邻苯二甲酸酯(phthalate esters,PAEs)是由邻苯二甲酸和醇经酯化得到的人工合成化合物,作为增塑剂可以提高塑料的柔韧性和耐久性[1]。塑料制品的广泛使用产生了大量的塑料垃圾,导致PAEs随塑料垃圾的丢弃逸散到环境中,对耕地和水源造成了严重污染[2-3]。Dong等[4]的研究显示,小麦、大米和高粱等对PAEs具有富集作用,并易于积累在种子内。大多数以粮食为原料的发酵制品如白酒、面包等均检测到PAEs的存在[5];并且PAEs自塑料包装中的迁移也会造成食品污染[6-7],经由食物链积累于人体。研究表明,PAEs与天然内源性雌激素相近,即使在低浓度时也会干扰人类和动物的内分泌系统[8],并可能导致呼吸系统和神经心理疾病等[9-11]。美国环境保护署、欧盟和中国国家环境监测中心已将邻苯二甲酸二丁酯(dibutyl phthalate,DBP)、邻苯二甲酸二(2-乙基己基)酯(di-2-ethylhexyl phthalate,DEHP)等6种PAEs列为优先检测污染物。研究发现,PAEs侧链酯键的彻底水解是消除其毒性的关键。作为PAEs酯键水解的中间产物,邻苯二甲酸单酯仍表现出生理毒性,例如邻苯二甲酸单丁酯(monobutyl phthalate,MBP)具有生殖毒性,微量的MBP就会抑制小鼠精子活力[12-13];邻苯二甲酸单(2-乙基己基)酯(mono-2-ethylhexyl phthalate,MEHP)毒性是对应二酯的20倍,对心脏的危害呈剂量依赖性,但PAEs彻底水解产物邻苯二甲酸未表现出生理毒性[14]。由此可见,想要消除PAEs的毒性,必须对两个酯键进行彻底水解,相关工作引起了研究者的关注。

微生物源酶法是一种优选的降解PAEs的处理方法。在降解过程中,水解酶将PAEs转化为相应的邻苯二甲酸单酯[15],然后将邻苯二甲酸单酯进一步水解生成邻苯二甲酸(PA)。目前已有研究通过邻苯二甲酸酯水解酶和邻苯二甲酸单酯水解酶的组合,实现了PAEs侧链双酯键的彻底水解[16],但是两种酶的最佳反应条件通常不一致,进而导致催化效率降低,同时操作和酶纯化的成本相应增加,限制了通过酶解法去除PAEs毒性的研究;同时,具有水解邻苯二甲酸单酯能力的水解酶的报道多集中在酶与邻苯二甲酸单酯底物羧基的结合,仅探讨了碱性氨基酸与羧基结合的静电作用,而忽略了酶不能特异性识别PAEs的问题[17]。本研究将通过改造邻苯二甲酸单酯水解酶,改变酶的底物谱,希望能够初步解析酶特异性识别PAEs的机制。图1展示了PAEs和邻苯二甲酸单酯的结构,邻苯二甲酸单酯结构由苯环和两个相邻的取代基构成,取代基通常包括一个含有酯键的侧链烷基或杂环基团、一个带有负电荷的羧基基团。这种极性较强的结构限制了水解酶与邻苯二甲酸单酯底物的结合。聚焦邻苯二甲酸单酯水解酶,解析酶的结构和催化机制,有助于促进相关酶更好的应用。

图1 邻苯二甲酸酯和邻苯二甲酸单酯结构

Fig.1 Structure of phthalate ester and monoalkyl phthalate

文献报道,邻苯二甲酸单酯水解酶包括源于微杆菌属Microbacterium sp.PAE-1的酯酶MpeH[18]、红球菌属Rhodococcus jostii RHA1的PatE[19]和Rhodococcus sp.EG-5的MehpH[20]等。红球菌具有极强的环境适应性,广泛存在于土壤、海洋和极地环境中,对烷烃、卤代芳香族化合物、杂环化合物等都具有较好的降解能力,在污染物去除治理中有良好的应用前景[21-22]。本研究选取红球菌来源的邻苯二甲酸单酯水解酶RhoⅡ,拟采用计算机模拟、Native-PAGE、定点突变等技术,确定酶的催化特性和活性中心,通过改造关键位点以期改变RhoⅡ的底物谱,为单酶或者酶组合彻底水解PAEs侧链的两个酯键提供理论依据,从而为生物酶法催化水解PAEs的应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 菌株和质粒

