param、Signal P 5.0 server、Pro Scale等[8]软件对蛋白质理化性质,是否带有信号肽,亲疏水性等进行预测,通过Neighbor-Joining法进行进化树的构建分析。

1.4.3.2 目的基因的克隆表达

将Flavobacterium sp.RC2-3菌株接种于岩藻多糖培养基中,收集菌体并提取基因组DNA。利用PCR仪对目的基因进行扩增,上下游引物序列分别为5’GGTACCATGAATAAACTAATTTCAATATTTCTA GGAGGG3’、5’GGATCCTTAATCTAA CCAAGTAATTTTAGCTTC3’。使用限制性内切酶BamHI/KpnI对 PCR 扩增产物及pET-28a(+) 载体进行酶切,并将处理后的目的片段和载体连接。将构建好的表达载体转化至 BL21(DE3) 感受态细胞中,将构建好的大肠杆菌重组菌株接种至5 mL含氨苄霉素抗性(100 μg/mL)的LB液体培养基中,菌体接种量为培养基液体体积的1%,置于37 ℃摇床内振荡培养12 h以活化菌种[2,13]。按体积分数1%接种量接种活化菌种至50 mL含氨苄霉素抗性(100 μg/mL)的TB液体培养基中,培养至OD 600值达到 1.0～2.0,添加终体积分数为0.2%的L-阿拉伯糖,低温培养12～16 h以诱导蛋白表达。用转化空载体的重组菌株,在相同条件下进行诱导表达,并作为空白对照。

1.4.4 粗酶液的分离纯化

1.4.4.1 镍柱亲和层析纯化

收集诱导培养后的重组菌体,以20 mmol/L磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液(pH值为7.0)重悬,超声破碎后离心获取上清液。以 HisTrapTM HP色谱柱对上清液中的目标蛋白进行亲和层析纯化,平衡流动相为含0.3 mol/L NaCl的20 mmol/L磷酸氢二钠-磷酸二氢钠(pH值为7.0),洗脱梯度为0～0.5 mol/L 咪唑。观察紫外信号并收集有酶活的组分,将其进行SDS-PAGE蛋白电泳检测,纯化后的蛋白用于酶学性质的研究。

1.4.4.2 SDS-PAGE蛋白电泳分析

将上样样品与蛋白上样缓冲液混匀后,沸水处理10 min。离心取上清液15 μL点样,调节电压为100 V,使蛋白在浓缩胶中运动下移。当样品运动到分离胶后电压设定为120～150 V,当Maker完全跑开且蛋白条带跑至胶底部时结束电泳。关闭电源后将胶取下,依次进行染色、脱色,最后将胶样品置于凝胶成像仪中成像[14-16]。

1.4.4.3 琼脂糖凝胶电泳分析

配制质量浓度为1 mg/mL的琼脂糖凝胶,将岩藻多糖酶解液与上样缓冲液按照体积比为4∶1混匀,取15 μL注入胶孔,将电压调节为100 V进行电泳。电泳结束后依次对胶进行染色、脱色,最后将胶样品置于凝胶成像仪中成像,记录电泳结果[17]。

1.4.5 酶学性质表征

1.4.5.1 蛋白定量和酶活力的检测

1) 蛋白定量检测。参照文献[14]对纯化酶样品进行蛋白定量检测。以牛血清蛋白作为标准品绘制标准曲线,采用考马斯亮蓝法测定蛋白浓度。取3 μL适当稀释的酶液,加入297 μL的考马斯亮蓝试剂,迅速混匀。取200 μL混合液加入酶标板中,室温反应2 min后,以加入等量的1×PBS缓冲液作为空白对照。使用酶标仪检测样品在595 nm波长下的吸光值,根据测得的吸光值和标准曲线计算出纯酶中的蛋白浓度。

2) 薄层层析分析。采用薄层层析法(thin-layer chromatography,TLC)定性检测得到的重组酶是否可以降解岩藻多糖[17]。TLC条件:展开剂为正丁醇、无水乙醇和水混合液(三者体积比为 5.0∶3.0∶2.0)。

