矢车菊素-3-O-葡萄糖苷(cyanidin-3-O-glucoside,C3G)是谷物中普遍存在的一种花青素,具有较强的抗氧化、抗炎、抗菌等有益活性[1]。然而,由于C3G的稳定性易受到pH值、温度、氧、光、酶、糖和矿物质等多种环境因素的影响[2],限制了其在食品中的使用范围。近年来,有研究表明花青素与蛋白质结合可以提高花青素的稳定性[3-4]。Fu等[5]研究发现,在酸性和中性条件下,卵清蛋白均能不同程度地增强花青素的热稳定性。Attaribo等[6]研究发现,C3G的加入降低了预热蚕蛹蛋白中α-螺旋的含量,增加了β-折叠和β-转角的数量;而添加质量分数为0.1%的多肽(ε-聚赖氨酸)也显著提高了花青素的颜色稳定性[7]。

豆类是人类获取优质植物性蛋白质的重要资源。黑豆中的蛋白质被认为是完全蛋白质,含有人体所需的8种必需氨基酸。黑豆的总氨基酸含量高达36%,其中有约13%是必需氨基酸。在黑豆的蛋白质中,主要成分有7S和11S球蛋白,它们分别约占黑豆总蛋白的30%和40%[8]。黑豆豆皮中富含花青素,C3G含量约占总花青素含量的98%[9]。前期研究结果表明,黑豆皮中的花青素可以通过与黑豆分离蛋白相互作用来增强其稳定性[10]。然而,关于不同pH值环境下黑豆表皮C3G与7S和11S相互作用的研究相对缺乏,且大多数蛋白质和花青素相互作用的研究都是在中性环境中进行的,这可能不能代表完整的食品加工条件。因此,本研究以C3G(黑豆外皮花青素)和黑豆球蛋白(7S和11S)为实验材料,研究了7S和11S对C3G氧化稳定性的保护作用以及7S和11S与C3G的结合机制,旨在为理解不同pH值条件下花青素与黑豆球蛋白的相互作用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

乌皮青仁黑豆,产自黑龙江省双鸭山市,购自上海亿升农产品有限公司。ABTS(纯度98%)、DPPH(纯度98%),上海阿拉丁生化科技股份有限公司;其余试剂均为分析纯,天津科米尔化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

GDA-20型凯氏定氮仪,山东格林凯瑞公司;UV-6100s型紫外分光光度计,上海美谱达公司;F-7100型荧光光谱仪,日本日立公司;ALPHA型傅里叶变换红外光谱仪,德国布鲁克公司。

1.3 实验方法

1.3.1 β-伴大豆球蛋白、大豆球蛋白和矢车菊素-3-O-葡萄糖苷的提取β-伴大豆球蛋白(7S)和大豆球蛋白(11S)的分离提取参照Wu等[11]的方法。将40 g脱脂黑豆粉与600 mL超纯水混合。添加3.12 g NaHSO3和适量的NaOH,使混合溶液的pH值达到8.65。室温下搅拌蛋白质溶液2 h后,离心去除沉淀物并收集上清液。将上清液的pH值调整至6.4,并在4 ℃、8 000 r/min的条件下离心20 min,得到沉淀。将沉淀物在pH值为7.0的超纯水中室温搅拌2 h使其溶解,然后在4 ℃、10 000 r/min的条件下离心 30 min,得到11S沉淀物。收集上清液后,将其pH值调整至5.5,并添加少量NaCl使其浓度达到 0.25 mol/L 后,在室温下搅拌20 min,4 ℃、9 000 r/min 的条件下离心15 min。离心后,用相同体积的超纯水稀释上清液并将其pH值调整至4.80。在相同条件下,继续离心20 min,收集到的沉淀为7S蛋白。将得到的7S和11S沉淀物溶解在10倍体积的超纯水中,并将溶液的pH值调节至7.20。使用分子质量为7 kDa的透析袋,在4 ℃的冰箱中透析溶液,每12 h更换一次透析液。透析结束后,将溶液冷冻干燥36 h,即可获得7S和11S蛋白粉。7S和11S的蛋白质质量分数采用凯氏定氮法测定,分别为97.4%±0.5%和95.6%±0.3%。

矢车菊素-3-O-葡萄糖苷(C3G)的提取参考文献[9],纯度为97%。

1.3.2 7S、11S和C3G复合溶液的配制

参考Nagy等[12]的方法并稍加修改。将7S、11S粉末分散在pH值为2.0、5.0和7.0的磷酸盐缓冲液(0.2 mol/L)中,室温下充分搅拌2 h使黑豆蛋白的最终质量浓度为1.0 mg/mL,在4 ℃冰箱静置 12 h 使蛋白质彻底水化。C3G样品同样分散在pH值为2.0、5.0和7.0的磷酸盐缓冲液(0.2 mol/L)中充分搅拌使其终质量浓度为0.4 mg/mL。将配好的7S、11S溶液与C3G溶液混合,在黑暗环境中搅拌30 min(150 r/min),得到7S、11S与C3G的复合溶液,复合溶液现配现用。