pET-28a(+)质粒和E. coli BL21(DE3)感受态细胞由北京工商大学食品功能微生物与酶技术应用实验室保藏,含有RhoⅡ编码基因的工程菌株由深圳华大基因科技有限公司合成。

1.1.2 培养基与主要试剂

LB培养基配制:胰蛋白胨10 g/L,酵母浸粉5 g/L,氯化钠10 g/L。调整pH值至7.0,加入质量分数为2%的琼脂粉,121 ℃高压灭菌20 min。

三羟甲基氨基甲烷(Tris)、十二烷基硫酸钠、甘氨酸、硫酸卡那霉素、异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside,IPTG)、咪唑,购自北京博奥拓达公司;甲叉双丙烯酰胺、丙烯酰胺、四甲基己二胺、考马斯亮蓝R-250,纯度均为99%,购自上海生物工程有限公司;胰蛋白胨、琼脂粉、酵母浸粉,购自北京奥博星生物技术有限责任公司;浓盐酸、异丙醇、冰醋酸、乙醇、氯化钠、氢氧化钠、过硫酸铵均为分析纯,甲醇(色谱纯),购自天津福晨化学试剂有限公司;邻苯二甲酸二甲酯(dimethyl phthalate,DMP)、邻苯二甲酸二乙酯(diethyl phthalate,DEP)、邻苯二甲酸二异丁酯(diisobutyl phthalate,DIBP)、DBP、邻苯二甲酸单甲酯(mono-methyl phthalate,MMP)、MBP及MEHP,纯度均大于99.0%,购自上海源叶生物有限公司。

PrimerSTAR Max,购自日本TaKaRa(北京)公司;BCA蛋白浓度测定试剂盒,购自北京索莱宝公司;DpnI酶,购自美国BioLabs(北京)公司。

1.2 仪器与设备

T100TM型PCR仪,美国Bio-Rad公司;EPS301型琼脂糖凝胶电泳仪,北京六一仪器厂;ImageQuant 300型凝胶成像仪、Multitemp Ⅲ型恒温循环水浴器,美国GE公司;HR60-ⅡA2型生物安全柜,青岛海尔特种电器有限公司;YXQ-LS-50SⅡ型立式压力蒸汽灭菌器,上海博迅实业有限公司医疗设备厂;Microfuge® 20R型高速冷冻离心机,美国Beckman Coulter公司;XO-650型超声波细胞破碎仪,南京先欧仪器制造有限公司;3-30K型冷冻离心机,美国Sigma公司;DHZ-DA型大容量全温振荡器,太仓市豪诚实验仪器制造有限公司;iMark型酶标仪,美国伯乐公司;7890B型气相色谱仪、1260 Infinity型高效液相色谱仪,美国安捷伦科技有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 生物信息学分析

1.3.1.1 系统发育树构建

通过BLAST比对(http:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)寻找序列同源性高的蛋白,在分子进化遗传分析软件MEGA(version 6.0)中选择默认参数的邻接法构建系统进化树,Bootstrap值设定为1 000。

1.3.1.2 蛋白质同源建模

使用ESPript 3.0(http:∥espript.ibcp.fr/ESPript/ESPript/)将RhoⅡ序列与参考蛋白进行比对;选用SWISS-MODEL(https:∥swissmodel.expasy.org/)将与模板具有高度序列一致性(>30%)的蛋白质进行同源建模。

1.3.1.3 分子对接

从ZINC(http:∥zinc15.docking.org/)数据库下载获得DBP与MBP的三维结构,经AutoDock Tools 4.0软件处理,生成配体结构文件。对分子模拟蛋白进行去水、加氢等处理,保留蛋白原有电荷,指定为受体。选择结合口袋,使对接区域包裹配体小分子,对接结果通过PyMOL (http:∥www.pymol.org/pymol.html)软件可视化。