显色剂的配制方法:将1 g二苯胺溶于50 mL丙酮中,相继加入1 mL苯胺和5 mL磷酸,混匀后使用,现用现配,展开时间为40 min。

3) 酶活力测定。参照文献[9],测定重组酶的活力。以岩藻糖作为标准品绘制标准曲线,采用铁氰化钾法测定还原糖含量。将待测酶样品与 2 mg/mL 的岩藻多糖(用1×PBS缓冲液配制)等体积混合,在30 ℃、120 r/min的水浴恒温振荡器反应0.5 h,加入0.5 mL铁氰化钾工作液,在80 ℃水浴锅中反应15 min,冷却至室温后加入2 mL蒸馏水混匀,离心取上清液200 μL加入酶标板。空白对照组样品制备:待测酶样品先于沸水中灭酶20 min,离心,取上清液与2 mg/mL的岩藻多糖(用1×PBS缓冲液配制)等体积混合。使用酶标仪检测样品在420 nm 波长处的吸光值,根据测得的吸光值和标准曲线得到样品中的还原糖含量,计算酶活力。

酶活力单位(U)定义为30 ℃、pH值为8.0条件下,单位时间(h)释放1 μmol岩藻糖需要的酶液量。

1.4.5.2 最适反应温度及热稳定性的测定

1) 最适反应温度的测定。酶与底物在 20～60 ℃ 反应,测定酶活力以研究重组蛋白的最适反应温度。将酶液在不同温度下(20、25、30、35、40、45、50、55、60 ℃)进行酶催化反应,以最高酶活力作为100%,计算不同温度下的相对酶活力[18]。

2)热稳定性的测定。将酶液于20、30、40、50、60 ℃ 保温4 h,加入底物,分别测定酶活力,以未经保温处理的酶活力作为100%,计算相对酶活力[19]。

1.4.5.3 最适pH值及酸碱稳定性的测定

1)最适pH值的测定。以不同pH值的缓冲液溶解底物,置换酶液中的溶剂(pH值为 4.0～7.0,20 mmol/L的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液;pH值为6.5～9.0,20 mmol/L的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液;pH值为9.0～11.0,20 mmol/L的碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液),将对应pH值的酶与底物混合,测定不同pH值(5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0)条件下酶的活力。以最高酶活力作为100%,计算相对酶活力[20-21]。

2)酸碱稳定性的测定。在4 ℃条件下,将酶液加入0.01 mol/L不同pH值(5.0、6.0、7.0、8.0、9.0)的缓冲溶液中,放置0、2、4、8、12、16、24、36 h。迅速用NaOH或HCl调节溶液pH值至8.0,加入底物,分别测定酶活力。以未处理的酶活力作为100%,计算相对酶活力[2-3]。

1.4.5.4 动力学参数的测定

采用Lineweaver-Burk法,测定岩藻多糖酶的动力学常数[22]。控制反应体系中底物质量浓度为0.5～3.0 mg/mL,在得到的最适反应条件下进行反应,测定其酶活力,计算酶促反应速度。

1.5 数据处理

采用GraphPad Prism 8软件进行图片处理,采用SPSS进行统计分析。所有实验均重复3次,实验结果以表示,P<0.05表示有显著差异。

2 结果与分析

2.1 Flavobacterium sp.RC2-3菌株中岩藻多糖酶基因的挖掘结果

基于对黄杆菌RC2-3菌株的转录组学和全基因组测序结果,对RC2-3菌株中参与岩藻多糖降解的关键基因进行挖掘。采用转录组学技术对岩藻多糖组(P组)与岩藻糖组(M组)的基因表达差异进行了分析,结果见图1。表达差异倍数(fold change,FC)以log2(FC)表示。以|log2(FC)|>1,显著水平P<0.05作为筛选标准。在转录组学的分析中,火山图能直观地表现出差异基因的差异倍数和显著水平[23],由图1可见,与M组相比,P组共有569个明显差异基因,其中294个基因明显上调,275个基因明显下调,说明了菌株RC2-3中部分基因在降解岩藻多糖方面存在较大潜力。