1.3.3 紫外可见光谱测定

参考Chen等[1]方法并稍加修改。将1.3.2节配制的蛋白质溶液和C3G溶液稀释至蛋白溶液质量浓度为0.1 mg/mL,C3G溶液质量浓度为0、0.01、0.02、0.03、0.04、0.05 mg/mL,使用紫外分光光度计在200～400 nm扫描7S-C3G、11S-C3G的紫外光谱。

1.3.4 荧光光谱测定

采用荧光光谱仪测定黑豆球蛋白的荧光光谱。7S和11S的狭缝宽度分别设置为10 nm和5 nm,在激发波长280 nm和发射波长300～450 nm处采集光谱。进行相互作用和数据分析之前,对荧光强度进行内滤和稀释效应的校正[13]。同步荧光光谱波长为200～400 nm,以Δλ=15 nm或Δλ=60 nm的分辨率进行测量。7S-C3G和11S-C3G中蛋白质和C3G浓度分别为0.4 μmol/L和0～60 μmol/L。

1.3.5 红外光谱测定

红外光谱波长为4 000～400 cm-1,分辨率为 32 cm-1,扫描16次。7S-C3G和11S-C3G中的蛋白质质量浓度为0.1 mg/mL,C3G质量浓度为 0.05 mg/mL,蛋白质二级结构含量由积分面积计算得出。

1.3.6 分子对接模拟

7S(PDB ID:3AUP)和11S(PDB ID:1OD5)结构从蛋白质数据库(https:∥www.rcsb.org/)下载,使用Discovery Studio 4.0(Biovia,美国)中的Clean和Prepare模块对下载的晶体结构进行处理,以完成加氢、去水、补全不完整残基等操作。C3G的结构从PubChem数据库(https:∥pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)下载,不同pH值条件下C3G的结构由欧洲分子生物学实验室的Chembl数据库(https:∥www.ebi.ac.uk/chembl/)构建得到。通过DS4.0将小分子的2D结构进行Ligand Prepare得到3D结构,以便与晶体对接测试。

1.3.7 C3G保留率的测定

通过测定C3G的含量,考察了C3G在不同pH值条件(pH=2.0、5.0、7.0)下的氧化稳定性。样品中加入不同体积分数的H2O2,混合搅拌30 min[6]。7S-C3G和11S-C3G中蛋白质和C3G质量浓度分别为0.3 mg/mL和0.05 mg/mL。用0.2 mol/L盐酸-氯化钾和0.2 mol/L乙酸-乙酸钠分别制备pH值为1.0和4.5的缓冲液,然后将0.4 mL样品溶液与3.2 mL缓冲溶液混合,在510 nm和710 nm处暗置20 min后测定吸光度,用pH示差法测定C3G的含量。C3G的保留率按式(1)计算[14]。

保留率

(1)

式(1)中,ApH1.0表示pH值为1.0时,溶液510 nm和710 nm的吸光度差;ApH4.5表示pH值为4.5时,溶液510 nm和710 nm的吸光度差;M,C3G的摩尔质量,449.2 g/mol;DF,稀释因子,10;ρ,C3G的质量浓度,0.05 mg/mL;ε,C3G的吸收系数,26 900 L·mol-1·cm-1;D,光程,1 cm。

1.3.8 自由基清除率测定

1)ABTS+自由基。参考Pellegrini等[15]的方法并稍加修改。将7 mmol/L ABTS原液与2.45 mmol/L过硫酸钾按体积比1∶1混合放置黑暗环境中产生ABTS+自由基,然后将0.3 mL样品溶液与2.7 mL的ABTS+溶液均匀混合后在黑暗环境中静置 20 min,之后测定样品在734 nm处的吸光度。

2)DPPH自由基。参考Brand-Williams等[16]的方法并稍加修改。将0.3 mL样品溶液与2.7 mL的80 μmol/L的DPPH溶液均匀混合后在黑暗环境中静置30 min,测定样品在515 nm处的吸光度。

ABTS+自由基和DPPH自由基清除率按式(2)计算。

自由基清除率

(2)

式(2)中,A0为ABTS+、DPPH空白对照的吸光度;A1为样品溶液的吸光度;A2为不含ABTS+、DPPH的样品溶液的吸光度。

1.4 数据处理

所有实验均重复3次,数据以平均值±标准偏差表示。P<0.05为差异显著。使用Microsoft Office Excel 2003对数据进行整理,IBM SPSS Statistics 19.0对数据进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 7S、11S与C3G相互作用分析