1.3.2 突变体构建

利用质粒提取试剂盒提取带有编码RhoⅡ基因的质粒,所得质粒浓度由核酸蛋白检测仪测定,PCR用模板质粒质量浓度为100 ng/mL左右。通过PCR对编码RhoⅡ的基因进行定点突变,突变关键在于引物的设计,引物对以要突变的碱基为中心,加上两侧的一段序列,再合成一条反向互补的引物,即目标突变位点重叠的一对反向互补引物。表1为RhoⅡ突变用的具体引物序列,由华大公司北京分公司合成。表2为定点突变的PCR体系,按照表2中的体系将各物质加入200 μL离心管中。表3为定点突变的PCR反应程序,按照表3的各项程序对PCR仪进行设置。

表1 RhoⅡ突变用引物

Tab.1 Primers for RhoⅡ mutations

引物名称序列5′→3′RhoⅡ-D39A.fGGTGGTGGTCGCCTTGATCACGGGCTTCRhoⅡ-D39A.rAAGGCGACCACCACCACTGCCGGRhoⅡ-K127A.fGACATTGGTGGCGAAGTACGCATCGTGCRhoⅡ-K127A.rTTCGCCACCAATGTCGTCTCACCRhoⅡ-C160A.fCACGAGCGGAGCAGTTCGTGCCACCGCGRhoⅡ-C160A.rACTGCTCCGCTCGTGGTGCAGCCRhoⅡ-F44Q.fGATTACCGGCCAAACCGATCGCCGCAGCRhoⅡ-F44Q.rGTTTGGCCGGTAATCAAATCCACRhoⅡ-F44N.fGATTACCGGCAATACCGATCGCCGCAGCRhoⅡ-F44N.rGTATTGCCGGTAATCAAATCCAC

表2 定点突变PCR反应体系

Tab.2 PCR reaction system of site-directed mutation

试剂V/μLPrimestarMax10.0模板0.5上游引物0.5下游引物0.5双蒸水8.5

表3 定点突变PCR反应程序

Tab.3 PCR reaction procedure of site-directed mutation

循环数/次温度/℃程序时间/s198预变性3098变性103055退火1572延伸190172延伸300112—

采用琼脂糖凝胶电泳检验PCR反应产物,若电泳结果显示正确的目的条带,则对剩余产物通过去甲基化酶DpnI进行去甲基化。将去甲基化后的突变质粒转入感受态细胞E. coli BL21(DE3)中,工程菌菌液测序验证,突变体用于后续实验。

1.3.3 重组蛋白异源表达

将序列正确的菌株接种到LB培养基(最终质量浓度为40 mg/L的卡那霉素)中,并保持在37 ℃。当细胞在OD600nm处生长到0.6～0.8的密度时,向培养基中添加IPTG至最终浓度为0.5 mmol/L,20 ℃和200 r/min培养约20 h。细胞在4 ℃条件下15 000 r/min离心5 min收集,重新悬浮,并用Tris-HCl缓冲液(pH值7.5,50 mmol/L)洗涤两次。利用超声波裂解细胞,并在4 ℃条件下20 000 r/min离心20 min,获得含有目的蛋白的粗酶液。

1.3.4 蛋白纯化

对重组蛋白粗酶液进行纯化,目的基因中设计带有组氨酸标签。组氨酸的咪唑环与镍离子形成配位键,当流过柱料的缓冲液中咪唑浓度不断提高时,咪唑与镍柱竞争性结合,使目的蛋白以高纯度洗脱,之后使用超滤离心管浓缩纯酶。使用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定浓缩后蛋白质量浓度,并以Tris-HCl缓冲液统一将各纯酶质量浓度稀释至1 mg/mL,用于水解PAEs实验。