CAZy全称为Carbohydrate-Active enZYmes Database,是碳水化合物酶相关的专业数据库,其包含6个主要分类:糖苷水解酶(glycoside hydrolases,GHs)、糖基转移酶(glycosyl transferases,GTs)、多糖裂解酶(polysaccharide lyases,PLs)、糖类酯解酶(carbohydrate esterases,CEs)、氧化还原酶(auxiliary activities,AAs)和碳水化合物结合结构域(carbohydrate-binding modules,CBMs)。研究表明,CBMs可以结合碳水化合物活性酶的底物,进而提高碳水化合物活性酶的催化活性[22]。结合CAZy数据库与黄杆菌RC2-3菌株的转录组学和全基因组测序结果,在与M组相比,P组明显上调的294个基因中,16个与碳水化合物代谢相关,见表1。表1中包括8个碳水化合物结合模块基因,6个糖苷水解酶基因,2个功能未知基因。

结合表1选择了8个糖苷水解酶基因,通过实时荧光定量PCR进行了验证,得到了各个基因在不同组的相对表达量,见图2。由图2可知,在CAZy数据库中功能未注释的基因RC2.3_GM001247在P组的相对表达量最高,是M组的差异表达量的8倍,推测其在岩藻多糖的降解中发挥了重要作用。故选择RC2.3_GM001247基因为研究对象,将其命名为基因Fcn1,并进行后续生物信息学分析及基因功能的验证。

2.2 Fcn1基因的生物信息学分析结果

利用ExPASy软件的Prot Param工具对源自Flavobacterium sp.RC2-3菌株的岩藻多糖酶蛋白序列进行了理化性质分析。Fcn1基因全长1 221 bp,编码406个氨基酸,蛋白分子质量约为46.8 kDa,原子总数为6 587个,不稳定指数为20.59,脂肪指数为75.69,GRAVY值为-0.458,拟表达蛋白表现为亲水性、无跨膜区。利用DNAMAN软件与已报道的岩藻多糖酶进行序列比对,分析发现,Fcn1(OR268942)蛋白序列与已经报道的岩藻多糖酶FunA(WP_068826898.1)[15]蛋白序列同源性达到70.98%。将Fcn1氨基酸序列与已报道的岩藻多糖酶氨基酸序列进行比对,通过Neighbor-Joining法进行进化树的构建,分析结果见图3。由图3可知,Fcn1基因编码的蛋白与FunA基因编码的蛋白亲缘关系较近。

为了进一步确定Fcn1与FunA基因功能的差异,对二者进行了保守结构域的预测分析。Fcn1基因编码的氨基酸序列与FunA基因编码的氨基酸序列保守结构域分析见图4。由图4可知,Fcn1和FunA都具有GHL15结构域,分别位于114～389个氨基酸和116～391个氨基酸,但其包含的功能模序存在差异,其中Fcn1中包含Glyco-hydro-66和ROK模序,FunA中包含Glyco-hydro-31和Glyco-hydro-114模序。研究表明,同属于一个GH107家族的两个岩藻多糖酶基因Fda1和Fda2的功能模序存在差异,其催化功能也存在差异[24]。基于此,我们推断Fcn1基因编码的蛋白与FunA基因编码的蛋白虽然亲缘关系较近,但在催化特异性方面也可能存在差异。

2.3 Fcn1酶的克隆表达及其分离纯化结果

以RC2-3菌株基因组为模板进行基因克隆,通过酶切连接,成功构建并得到了重组表达质粒Fcn1-pET-28a(+),将测序鉴定成功的质粒在大肠杆菌BL21中表达。将重组菌株和转入空质粒的菌株进行低温诱导表达,采用Ni-NTA柱亲和层析法对粗酶液进行纯化,通过SDS-PAGE电泳分析纯化效果,结果如图5。由图5可见,粗酶液经纯化得到47 kDa的电泳级纯酶,分子质量在48 kDa 条带下方,与生物信息学分析得到的理论值相符。Ni-NTA柱纯化效果见表2,由表2可见,酶的纯化倍数为2.25,酶活力回收率为67%,纯化后的比酶活显著提升,由初始的30 U/mg提高到332 U/mg。已报道的海洋细菌ZJCN121来源的岩藻多糖酶,经丙酮沉淀和Sephadex G-100柱层析纯化后的比酶活为20.59 U/mg[25],回收率为13.5%,相比可得出经大肠杆菌异源表达且经镍柱纯化后的Fcn1酶回收率较高且纯化效果更好。