2.1.1 紫外光谱分析

7S-C3G、11S-C3G紫外光谱如图1。由图1可以看出,7S和11S在280 nm左右有一个较强的吸收峰,主要来自色氨酸、酪氨酸和一些酚羟基的吸收[17]。与C3G复合后,7S和11S的吸收强度都逐渐增加,且随着C3G质量浓度的增加,7S和11S的紫外吸光度有规律的增加,出现明显的吸光效应,最大吸收波长略有偏移,说明C3G改变了蛋白质氨基酸残基的微环境,证实了C3G与7S和11S之间产生了相互作用。此外,在不同pH值条件下,7S和11S在280 nm左右的吸收强度由高到低依次为pH值2.0、pH值7.0、pH值5.0,这可能是由于酸性条件下蛋白质变性,暴露出更多的发光氨基酸残基,增加了蛋白吸收强度;而pH值5.0接近蛋白质的等电点,导致蛋白质沉淀,吸收强度降低,这与Yang等[18]的研究结果一致。

2.1.2 荧光光谱分析

荧光光谱是研究蛋白质与小分子相互作用的一种简单、灵敏的方法。在280 nm激发波长下,7S和11S的荧光强度主要来源于酪氨酸(Tyr)、色氨酸(Trp)和苯丙氨酸(Phe)残基[17]。图2显示了加入C3G后7S和11S的荧光光谱。随着C3G浓度的增加,7S和11S的荧光强度都逐渐降低,这可能与氨基酸残基的猝灭有关。在pH值为2.0、5.0和7.0时,7S蛋白的最大发射波长分别为315、314、342 nm,可以推测在酸性条件下,7S蛋白质的荧光主要来自酪氨酸(Tyr)残基,而在中性条件下,主要来自色氨酸(Trp)残基[19]。相比之下,酸碱条件对11S的最大发射波长似乎影响不大,这与以往研究一致[20]。此外,即使添加过量的C3G(60 μmol/L),7S、11S只有部分荧光猝灭,说明有一部分荧光基团是C3G无法接近的[21]。荧光猝灭一般可分为静态猝灭、动态猝灭和动静结合猝灭3种。为了解猝灭机理,采用Stern-Volmer方程[式(3)]对荧光数据进行分析[22]。

=1+Ksv[Q]=1+Kqτ0[Q] 。

(3)

式(3)中,F0为7S和11S的荧光强度;F为7S-C3G和 11S-C3G的荧光强度;Ksv为F0/F的值和[Q]的线性方程的斜率,反映荧光基团对猝灭剂的敏感性;[Q]为猝灭剂浓度;Kq为双分子荧光猝灭速率常数;τ0是材料在没有猝灭剂的情况下的荧光平均寿命,一般生物分子的荧光平均寿命为1×10-8 s。

C3G诱导的7S和11S荧光猝灭的Stern-Volmer曲线均呈线性,见图2右图。7S-C3G/11S-C3G体系在pH值为2.0、5.0和7.0时的猝灭常数(Ksv、Kq和Ka)和结合位点数(n)见表1。C3G对7S和11S的猝灭速率常数Kq在5.64×1011～1.462×1012,说明所有反应都属于静态猝灭模式。在相同pH值条件下,7S-C3G和11S-C3G的Ksv随温度升高而降低,说明C3G与蛋白质之间能形成一定量的复合物。根据2.1节紫外光谱结果(图1),波形没有变化,但蛋白质构象发生了变化,这说明猝灭是静态的。因为静态猝灭只影响猝灭分子的激发态,对猝灭物质的吸收光谱没有影响[23]。从这3个方面可知,7S、11S和C3G之间的猝灭机制为静态猝灭。静态淬灭中的结合常数(Ka)和结合位点(n)由式(4)计算[24]。

(4)

Ka表示蛋白质与猝灭剂结合的亲和力。从表1的结果可以看出,在298 K,3种pH值条件下的Ka由大到小依次为11S-C3G(pH值7.0)、7S-C3G(pH值7.0)、7S-C3G(pH值2.0)、11S-C3G(pH值2.0)、7S-C3G(pH值5.0)、11S-C3G(pH值5.0),说明pH值和蛋白质种类都影响蛋白质与C3G的相互作用。Yang等[25]研究报道,当pH值接近等电点时,乳清蛋白对原花青素的亲和力增强。然而,7S-C3G在pH值为2.0时也具有较高的结合,这可能是因为酸性条件使7S变性并暴露出更多的结合位点。相同pH值条件下,7S-C3G和11S-C3G的Ka值均随温度的升高而降低,这表明7S、11S与C3G的相互作用是一个放热过程。此外,7S、11S和C3G在3种pH值条件下的结合位点都是1左右,表明7S、11S和C3G倾向于形成1∶1的复合物,这与Ma等[26]的结果一致。

2.1.3 热力学参数分析

复合物的热力学参数由范特霍夫方程[式(5)、式(6)]计算。

ΔG=-RTlnKa ;

(5)

ΔG=ΔH-TΔS 。

(6)