通过SDS-PAGE电泳与Native-PAGE电泳验证蛋白纯化结果,其中Native-PAGE电泳用于确定自然状态下蛋白质质量和寡聚状态。

1.3.5 重组蛋白水解能力测定

邻苯二甲酸单酯反应体系:邻苯二甲酸单酯混合溶液(MMP、MBP、MEHP) 100 μL(反应最终质量浓度为100 mg/L)、粗酶液2 mL、Tris-HCl Buffer 7.9 mL;空白对照以等体积含空载体的大肠杆菌粗酶液代替突变蛋白粗酶液。将反应体系置于37 ℃,150 r/min水浴摇床下反应12 h,反应结束后用高效液相色谱对样品进行测定。

PAEs反应体系:PAEs混合溶液(DMP、DEP、DBP、DIBP和DEHP)200 μL(反应终浓度为100 mg/L)、粗酶液2 mL、Tris-HCl Buffer 7.8 mL;空白对照以等体积含空载体的大肠杆菌粗酶液代替突变蛋白粗酶液。将反应体系置于37 ℃,150 r/min水浴摇床下反应12 h。反应结束后用气相色谱对样品进行测定。

1.3.6 分析方法

采用高效液相色谱法定量检测邻苯二甲酸单酯和邻苯二甲酸。色谱检测条件:Luna® C18(2)型液相色谱柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);流动相为甲醇和体积分数为1%的乙酸水溶液(二者体积比为 3∶1);流速为0.7 mL/min,检测波长为228 nm,柱温为30 ℃。采用气相色谱法定量检测邻苯二甲酸酯。色谱检测条件:Agilent 19091N-213I型色谱柱(30 m×0.32 mm,0.50 μm);80 ℃恒温5 min,以 20 ℃/min 的速率升温至240 ℃,最后以240 ℃保持恒温25 min;载气为氮气,流速为1.0 mL/min,进样量为1.0 μL。

1.4 数据处理

化合物定量检测均采用标准曲线法。所有实验至少重复3次,实验数据以平均值 ± 标准差表示。采用Origin 8.0软件进行数据统计分析和t检验,P<0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 RhoⅡ序列与结构分析

前期研究已从红球菌(Rhodococcus jostii RHA1)中得到了一个具有水解邻苯二甲酸单酯能力的水解酶,但仅证明了该酶的水解特性,未作进一步机制分析[19]。鉴于邻苯二甲酸单酯水解酶资源有限,水解机制研究匮乏,本研究拟深入分析该酶的催化机制。委托华大基因公司合成了该酶的编码基因(NCBI数据库中登录号为WP_144288566.1),将该酶命名为RhoⅡ,并对其进行进化分析。图2为RhoⅡ的系统发育树,结果显示,RhoⅡ与N-氨基甲酰肌氨酸酰胺水解酶同源性较高,应属于酰胺水解酶。

图2 水解酶RhoⅡ系统发育分析

Fig.2 Polygenetic analysis of hydrolase RhoⅡ

图3为RhoⅡ与4l07、1nba、3uao的序列比对结果,发现酰胺水解酶4l07[23]、酰胺水解酶1nba[24]和半胱氨酸水解酶3uao[25]与RhoⅡ序列相似度分别为44%、37%和35%,并推测Asp39、Lys127、Cys160位点为RhoⅡ的催化三联体。

“*”表示催化活性位点。

图3 酰胺酶RhoⅡ与酶4l07、1nba、3uao的蛋白序列比对结果

Fig.3 Protein sequences alignment results of amidohydrolase RhoⅡ with 4l07,1nba and 3uao

