白酒风味独特,这些风味大多来源于发酵过程中的微生物代谢。这一过程产生的代谢物对白酒的风味和品质有较大影响。以往的研究分析了老白干白酒中挥发性特征风味成分的组成及其变化规律[1]。然而,对于老白干白酒在发酵过程中难挥发性代谢物的组成及其变化,目前仍知之甚少。

老白干香型白酒的酿造是以高粱为原料,中温大曲为糖化发酵剂,采用“混蒸续”的“老五甑”工艺或“清蒸清烧”的“三排净”工艺生产的。除了原料、中温大曲和独特的工艺外,还有采用地缸发酵和出酒率高(达50%)等特点。“老白干”含义为历史悠久(老)、酒色清激透明(白)和酒度高(干)。老白干香型白酒是2004年正式确认的一种白酒香型,具有“酒体纯净、醇香清雅、甘冽丰柔”的特点[2-3]。老白干白酒发酵过程中的代谢物及其涉及的生化代谢途径极为复杂,包括碳水化合物、蛋白质和脂质等大分子物质水解为单糖、氨基酸和脂肪酸等初级代谢,以及进一步的次级代谢产生风味化合物和生物活性成分等。王广南[4]、向玉萍[5]、张庄英[6]采用衍生化结合气相色谱-质谱联用(gas chromatography-mass spectrometry,GC-MS)或高效液相色谱(high performance liquid chromatography,HPLC)技术分析了老白干白酒中的不挥发性有机酸、氨基酸、糖和糖醇类物质的组成与含量。然而,仅分析单一类别或特定代谢物并不能全面理解老白干白酒的代谢特性。相较于传统的GC-MS和HPLC技术,超高效液相色谱-串联质谱联用(ultra-high liquid chromatography-tandem mass spectrometry,UPLC-MS/MS)技术在分析难挥发性化合物方面具有诸多优势,如高通量、高选择性、高灵敏度和高效率[7]。将UPLC-MS/MS结合化学计量学的非靶向代谢组学分析应用于老白干白酒的研究,能够有效检测多种化合物,挖掘有价值的代谢信息[8]。此方法有助于揭示发酵食品在整个加工过程中低分子质量代谢物的变化,筛选出差异代谢物,并解析其代谢机制[9]。已有研究使用该方法阐明了黄水[10]和大曲[11]等在发酵过程中的标志性代谢物及其潜在的关键代谢途径。

本研究采用了UPLC-MS/MS技术解析老白干白酒发酵过程中酒醅的代谢物组成。通过多变量统计学分析,确定关键的差异代谢物及其变化规律。同时,结合KEGG数据库注释来解析这些差异代谢途径。该研究对于揭示老白干白酒中难挥发性化合物的组成特性可提供重要的理论支撑,并为改善老白干白酒的风味品质提供了重要导向和理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

酒醅样品于2023年3月10日—4月15日取自河北衡水老白干酒业股份有限公司,采样后立即贮存于-20℃条件下,用于后续分析。

甲醇、乙腈、异丙醇和甲酸,均为色谱纯,美国Fisher公司;L-2-氯苯丙氨酸(分析纯),阿达玛斯贝塔(上海)化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

Q Exactive HF-X型超高效液相色谱串联傅里叶变换质谱仪,配ACQUITY UPLC HSS T3 100 mm×2.10 mm×1.80 μm分离柱,美国赛默飞公司;Wonbio-96c型高通量组织破碎仪,上海万柏生物科技有限公司;SBL-10DT型超声波清洗机,宁波新芝生物科技股份有限公司;Centrifuge 5430R型高速冷冻离心机,德国Eppendorf公司。

1.3 实验方法

1.3.1 样品的采集

按照Geng等[12]的方法采样。酿酒车间中每个发酵批次共有108个地缸,采样批次中不同地缸(高度1.2 m,直径0.8 m,厚度0.15 m)内的原料、酒曲、发酵工艺和发酵时间等均相同,整个发酵过程于地缸中封闭进行。从酿酒车间的中间位置选择一个发酵批次的12个地缸,将它们作为该批次的代表性取样地缸,在每个取样的发酵时间点随机选取4个地缸进行取样,在地缸的上、中和下层3个位置各取100 g的酒醅样品,混合均匀作为该地缸的代表性样品,-20 ℃贮存,用于代谢物分析。酒醅的地缸取样位置和地缸中酒醅的采样点示意图见图1。

研究发现,发酵第0、2、6、8、14、17、22、29、36天(发酵结束)的理化参数具有显著性差异,表明这些发酵时间点代谢较为旺盛,代谢物差异较大,进而会代谢为较多的风味化合物及其前体物[12]。所以,本研究选择这些关键发酵时间点取样,共采得36个样品,未发酵(第0天)的4个平行样品分别标识为FG0d-1、FG0d-2、FG0d-3和FG0d-4,其他样品以此类推,具体样品信息详见表1。