式(5)、式(6)中,R为理想气体常数,8.314 J/(mol·K);T为实验温度;ΔG、ΔH、ΔS分别为吉布斯自由能变化、焓变、熵变。

ΔH和ΔS的正负关系表征3种相互作用力:1)ΔH>0和ΔS>0,为疏水相互作用;2)ΔH<0和ΔS<0,范德华力和氢键;3)ΔH<0,ΔS>0,静电相互作用[27]。7S-C3G、11S-C3G在pH值为2.0、5.0、7.0时的热力学参数见表2。由表2可以看出,7S、11S和C3G在3种pH值条件下相互作用的ΔG为负,说明它们之间的相互作用为自发过程。在pH值为5.0时,7S、11S与C3G主要通过静电相互作用形成7S-C3G和11S-C3G,在pH值为2.0和7.0时,7S、11S与C3G主要通过范德华力和氢键相互作用形成7S-C3G和11S-C3G。

2.1.4 同步荧光光谱分析

同步荧光光谱可以通过测量Tyr(Δλ=15 nm)或Trp(Δλ=60 nm)残基的微环境信息来反映蛋白质结构的变化[28],见图3。从图3可以看出,随着C3G浓度的增加,蛋白质的荧光强度变弱,说明C3G与蛋白质发生了相互作用。此外,当pH值从2.0增加到7.0时,Δλ=15 nm处7S的最大发射波长从284.0 nm增加到285.2 nm,11S的最大发射波长从286.2 nm增加到290.0 nm,而在Δλ=60 nm处7S、11S的发射波长似乎不受影响,说明pH值可以诱导蛋白质中Tyr残基的最大发射波长的变化。与C3G复合后,Δλ=15 nm时的7S-C3G(pH值2.0)、7S-C3G(pH值5.0)、11S-C3G(pH值2.0)、11S-C3G(pH值5.0)、11S-C3G(pH值7.0)分别红移1.3、1.2、2.4、0.8、1.0 nm,表明酸性条件下C3G与7S和11S之间复合物的形成导致Tyr残基周围的疏水环境减弱,而极性增加[26]。

2.1.5 二级结构变化分析

红外光谱可以通过酰胺Ⅰ波段吸光度峰的变化来反映蛋白质的二级结构[29]。7S和11S含有4种二级结构(α-螺旋结构、β-折叠结构、β-转角结构和无规则螺旋结构),其中α-螺旋结构含量较低。在pH值为2.0、5.0和7.0时C3G与 7S和11S相互作用的二级结构含量见表3。由表3数据可知,在相同的pH值变化下,7S和11S二级结构的比例变化趋势几乎一致。此外,pH值为2.0和5.0时,所有样品的α-螺旋含量普遍低于pH值为7.0时的α-螺旋含量,这可能是因为酸性环境会影响氢键的稳定性,从而导致α-螺旋的损失[30]。在pH值为2.0和5.0时,C3G的存在导致7S和11S中α-螺旋和无规则螺旋结构的增加,而β-折叠比例下降,这与Ren等[31]的结果一致。pH值为7.0时,C3G存在的7S和11S中α-螺旋和β-折叠的含量呈增加趋势,但β-转角相反[17]。结果表明,不同pH值条件下,C3G的存在均引起了7S、11S二级结构比例的变化。

2.1.6 C3G与7S、11S的分子对接结果分析

为进一步从理论上理解7S-C3G和11S-C3G之间相互作用的本质,使用Discovery Studio 4.0软件模拟复合物的分子对接。强酸条件下C3G的主要结构为黄烊盐阳离子,弱酸及中性条件下的结构主要为甲醇假碱、查尔酮和醌式碱。关于这4种物质的基本结构和性质,参考Pina等[32]的研究。

C3G与7S、11S的分子对接结果见图4。由图4可知,黄烊盐阳离子与7S中9个氨基酸残基(LEU96、HIS46、SER98、GLN277、GLY44、GLY228、SER267、PRO101、GLN105)形成范德华力与7个氨基酸残基(MET97、ASN45、ASN43、ARG356、GLN104、THR106、ASP41)形成氢键,其中ASN43与A环上5-OH形成氢键,ASP41与A环上7-OH形成氢键,氢键距离分别为1.90 Å和2.66 Å;GLN104与B环上的3′-OH形成氢键,氢键距离为1.88 Å;ASN45与糖基的6-OH形成氢键,氢键距离为 2.77 Å; ARG356与C环上的氧离子形成氢键,氢键距离为2.86 Å。黄烊盐阳离子与11S的MET177、ASN159、PRO160、TYR164、PRO169、ASP170和SER203形成范德华力相互作用,与THR176、GLU172、HIS173、VAL204和GLY202形成氢键相互作用,其中GLU172和HIS173与B环上的4′-OH形成氢键,氢键距离分别为2.60 Å和2.12 Å;GLY202与A环上的7-OH形成氢键,氢键距离为1.95 Å;THR176与糖基上的2-OH、3-OH形成氢键,氢键距离分别为2.27 Å和2.24 Å。