图4为RhoⅡ单体结构及RhoⅡ和MBP的分子对接结果。由图4(a)可见,RhoⅡ单体呈现出α-β-α折叠,即中心的6个β-折叠被两侧的6个α-螺旋夹住,两个单体以α3、α5、α6相互靠近结合。RhoⅡ由两个单体构成二聚体,图4(b)为RhoⅡ与MBP的分子对接结果,MBP结合在靠近二聚体界面的表面凹槽中,与RhoⅡ的两个单体均存在相互作用。RhoⅡ 在MBP带有负电荷的羧基端存在两个带有正电荷的氨基酸位点Lys200和Arg185,通过静电相互作用来稳定底物的极性羧基基团,使酯键的水解能够顺利进行。这种电荷作用在另一种邻苯二甲酸单酯水解酶MphG1[17]中也有报道,MphG1的Arg126正电荷胍基与底物的负电荷羧基发生静电作用。同样地,Lys200、Arg185带有正电荷的R基可以中和MBP羧酸阴离子的负电荷,消除了MBP的羧酸基团对蛋白结合底物的抑制作用。RhoⅡ与MBP的结合能为-4.75 kcal/mol,但不能与含有两个侧链酯键的DBP进行对接。分析MBP与DBP的结构差异可以发现,DBP较MBP多出一个丁酯侧链,因而推测RhoⅡ不能水解DBP是由于催化活性空腔体积不够导致的。这种由于空间位阻作用导致酶不能识别体积较大配体的现象在RhoⅡ同源性较高的酰胺酶4l07中也有发现。具体来说,4l07的活性空腔可以容纳马来酸酯,而当含有酰基的甲酰基马来酸酯结合蛋白时,酶的活性空腔由于位阻碰撞而不能容纳甲酰基马来酸酯,阻止了酶4l07对其有效水解[23]。

图4 酰胺酶RhoⅡ单体结构及RhoⅡ和MBP的分子对接

Fig.4 Monomer structure of amidohydrolase RhoⅡ and molecular docking of RhoⅡ and MBP

2.2 RhoⅡ催化活性中心验证结果

图5为RhoⅡ蛋白异源表达及纯化后的电泳结果,经基因合成获得序列正确的RhoⅡ编码基因,通过诱导表达实现了酶的异源表达,为确定结构模拟得到的RhoⅡ的二聚体结构,对纯化后的RhoⅡ在变性状态下进行SDS-PAGE电泳以及在自然状态下进行Native-PAGE电泳。由图5(a)可知,RhoⅡ的蛋白变性后由于二级结构被破坏,以单链的形式进行电泳,即单体大小为25 kDa左右;由图5(b)可知,自然条件下蛋白条带在50 kDa附近,是单体大小的2倍,说明自然状态下RhoⅡ是以二聚体形式存在。

泳道1为咪唑浓度100 mmol/L时蛋白洗脱液,泳道2为咪唑浓度200 mmol/L时蛋白洗脱液。

图5 酰胺酶RhoⅡ纯化验证

Fig.5 Validation of RhoⅡ purification

为确定RhoⅡ在2.1中提及的催化活性中心,对推测的催化三联体Asp39、Lys127、Cys160分别进行丙氨酸突变,构建的重组菌株经IPTG诱导表达后成功获得了突变酶D39A、K127A和C160A,实验结果见图6。图6(a)为SDS-PAGE电泳图,条带正确,原酶与突变酶均实现了可溶性表达。对原酶RhoⅡ和突变酶进行邻苯二甲酸单酯的水解反应,水解结果如图6(b),RhoⅡ能够完全水解MMP、MBP以及水解13.18%的MEHP,产生(141.27±4.51)mg/L的邻苯二甲酸;而突变酶D39A、K127A和C160A均不能水解邻苯二甲酸单酯,证明Asp39、Lys127、Cys160突变后显著影响酶的水解活性,在底物酯键断裂中起到关键作用,应为RhoⅡ的催化三联体。

图6 RhoⅡ催化三联体验证

Fig.6 Catalytic triplet validation of RhoⅡ

图7展示了RhoⅡ的二聚体和催化三联体结构,在RhoⅡ的两个反向对称的单体中均含有催化三联体,这种由Asp-Lys-Cys组成的催化三联体在酰胺水解酶中常被报道[26]。Asp促进了Cys巯基硫原子对底物酯键羰基碳原子的亲核攻击,导致底物酯键上碳原子和氧原子之间的共价键断裂。随后,水分子进入底物结合通道,形成酶-底物复合物的四面体过渡态中间体,水分子亲核攻击复合物中羰基碳原子,使Cys巯基硫原子与底物之间的共价键断开,释放产物邻苯二甲酸。