1.3.2 代谢物的检测

1.3.2.1 样品预处理

参考文献[13]的方法对样品进行预处理,并稍作修改。精确称取50 mg酒醅样品于2 mL离心管中,加入400 μL V(甲醇)∶V(水)=4∶1的提取液,提取液中内标L-2-氯苯丙氨酸的质量浓度为0.02 mg/mL。冷冻研磨6 min (-10 ℃,50 Hz)后,超声提取30 min (5 ℃,40 kHz),再于-20 ℃静置30 min,最后于4 ℃ 11 063 r/min离心15 min,取上清液于进样小瓶中上机分析。

1.3.2.2 UPLC色谱条件

流动相A为体积分数5%乙腈和体积分数0.1%甲酸的水溶液,流动相B为体积分数为47.5%乙腈、体积分数为47.5%异丙醇和体积分数为0.1%甲酸的水溶液;流速0.40 mL/min,进样量3 μL,柱温40 ℃。流动相洗脱梯度见表2。

1.3.2.3 质谱条件

电喷雾电离为正离子和负离子扫描;鞘气流速5 066.25 kPa;辅助气流速1 317.23 kPa;毛细管电压3.5 kV (正离子模式)和-3.5 kV (负离子模式);毛细管温度325 ℃;一级质谱分辨率:60 000 u;二级质谱分辨率7 500 u;碰撞能:20、40、60 eV循环;扫描范围m/z 70～1 050 u;雾化器压强344.74 kPa。

1.4 数据处理

使用Progenesis QI(美国Waters公司)对原始数据进行峰识别、峰提取、峰对齐和积分等处理,然后将代谢物特征峰与数据库HMDB (http:∥www.hmdb.ca/)、Metlin (https:∥metlin.scripps.edu/)和上海美吉生物医药科技有限公司自建库进行匹配和鉴定。最后,选取MS质量误差小于1.0×10-5的数据,采用总和归一化法对质谱峰的响应强度进行归一化处理,并进行对数化(lg)计算,处理后的数据以平均值±标准偏差(n=4)表示(见附表1),同时删除质控(quality control,QC)样品(由每个分析样品各取部分混合而成)相对标准偏差(RSD)>30%的代谢物,得到最终用于后续分析的数据。通过上海美吉生物医药科技有限公司生物云平台(https:∥cloud.majorbio.com/page/tools/)进行饼图和火山图的分析和绘制;使用微科盟生科云(https:∥ www.bioincloud.tech)计算并绘制主成分分析(principal component analysis,PCA)图,使用微生信(https:∥www.bioinformatics.com.cn)绘制水平条形图,使用Origin2021对数据进行均一化处理后绘制热图。

2 结果与分析

2.1 老白干白酒酒醅中代谢物的分类

研究采用UPLC-MS/MS技术对酒醅样品进行代谢物谱分析,在正离子模式下共检测到7 766个质谱峰,通过数据库鉴定出1 155种化合物;负离子模式下共检测到6 101个质谱峰,鉴定出1 002种化合物;2种离子模式下共鉴定出2 157种代谢物,具体的化合物信息详见附表1。鉴定的代谢物包括氨基酸、肽及其类似物(422种),杂环类(289种),脂肪酰类(242种),黄酮和异黄酮类(198种),碳水化合物及其结合物(157种)和苯环类(149种)等,前9类占比79.52%,见图2。这些代谢物主要是通过微生物发酵代谢、美拉德反应和酶促反应等过程产生的,是白酒风味代谢的重要前体物或底物[14]。

2.2 老白干白酒不同发酵时间点酒醅中差异代谢物分析

研究对不同发酵时间点的酒醅中代谢物进行主成分分析,分析结果见图3。前两个主成分累计方差贡献率为81.17%,0～8 d均显著区分于其他发酵时间点,说明这些发酵时间点之间代谢活跃,因而存在较多的差异代谢物。其中,FG0d和FG2d的样品分别集中在第一和三象限,主要差异代谢物种类是氨基酸、肽及其类似物,杂环类,碳水化合物及其结合物,苯环类和脂肪酰类等;FG6d和FG8d的样品被区分并集中在第四象限,主要差异代谢物种类除了杂环类和碳水化合物及其结合物,还包括黄酮和异黄酮类和孕烯醇酮脂类等,FG14d～FG29d较为集中,FG36d的样品集中在第二象限,脂质和类脂分子是区别于其他样品的代谢物。

不同发酵时间点酒醅中差异代谢物的火山图,见图4。由图4可知,不同发酵时间点之间代谢物的种类和含量发生了不同程度的显著变化。其中,FG0d-FG2d、FG2d-FG6d、FG6d-FG8d、FG8d-FG14d、FG14d-FG17d、FG17d-FG22d、FG22d-FG29d和FG29d-FG36d相邻2个取样点间的显著差异代谢物数量分别为808、522、207、469、160、424、223和332个,共占注释到代谢途径化合物总量的63.69%。