C3G的甲醇假碱结构与7S中的8个氨基酸残基(HIS46、SER98、ASN45、MET97、GLY44、THR99、ASN43和GLN104)形成范德华力相互作用,与5个氨基酸残基(THR106、GLN227、ASP41、SER267和ARG356)形成氢键相互作用,与PRO101形成疏水相互作用,与GLU229形成静电相互作用。其中ASP41和SER267与A环上的7-OH形成氢键,距离为1.99 Å和2.59 Å;GLN227与C环上的2-OH形成氢键,距离为1.99 Å;ARG356和糖基上的2-OH形成氢键,距离为1.97 Å;THR与糖基上的6-OH形成氢键,距离为1.89 Å。C3G的甲醇假碱结构与11S中的THR176、VAL162和GLY202形成氢键相互作用,与MET177、ILE171和ARG161形成疏水相互作用,其中VAL与A环上的5-OH形成氢键,距离为3.08 Å;THR176与A环上的7-OH形成氢键,距离为1.96 Å;VAL162与A环上的6-OH形成氢键,距离为2.14 Å。

C3G的查尔酮结构与7S的MET97、ASN43、THR99、ARG356和GLN104形成氢键相互作用。其中ARG356与A环上的5-OH形成氢键,距离为2.74 Å;ARG356与糖基上的6-OH形成氢键,距离为2.06 Å;MET97与B环上的3’-OH形成氢键,距离为1.88 Å;ASN43与C环开环形成的羟基形成氢键,距离为2.10 Å。C3G的查尔酮结构与11S的ASN159、ILE171、HIS173、PHE163、GLU172、MET177、PRO169和GLY201形成范德华力相互作用,与ARG161、PRO160、THR176和VAL162形成氢键相互作用。其中PRO160与糖基上的2-OH和3-OH形成氢键,距离为3.03 Å和1.99 Å;THR176与C环上开环形成的羟基形成氢键,距离为2.07 Å;ARG161与C环上开环形成的羰基形成氢键,距离为2.42 Å。

花青素C3G在碱性条件下主要以醌式碱结构存在,醌式碱与7S的MET97、THR99、SER98、HIS46、ASN45、GIY44、ASN43和GLN104形成范德华力相互作用,与ARG356、GLN227、SER267、ASP41和THR106形成氢键相互作用。其中ASP41和SER267与A环上的7-OH形成氢键,氢键距离分别为1.96 Å和2.83 Å;ARG356和糖基上的2-OH形成氢键,THR106和糖基上的6-OH形成氢键,氢键距离分别为2.65 Å和1.91 Å。与11S中的ASP170、TYR164、VAL204、HIS173、MET177和ASN159形成范德华力相互作用,与GLU172、PRO160、ARG161和THR176形成氢键相互作用,与VAL162、ILE171、ARG161和PHE163形成疏水相互作用。其中PRO160与A环上5-OH形成氢键,距离为1.80 Å;GLU172与A环上的7-OH形成氢键,距离为2.15 Å;THR176与糖基上的2-OH形成氢键,距离为2.10 Å;ARG161与糖基上的氧、6-OH形成氢键,距离为2.84 Å和1.78 Å。

结果表明,在酸性及中性条件下,C3G与7S、11S主要通过范德华力和氢键相互作用,这与之前的热力学分析结果一致。许多学者利用密度泛函数理论研究了C3G结构的活性,研究结果表明C3G结构A环和B环上的氢氧根是影响花青素抗氧化活性的关键基团[33-34]。只有特定的氨基酸残基与C3G羟基形成氢键。从分子对接结果可以看出,C3G在不同结构下,不同的氨基酸残基能与A环和B环上的羟基相互作用形成氢键。由此可以推断,在C3G与7S、11S结合过程中,酚羟基和氨基酸残基通过氢键相互作用辅助两者结合,有利于配体分子在蛋白质活性位点上更好地发挥靶向作用。总的来说,在这3种pH值条件下,C3G更容易通过范德华力和氢键与7S和11S相互作用,同时也会涉及少量的疏水相互作用和静电相互作用。

2.2 7S、11S对氧化环境中C3G活性的影响

2.2.1 对氧化稳定性的影响

7S、11S对C3G氧化稳定性的保护作用如图5。实验结果表明,在不同pH值条件下,随着H2O2体积分数的增加,C3G残留含量逐渐降低;7S-C3G、11S-C3G的C3G含量显著高于C3G对照组(P<0.05),C3G的残留量在pH值为2.0时最高,在pH值为7.0时最低,说明在酸性条件下,C3G具有更高的氧化稳定性。这是因为酸性条件下C3G主要以黄烊盐阳离子的形式存在,中性条件下是以黄烊盐阳离子、甲醇假碱、查尔酮和醌式碱共存的形式存在[35]。在pH值为2.0时,体积分数0.02%的H2O2条件下,各样品组的C3G残留量均大于75.00%,C3G对照组、7S-C3G和11S-C3G中C3G残留量分别为75.25%、86.88%和80.20%。结果表明,在pH值为2.0条件下,7S比11S更能增强C3G的氧化稳定性。相反,在pH值为7.0条件下,各样品组中C3G的残留量均小于30.00%,并且在体积分数0.01%和0.02%的H2O2条件下,11S-C3G中C3G残留量均高于7S-C3G,分别为28.10%和23.60%。实验结果表明,在pH值为2.0、5.0和7.0时,7S、11S与C3G的相互作用均可增强C3G的氧化稳定性。