图7 RhoⅡ二聚体和催化三联体结构

Fig.7 Dimer and catalytic triad structure of RhoⅡ

2.3 Phe44位点突变对RhoⅡ水解特性的影响

为分析RhoⅡ不能水解DBP是否是由于空间位阻作用引起的,对RhoⅡ活性空腔的关键位点进行突变。Palm等[27]通过对水解酶MHETase的Phe424位突变,实现了其水解特性的转变,从原来水解对苯二甲酸单(2-羟乙基)酯转向能够水解对苯二甲酸双(2-羟乙基)酯。RhoⅡ与MHETase结构存在相似之处,包括蛋白活性状态均为二聚体、催化活性中心均在两个单体连接处的凹槽内,更重要的是在RhoⅡ中发现了对应的影响催化的关键位点Phe44。为使RhoⅡ底物结合空腔空间尺度增大,将Phe44位点替换Gln或Asn,期望通过突变拓宽酶的底物结合空腔,使酶与底物的结合更加牢固。图8为Phe44位点突变后对RhoⅡ异源表达、水解特性的影响。对构建成功的突变体F44Q、F44N进行诱导表达和相应的蛋白纯化,SDS-PAGE电泳分析结果如图8(a)。由图8(a)可见,F44N实现了过量表达,而F44Q蛋白可溶性表达较低,纯化结果显示条带单一,纯化效果较好。测定了纯酶水解PAEs能力,水解结果如图8(b)。由图8(b)可见,F44N显著提升了酶对DBP、DIBP的水解能力,说明Phe44突变为侧链R基体积减小的Asn44后,底物结合空腔体积增大,使RhoⅡ能容纳体积较大的DBP、DIBP,实现水解酶底物谱的改变。

不同小写字母表示组间数据差异显著。

图8 Phe44位点突变对RhoⅡ异源表达、水解特性的影响

Fig.8 Effect of Phe44 mutation on RhoⅡ heterologous expression and hydrolysis characteristics

分别将原酶RhoⅡ和突变酶F44N与DBP进行分子对接,结果如图9。Phe44的存在阻碍了酶与DBP的结合,当Phe44突变为Asn44后,氨基酸侧链R基体积减小使DBP能够进入结合空腔中,而RhoⅡ水解邻苯二甲酸单酯的能力因突变而丧失(图8)。这种由于结合空腔体积变化导致的底物谱相应改变已被广泛报道,例如酯酶RmEstB突变后结合空腔体积缩小,使C2(对硝基苯基乙酸酯,pNPA)、C4(对硝基苯基丁酸酯,pNPB)底物催化活性提升,而丧失了对C16(对硝基苯基棕榈酸酯,pNPP)长侧链底物的催化活性[23]。希望通过研究RhoⅡ对邻苯二甲酸单酯的催化机制,可以为其他邻苯二甲酸单酯水解酶理性设计提供参考,为实现PAEs侧链酯键的彻底水解提供理论依据。

蓝色结构为Phe44,红色结构为突变后Asn44,黄色结构为DBP。

图9 RhoⅡ、F44N和MBP的分子对接

Fig.9 Molecular docking of RhoⅡ and F44N with MBP

3 结 论

通过Native-PAGE电泳发现,RhoⅡ自然状态下为二聚体,序列比对和突变证明酶的催化三联体为Asp39、Lys127和Cys160,具有典型的α/β结构域,包括中心的6个β-折叠和两侧的6个α-螺旋。RhoⅡ能够水解邻苯二甲酸单酯的主要原因在于RhoⅡ中Lys200、Arg185的正电荷基团能够与羧基结合,通过催化三联体Asp39、Lys127和Cys160实现酯键断裂。对Phe44位点进行突变,发现突变为Asn后RhoⅡ的底物特异性发生改变。进一步分析表明,Phe44空间位阻作用的降低导致底物结合空腔体积增大,进而使侧链体积较大的邻苯二甲酸二酯成为RhoⅡ的优先底物,然而也是由于空腔体积的增加,单酯底物的羧基远离了带有正电荷的Lys200、Arg185,致使RhoⅡ突变酶F44N丧失水解邻苯二甲酸单酯的能力。本研究旨在初步解析邻苯二甲酸单酯水解酶RhoⅡ的水解机制,为酶的改造提供理论依据,进而为促进水解酶彻底水解邻苯二甲酸酯侧链双酯键的分子机制研究,为推动酶法降解技术在消除PAEs毒性方面更好的应用提供技术参考。