2.4 重组酶Fcn1降解岩藻多糖效果分析

利用薄层层析和凝胶电泳法可以检测岩藻多糖酶Fcn1对岩藻多糖的降解情况。图6为Fcn1酶解产物TLC图,由图6可见,岩藻多糖所对应的条带没有向上延展的趋势,且样品都维持在原点,原因是岩藻多糖分子质量较大,向上延伸困难;降解产物对应的条带向上延伸,并在低于岩藻糖条带的位置出现明显条带,表明与岩藻多糖相比,酶解产物出现较明显的降解。因多糖的分子质量不同,在凝胶电泳中的迁移率不同[26],进一步采用琼脂糖凝胶电泳对Fcn1酶解产物进行分析,结果如图7。由图7可见,与岩藻多糖的条带位置相比,酶解产物的条带向下迁移,且酶解产物在起点附近的条带颜色比岩藻多糖条带颜色浅,说明岩藻多糖经过酶解,高分子质量组分减少,低分子质量岩藻多糖增加。这与本研究团队前期研究结果相似,酶解能够降低岩藻多糖分子质量,且可以利用凝胶电泳图反映[9]。本研究表明,岩藻多糖酶Fcn1可以有效降解岩藻多糖。

2.5 Fcn1酶的酶学性质分析

对岩藻多糖酶Fcn1的酶学性质进行表征,结果见图8。由图8(a)和(b)可知,Fcn1的最适反应温度为50 ℃、最适pH值为8.0。Trang等[20]研究表明,岩藻多糖酶Fhf2Δ484的最适温度为37 ℃,最适pH值为8.0;Vuillemin等[11]研究表明,岩藻多糖酶Fhf1Δ470在37～40 ℃,pH值为8.0时酶活性最高。与Trang和Vuillemin等的研究结果相比,本研究得到的岩藻多糖酶Fcn1最适反应温度更高,酶的最适反应温度较高能够显著提升其在实际生产中的应用效果和经济效益。图8(c)酶的热稳定性分析结果表明,Fcn1酶在20 ℃和30 ℃条件下表现出较高的稳定性,可分别保持初酶活的93%和97.8%。当温度为40 ℃时,Fcn1的相对酶活力下降为82.3%,与Shen等[23]的研究结果相近,岩藻多糖酶FunA在40 ℃的温度下相对酶活力为80%。结合最适反应温度和热稳定性的实验结果,确定30 ℃为岩藻多糖酶Fcn1的酶解反应温度。图8(d)Fcn1酶的酸碱稳定性分析结果表明,Fcn1酶在pH值为7.0～8.0时,相对酶活力基本能保持稳定,这与Shen等[23]报道的岩藻多糖酶酸碱稳定性的结果相符。结合酶的最适pH值实验结果可得,岩藻多糖酶Fcn1催化反应的最适pH值与其稳定性最好的pH值一致,均为8.0。为验证岩藻多糖酶Fcn1的催化效率,以岩藻多糖为底物测得Fcn1酶催化岩藻多糖水解反应的动力学参数,Km为1.17 mg/mL,Vmax为10.53 g·L-1·min-1。已报道的海洋细菌ZJCN121岩藻多糖酶的Km值为 5.87 mg/mL,Vmax为 6.11 g·L-1·min-1[25],相比可得重组酶Fcn1的催化效率较高。