2.2.2 对抗氧化活性的影响

研究证明,花青素与蛋白质相互作用有利于提高其抗氧化能力[36]。以ABTS+和DPPH自由基清除率为指标评估了在氧化环境下7S、11S对花青素C3G抗氧化活性的影响,见图6。由图6可知,在不同pH值条件下,C3G与7S、11S相互作用均增强了C3G的抗氧化能力。在pH值为 5.0的条件下,样品组均具有最高的自由基清除率,表明弱酸环境更有利于发挥C3G的抗氧化活性。pH值为 2.0时,7S、11S对C3G抗氧化活性的保护作用一方面是由于酸性条件下C3G结构的稳定,另一方面是蛋白质在酸性环境下发生部分变性,无规则卷曲结构增加更易于ABTS+、DPPH自由基发生反应[37]。pH值为 7.0时,7S-C3G的抗氧化活性要强于 11S-C3G,这可能是因为7S具有更多的疏水区域,与C3G作用力更强。

3 结 论

研究利用紫外光谱、荧光色谱、红外色谱等多种光谱学技术结合热力学分析和分子对接技术考察了pH值为2.0、5.0、7.0时,7S、11S与C3G相互作用的机理及相互作用和其对C3G氧化稳定性的影响。研究结果表明,在不同pH值条件下,C3G与7S、11S球蛋白的主要结合力不同,pH值为5.0时,7S、11S与C3G主要通过静电相互作用形成7S-C3G和11S-C3G,pH值为2.0和7.0时,7S、11S与C3G主要通过范德华力和氢键相互作用形成7S-C3G和11S-C3G。C3G通过静态猝灭模式使7S、11S的荧光基团猝灭。C3G与7S、11S复合会改变蛋白质的二级结构,pH值为2.0和5.0时,C3G使7S和11S结构中的部分β-折叠转化为α-螺旋,pH值为7.0时,7S和11S蛋白中的α-螺旋和β-折叠的含量呈现出增加的趋势,但β-转角相反。此外,分子对接结果表明,C3G的不同结构与7S、11S球蛋白主要通过氢键和范德华力相互作用结合,7S上的GLU229、ARG356和PRO101残基,11S上的ARG161、VAL162、ILE171和THR176残基在与C3G结合中起关键作用,7S、11S通过与C3G的酚羟基结合进一步保护C3G的氧化稳定性。

本研究分析了不同pH值条件下7S-C3G、11S-C3G的作用机制,研究结果表明,7S和11S作为C3G的载体在功能食品或具有更高营养价值的改性天然色素添加剂的配方中具有一定的应用潜力。未来,将进一步研究7S-C3G、11S-C3G的活性和稳定性,以最大限度地发挥该复合物在不同食物体系中的生物活性。

参考文献：

[1] CHEN Z Q,WANG C,GAO X D,et al.Interaction characterization of preheated soy protein isolate with cyanidin-3-O-glucoside and their effects on the stability of black soybean seed coat anthocyanins extracts[J].Food Chemistry,2019,271:266-273.

[2] SELIG M J,CELLI G B,TAN C,et al.High pressure processing of beet extract complexed with anionic polysaccharides enhances red color thermal stability at low pH[J].Food Hydrocolloids,2018,80:292-297.

[3] CORTEZ R,LUNA-VITAL D A,MARGULIS D,et al.Natural pigments:stabilization methods of anthocyanins for food applications[J].Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety,2017,16(1):180-198.

[4] HE W J,MU H B,LIU Z M,et al.Effect of preheat treatment of milk proteins on their interactions with cyanidin-3-O-glucoside[J].Food Research International,2018,107:394-405.

[5] FU X Z,BELWAL T,HE Y H,et al.Interaction and binding mechanism of cyanidin-3-O-glucoside to ovalbumin in varying pH conditions:a spectroscopic and molecular docking study[J].Food Chemistry,2020,320:126616.

[6] ATTARIBO T,JIANG X Z,HUANG G Q,et al.Studies on the interactional characterization of preheated silkworm pupae protein (SPP) with anthocyanins (C3G) and their effect on anthocyanin stability[J].Food Chemistry,2020,326:126904.

[7] CHUNG C,ROJANASASITHARA T,MUTILANGI W,et al.Stability improvement of natural food colors:impact of amino acid and peptide addition on anthocyanin stability in model beverages[J].Food Chemistry,2017,218:277-284.

[8] JOHN H,CHANDRA P,GIRI S K,et al.Effect of processing methods on 11S/7S protein and nitrogen solubility index of soy protein isolate[J].Journal of the Institution of Engineers (India),Series A,2021,102(4):89-994.