火山图中每个点代表一个代谢物,横坐标为对数化处理的代谢物在两组中表达量均值差异倍数(fold change,FC),以log2(FC)表示。横坐标的绝对值越大,表明两组之间该代谢物的差异越大;纵坐标为对数化处理的两组间代谢物表达量的t检验的P值,以-lg(P)表示,纵坐标值越大,差异越显著;图中蓝色和红色点分别代表上调和下调的差异表达代谢物;点的大小代表VIP(PLS-DA)值。值得注意的是,FG0d-FG2d和FG2d-FG6d样品之间均有超过70%的代谢物显著上调,主要包括氨基酸、肽及其类似物,脂类,杂环类和碳水化合物及其结合物等;它们之间的极显著差异代谢物(VIP>2;P<0.01;|log2(FC)|>0.5)分别是18种和33种,前者包括Nε-乙酰-L-赖氨酸、溶血磷脂酰胆碱(lysophosphatidylcholine,LysoPC)和L-天冬氨酸半醛等代谢物,后者是松柏醛和布瓦西坦等。FG8d-FG14d和FG17d-FG22d中也有超过70%的代谢物显著上调,包括氨基酸、肽及其类似物、脂类和碳水化合物及其结合物等,同时,显著下调化合物中黄酮类化合物居多;本研究还发现:FG6d-FG8d中碳水化合物及其结合物显著上调;FG14d-FG17d中脂类显著上调和黄酮类化合物显著下调;FG22d-FG29d和FG29d-FG36d中氨基酸、肽及其类似物和脂类显著下调。另外,FG8d-FG14d、FG17d-FG22d、FG29d-FG36d极显著差异代谢物(VIP>2;P<0.01;|log2(FC)|>0.3)分别是17种(落干酸和灵芝酸K等)、3种(茶条槭素B等)、7种(glyurallin B等),而FG6d-FG8d、FG14d-FG17d和FG22d-FG29d之间极显著差异代谢物(VIP>2;P<0.01;|log2(FC)|>0.1)分别是8种(甘草素、甘草苷和芹菜素-7-葡萄糖苷等)、4种(反式肉桂酸等)和14种(柠檬酸-A-环内酯等)。

差异代谢物中,Nε-乙酰-L-赖氨酸参与三羧酸(tricarboxylic acid,TCA)循环、脂肪酸合成和赖氨酸降解等多种途径,苯丙氨酸通过反式肉桂酸和松柏醛代谢为延胡索酸进入TCA循环,落干酸是单萜类生物合成途径进入吲哚生物碱生物合成途径的中间产物,溶血磷脂酰胆碱中的不饱和脂肪酸为白酒挥发性成分的形成提供大量的脂质源前体物;L-天冬氨酸半醛是天冬氨酸代谢为苏氨酸、蛋氨酸、赖氨酸和高级醇的重要中间产物[15-16],而苏氨酸和丝氨酸是酵母优先利用的氨基酸[17];L-谷氨酰胺是蛋白质合成中编码氨基酸和核苷酸生物合成的前体物质[18],这些差异代谢物是生成白酒风味化合物的重要前体物。另外,发酵过程中还有许多功能因子的产生,例如:芹菜素通过芹菜素-7-葡萄糖苷代谢为具有抗氧化活性的芹菜苷,柠檬酸-A-环内酯水解为柠檬苦素,布瓦西坦具有抗癫痫功效[19],灵芝酸K和茶条槭素B分别具有抑制宫颈癌和抗氧化的功效[20-21],glyurallin B[22]、反式肉桂酸[21]、甘草素和甘草苷[23]均具有抗氧化活性。

总体而言,根据差异代谢物种类变化趋势和风味化合物演替规律[12],可以将整个发酵过程划分为3个阶段。发酵前期(0～8 d)差异代谢物最多,共128种极显著差异代谢物(P<0.01),包括氨基酸、肽及其类似物、脂类、杂环类和碳水化合物及其结合物等;发酵中期(8～17 d)有22种极显著差异代谢物(P<0.01),其中氨基酸、肽及其类似物(8～14 d)代谢显著上调,而脂类和黄酮类化合物代谢交替上调;发酵后期(17～36 d)有33种极显著差异代谢物(P<0.01),氨基酸、肽及其类似物和脂类代谢先显著上调(17～22 d)后显著下调(22～36 d),推测可能是氨基酸的次级代谢产物在发酵后期增多。