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Mutational Modification of Amidohydrolase RhoⅡ Derived from Rhodococcus sp. for Degradation of Phthalate Esters

HUANG Huiqin1, XU Youqiang1,2,*, LI Weiwei1,2, ZHANG Chengnan1,2, LI Xiuting1,2

(1.Beijing Advanced Innovation Center for Food Nutrition and Human Health,Beijing Technology and Business University,Beijing 100048,China;2.Beijing Engineering and Technology Research Center of Food Additives,Beijing 100048,China)

Abstract：Phthalate esters (PAEs) show physiological toxicity,and the key to reduce toxicity lies in the complete cleavage of side chain ester bonds.Amidohydrolase RhoⅡ is a hydrolytic enzyme acting on ester bond of monoalkyl phthalate esters,but cannot hydrolyze PAEs.RhoⅡ was modified by computer simulation and site-directed mutation to achieve the purpose of PAEs hydrolysis.Results of the molecular docking between RhoⅡ and monobutyl phthalate (MBP) showed that RhoⅡ stabilized the carboxyl group of MBP with R-groups of Lys200 and Arg185,and both monomers of MBP and RhoⅡ formed hydrogen bond interactions.The site-directed mutation indicated that Asp39,Lys127 and Cys160 formed the catalytic triplet of RhoⅡ,which as the active center positioned in the hydrophobic cavity of the enzymes.Additionally,the mutant enzyme F44N was obtained through site-directed mutation and could hydrolyze PAEs,which significantly improved the enzymatic hydrolysis efficiency toward dibutyl phthalate (DBP) and diisobutyl phthalate (DIBP) compared with the original enzyme.After phenylalanine mutated to asparagine,the steric hindrance effect of the enzyme on the substrate was significantly weakened,and the substrate binding cavity of the enzyme increased.DBP and DIBP could bind to the catalytic pocket of the enzyme to achieve ester bond cleavage.The catalytic mechanism was speculated based on molecular docking and mutation.The mutation might affect the substrate binding cavity,and the mutant enzyme could not effectively bind to the monoalkyl phthalate esters.This work performed sequence and structure analysis of RhoⅡ,and verified the catalyzed triplet.By finding the catalytic activity center of RhoⅡ and mutating the key site,the substrate specificity of RhoⅡ was changed.This study hoped that the enzyme resources related to enzymatic catalytic hydrolysis of PAEs could be expanded and promoted the application of related hydrolases.

Keywords：amidohydrolase; monoalkyl phthalate esters; molecular docking; catalytic triplet; site-directed mutation

中图分类号：TS201.2; TS201.6; Q814.9

文献标志码：A

doi：10.12301/spxb202300143

文章编号：2095-6002(2024)04-0125-10

引用格式：黄慧芹,徐友强,李微微,等.用于降解邻苯二甲酸酯的红球菌来源酰胺酶RhoⅡ突变改造[J].食品科学技术学报,2024,42(4):125-134.

HUANG Huiqin,XU Youqiang,LI Weiwei,et al.Mutational modification of amidohydrolase RhoⅡ derived from Rhodococcus sp.for degradation of phthalate esters[J].Journal of Food Science and Technology,2024,42(4):125-134.

收稿日期：2023-03-13

基金项目：国家自然科学基金资助项目(32072165)。

Foundation：National Natural Science Foundation of China(32072165).

第一作者：黄慧芹,女,硕士研究生,研究方向为白酒源微生物代谢机制。

*通信作者：徐友强,男,副教授,博士,主要从事传统发酵食品重要风味与功能因子生成机制研究。

(责任编辑：叶红波)