[9] XIE Y L,ZHU X L,LI Y,et al.Analysis of the pH-dependent Fe(III) ion chelating activity of anthocyanin extracted from black soybean[Glycine max (L.) Merr.]coats[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry,2018,66(5):1131-1139.

[10] WANG C,XIE Y L.Interaction of protein isolate with anthocyanin extracted from black soybean and its effect on the anthocyanin stability[J].Journal of Food Science,2019,84(11):3140-3146.

[11] WU D,TANG L,DUAN R,et al.Interaction mechanisms and structure-affinity relationships between hypero-side and soybean β-conglycinin and glycinin[J].Food Chemistry,2021,347:129052.

[12] NAGY K,COURTET-COMPONDU M C,WILLIAMSON G,et al.Non-covalent binding of proteins to polyphenols correlates with their amino acid sequence[J].Food Chemistry,2012,132(3):1333-1339.

[13] REN C,XIONG W F,LI J,et al.Comparison of binding interactions of cyanidin-3-O-glucoside to β-conglycinin and glycinin using multi-spectroscopic and thermodynamic methods[J].Food Hydrocolloids,2019,92:155-162.

[14] JIANG D Q,GUO Y,XU D H,et al.Antioxidant and anti-fatigue effects of anthocyanins of mulberry juice puri-fication (MJP) and mulberry Marc purification (MMP) from different varieties mulberry fruit in China[J].Food and Chemical Toxicology:an International Journal Published for the British Industrial Biological Research Association,2013,59:1-7.

[15] PELLEGRINI N,VISIOLI F,BURATTI S,et al.Direct analysis of total antioxidant activity of olive oil and studies on the influence of heating[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry,2001,49(5):2532-2538.

[16] BRAND-WILLIAMS W,CUVELIER M E,BERSET C.Use of a free radical method to evaluate antioxidant activity[J].LWT-Food Science and Technology,1995,28(1):25-30.

[17] LIU F G,MA C C,MCCLEMENTS D J,et al.A comparative study of covalent and non-covalent interactions between zein and polyphenols in ethanol-water solution[J].Food Hydrocolloids,2017,63:625-634.

[18] YANG Y X,WANG Q M,LEI L,et al.Molecular interaction of soybean glycinin and β-conglycinin with (-)-epigallocatechin gallate induced by pH changes[J].Food Hydrocolloids,2020,108:106010.

[19] SHAKLAI N,YGUERABIDE J,RANNEY H M.Interaction of hemoglobin with red blood cell membranes as shown by a fluorescent chromophore[J].Biochemistry,1977,16(25):5585-5592.

[20] ZHANG L L,WANG Y M,XU M,et al.Galloyl moieties enhance the binding of (-)-epigallocatechin-3-gallate to β-lactoglobulin:a spectroscopic analysis[J].Food Chemistry,2017,237:39-45.

[21] CASANOVA F,CHAPEAU A L,HAMON P,et al.pH-and ionic strength-dependent interaction between cyanidin-3-O-glucoside and sodium caseinate[J].Food Chemistry,2018,267:52-59.

[22] LIU E H,QI L W,LI P.Structural relationship and binding mechanisms of five flavonoids with bovine serum albumin[J].Molecules,2010,15(12):9092-9103.

[23] GAO X,BI H N,JIA J J,et al.Spectroscopic and in silico study of binding mechanism of cynidine-3-O-glucoside with human serum albumin and glycated human serum albumin[J].Luminescence,2017,32(4):640-651.

[24] ZHANG H M,WU P R,WANG Y Q,et al.Affinity of miriplatin to human serum albumin and its effect on protein structure and stability[J].International Journal of Biological Macromolecules,2016,92:593-599.

[25] YANG W,XU C Q,LIU F G,et al.Native and thermally modified protein-polyphenol coassemblies:lactoferrin-based nanoparticles and submicrometer particles as protective vehicles for (-)-epigallocatechin-3-gallate[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry,2014,62(44):10816-10827.

[26] MA Z,CHENG J,JIAO S S,et al.Interaction of mulberry anthocyanins with soybean protein isolate:effect on the stability of anthocyanins and protein in vitro digestion characteristics[J].International Journal of Food Science &Technology,2022,57(4):2267-2276.

[27] CAO X Y,HE Y L,KONG Y C,et al.Elucidating the interaction mechanism of eriocitrin with β-casein by multi-spectroscopic and molecular simulation methods[J].Food Hydrocolloids,2019,94:63-70.

[28] GUO M,LÜ W J,LI M H,et al.Study on the binding interaction between carnitine optical isomer and bovine serum albumin[J].European Journal of Medicinal Chemistry,2008,43(10):2140-2148.

[29] ZHANG Y,WRIGHT E,ZHONG Q X.Effects of pH on the molecular binding between β-lactoglobulin and bixin[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry,2013,61(4):947-954.