3 结 论

本研究运用转录组学、荧光定量PCR技术和生物信息学分析从Flavobacterium sp.RC2-3菌株中挖掘获得了一个岩藻多糖酶基因Fcn1,将该基因在大肠杆菌中实现了高效异源表达,并对其酶学性质进行了表征。经纯化后岩藻多糖酶Fcn1的比酶活达到332 U/mg,最适反应温度为50 ℃,最适pH值为8.0,且在pH值为7.0～8.0和温度为20～30 ℃的环境下具有较好的稳定性。重组酶Fcn1具有较高的催化效率,其动力学参数Km和Vmax分别为 1.17 mg/mL 和 10.53 g·L-1·min-1。本研究旨在挖掘新型岩藻多糖酶,丰富岩藻多糖酶基因家族,为进一步对岩藻多糖酶Fcn1进行分子改造奠定理论基础。

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Heterologous Expression and Enzymatic Properties of Fucoidanase Fcn1 from Marine Flavobacterium sp.

WANG Liping, WU Junyi, WANG Ying, QIN Min, CHEN Qianru, CHEN Tiejun*

(College of Food Science and Engineering,Qingdao Agricultural University,Qingdao 266109,China)

Abstract：In order to find and explore new enzymes for degrading fucoidan,a strain of marine Flavobacterium sp.RC2-3 which can degrade fucoidan was screened from kelp as the research object,and its whole genome was sequenced.By comparing with the amino acid sequence of fucoidanase reported,transcriptomic analysis and real-time fluorescence quantitative PCR verification,a possible fucoidanase gene was discovered and named Fcn1.The full length of Fcn1 gene is 1 221 bp,encoding 406 amino acids,and the molecular weight of the protein is about 46.8 kDa.By primer design and PCR amplification,the Fcn1 gene was cloned,and the heterologous expression vector Fcn1-pET-28a (+) was further constructed,and it was successfully induced and expressed in E.coli BL21(DE3) expression host.The recombinant enzyme Fcn1 was separated and purified by a nickel column with His tag.The specific enzyme activity of the purified enzyme in hydrolyzing fucoidan was 332 U/mg determined by potassium ferricyanide method,and the purification multiple was 2.25.Enzymatic property study showed that the optimal reaction temperature of Fcn1 was 50 ℃,the optimal reaction pH was 8.0,and the stability of Fcn1 was better at 20-30 ℃ and pH 7.0-8.0.Combined with the results of enzymatic properties,the optimum reaction conditions were determined to be 30 ℃ at pH 8.0,and the kinetic parameters of enzymatic hydrolysis of fucoidanase were determined,with Km of 1.17 mg/mL,Vmax of 10.53 g·L-1·min-1.The enzyme has high activity in degrading fucoidan,and has great application potential in the development and utilization of fucoidan resources.

Keywords：marine Flavobacterium sp.; fucoidanase; gene cloning; heterologous expression; protein purification; enzymatic properties

中图分类号：TS201.4

文献标志码：A

doi：10.12301/spxb202300442

文章编号：2095-6002(2024)04-0135-10

引用格式：王立平,武俊义,王莹,等.海洋黄杆菌来源岩藻多糖酶Fcn1的异源表达及酶学性质[J].食品科学技术学报,2024,42(4):135-144.

WANG Liping,WU Junyi,WANG Ying,et al.Heterologous expression and enzymatic properties of fucoidanase Fcn1 from marine Flavobacterium sp.[J].Journal of Food Science and Technology,2024,42(4):135-144.

收稿日期：2023-07-19

基金项目：山东省青年自然科学基金资助项目(ZR2021QC042);青岛农业大学人才引进项目(665/1120037)。

Foundation：Youth Natural Science Foundation of Shandong Province (ZR2021QC042); High-Level Talent Research Fund of Qingdao Agricultural University (665/1120037).

第一作者：王立平,女,硕士研究生,研究方向为海洋分子微生物学;

并列第一作者：武俊义,男,本科生,研究方向为海洋分子微生物学。

*通信作者：陈铁军,女,副教授,博士,主要从事海洋分子微生物学方面的研究。

(责任编辑：叶红波)