[30] TOMCZY SKA-MLEKO M,KAMYSZ E,SIKORSKA E,et al.Changes of secondary structure and surface tension of whey protein isolate dispersions upon pH and temperature[J].Czech Journal of Food Sciences,2014,32(1):82-89.

[31] REN C,XIONG W F,PENG D F,et al.Effects of thermal sterilization on soy protein isolate/polyphenol complexes:aspects of structure,in vitro digestibility and antioxidant activity[J].Food Research International,2018,112:284-290.

[32] PINA F,OLIVEIRA J,DE FREITAS V.Anthocyanins and derivatives are more than flavylium cations[J].Tetrahedron,2015,71(20):3107-3114.

[33] ALI H M,ALI I H.A DFT and QSAR study of the role of hydroxyl group,charge and unpaired-electron distribution in anthocyanidin radical stabilization and antioxidant activity[J].Medicinal Chemistry Research,2017,26(10):2666-2674.

[34] SINOPOLI A,CALOGERO G,BARTOLOTTA A.Computational aspects of anthocyanidins and anthocyanins:a review[J].Food Chemistry,2019,297:124898.

[35] XIE Y L,MA M Y,ZHANG C Y,et al.Experimental and theoretical research on the effect of coupling heat and pH on the structure and antioxidant activity of cyanidin-3-O-glucoside from black soybean coat[J].Journal of the Science of Food and Agriculture,2021,102(5):1842-1850.

[36] LI J,WANG B X,HE Y,et al.A review of the interaction between anthocyanins and proteins[J].Food Science and Technology International,2021,27(5):470-482.

[37] LI T,WANG L,CHEN Z X,et al.Functional properties and structural changes of rice proteins with anthocyanins complexation[J].Food Chemistry,2020,331:127336.

Study on Interaction Between Two Black Bean Globulins and Cyanidin-3-O-Glucoside

LIU Jinjie, MA Mengyao, XIE Yanli*, YANG Yuhui, SUN Shumin, MA Weibin, LI Qian

(College of Food Science and Engineering/Henan Key Laboratory of Cereal and Oil Food Safety Inspection and Control, Henan University of Technology,Zhengzhou 450001,China)

Abstract：The main forms of cyanidin-3-O-glucoside (C3G) in various pH environments are different,leading to differences in its antioxidant capacity.Black bean protein,a common dietary protein,has the potential to serve as a carrier for unstable bioactive compounds.Understanding the interaction mechanism between black bean protein and C3G is beneficial for their application in food systems.Interactions between β-conglycinin(7S)and glycinin(11S)soybean proteins with C3G and their effects on the oxidative stability and antioxidant capacity of C3G at pH 2.0,5.0,and 7.0 were investigated using various spectroscopic analyses and molecular docking experiments.The results showed that binding of C3G with 7S and 11S at pH 2.0 and 5.0 not only reduced the hydrophobic environment around Tyr residues and increased polarity,but also increased α-helical content and decreased β-sheet content in both 7S and 11S.At pH 7.0,the presence of C3G led to an increase in both α-helical and β-sheet content in 7S and 11S except for β-turns.Furthermore,the binding of C3G with 7S and 11S was an exothermic process,and at different pH conditions,hydrogen bonding and van der Waals forces were the main driving forces for the interaction between C3G with 7S and 11S,resulting in static fluorescence quenching of 7S and 11S.Both 7S and 11S exhibited the highest affinity for C3G at pH 7.0.Molecular docking revealed that GLU229,ARG356,and PRO101 residues on 7S,and ARG161,VAL162,ILE171,and THR176 residues on 11S played key roles in the binding with C3G.Moreover,the binding of 7S and 11S with C3G significantly enhanced the oxidative stability and antioxidant capacity of C3G at different pH conditions.

Keywords：cyanidin-3-O-glucoside; β-conglycinin; glycinin; interaction; spectral characteristic; molecular simulation

中图分类号：TS214.2

文献标志码：A

doi：10.12301/spxb202300496

文章编号：2095-6002(2024)04-0101-13

引用格式：刘金杰,马梦瑶,谢岩黎,等.2种黑豆球蛋白与矢车菊素-3-O-葡萄糖苷的相互作用研究[J].食品科学技术学报,2024,42(4):101-113.

LIU Jinjie,MA Mengyao,XIE Yanli,et al.Study on interaction between two black bean globulins and cyanidin-3-O-glucoside[J].Journal of Food Science and Technology,2024,42(4):101-113.

收稿日期：2023-08-15

基金项目：国家自然科学基金资助项目(31972003);河南省高校科技创新团队项目(20IRTSTHN023)。

Foundation：National Natural Science Foundation of China (31972003);Innovative Research Team (in Science &Technology) at University of Henan Province (20IRTSTHN023).

第一作者：刘金杰,男,硕士研究生,研究方向为食品营养与安全。

*通信作者：谢岩黎,女,教授,博士,主要从事食品营养与安全方面的研究。

(责任编辑：张逸群)