2.3 老白干白酒不同发酵时间酒醅中代谢物代谢途径分析

代谢物差异变化与其所处的代谢途径相关。研究使用KEGG数据库对不同发酵时间段中差异代谢物进行代谢途径富集分析。FG0d-FG2d、FG2d-FG6d、FG6d-FG8d、FG8d-FG14d、FG14d-FG17d、FG17d-FG22d、FG22d-FG29d和FG29d-FG36d分别有86、84、50、72、38、72、59、64条代谢途径富集,各有21、11、16、8、9、17、8、14条显著富集(共计104条),见图5。图5的纵坐标表示代谢途径,横坐标表示该代谢途径重要性,重要性用Impact值表示。Impact值可用于衡量该代谢途径的代谢产物对细胞的整体影响程度,Impact值越大表示代谢产物对细胞的影响越显著。代谢途径的颜色表示代谢物参与代谢途径的概率,概率用Fisher 精确检验得到的P值表示,P值越小表示概率越大,即参与该代谢途径的概率越显著,P<0.05表示该途径具有显著性。条形图末端的数字表示富集到该代谢途径中的代谢物数目。

发酵前期(FG0d-FG2d、FG2d-FG6d和FG6d-FG8d)显著富集且Impact值高的代谢活跃途径均包括氨基酸代谢、碳水化合物代谢、脂类代谢。在整个发酵周期中,FG0d-FG2d涉及的代谢途径最多且Impact值最高,如淀粉和蔗糖代谢、半乳糖代谢、精氨酸生物合成和甘油磷脂代谢的Impact值分别为0.47、0.26、0.20和0.19。FG2d-FG6d中TCA循环、甘油磷脂代谢和β-丙氨酸代谢的Impact值均大于0.15,FG6d-FG8d中显著富集的代谢途径包括花生四烯酸代谢、丙酮酸代谢以及缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸生物合成。发酵中期(FG8d-FG14d和FG14d-FG17d)次级代谢(苯丙酸类生物合成和类黄酮生物合成等)和异生生物降解和代谢(氨基苯甲酸降解等)较为活跃。与发酵前期一样,发酵后期(FG17d-FG22d、FG22d-FG29d和FG29d-FG36d)甘油磷脂代谢依旧活跃;另外,甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢(FG17d-FG22d与FG29d-FG36d Impact值为0.24)以及色氨酸代谢(FG22D-FG29d Impact值为0.16)比其他时期更活跃。

有研究表明,乳杆菌属和酿酒酵母属会以葡萄糖和半乳糖等为底物生成乙醇、乙酸和乳酸等风味成分,对产酒率和酒体风味特征具有重要影响[24],本研究发现6-O-α-D-半乳糖基-D-葡萄糖醇、6-磷酸-乳糖、3-磷酸甘油醛和3-β-D-半乳糖基-sn-甘油等半乳糖代谢途径相关的物质在发酵前期变化显著。

添加精氨酸和谷氨酸可促进酒体酯类化合物的生成[25],精氨酸通过谷氨酸脱氢酶可裂解谷氨酸生成γ-氨基丁酸;另外,精氨酸在厌氧条件下先后转化为鸟氨酸、谷氨酸和脯氨酸[26],脯氨酸和谷氨酸之间可以通过中间体1-吡咯啉-5-羧酸实现互相转化[27],脯氨酸通过5-氨基戊酸进入赖氨酸降解途径,赖氨酸通过它进入谷氨酸代谢;脯氨酸还通过1-吡咯啉-3-羟基-5-羧酸和4-羟基谷氨酸半醛代谢为丙酮酸,进入丙酮酸代谢,同时,酵母可利用脯氨酸代谢为乙酸乙酯[28]。C5-支链二元酸等短中链脂肪酸的合成与丝氨酸和苏氨酸代谢相关[29]。2-氨基粘康酸半醛是色氨酸合成的基石[30],色氨酸通过Ehrlich路径转化为α-酮酸及其相应的高级醇和酸,这些挥发性物质是白酒的特征成分,它们通过“色氨酸-色胺-血清素”途径代谢为具有抗氧化活性的6-羟基褪黑素[31]。由此可见,老白干白酒中的许多风味化合物很有可能通过这些氨基酸代谢途径产生。

甘油磷脂中,甘油的第3个羟基被磷酸酯化,另外2个羟基被脂肪酸酯化,根据取代基的不同被划分为卵磷脂、脑磷脂(phosphatidylamide ethanolamine,PE)、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰甘油(phosphatidylglycerol,PG)、溶血磷脂酰胆碱和甘油磷酰胆碱等多类物质。它们不仅在细胞功能的调节中起着关键作用,而且是食品挥发性化合物形成的重要前体,因为磷脂中含有丰富的不饱和脂肪酸,相比于其他脂质更能促进食品的氧化降解[32],进而产生挥发性风味化合物。所以,甘油磷脂代谢在风味物质的形成中起着重要作用。黄酮和黄酮醇生物合成途径中,芹菜素通过转移酶代谢为木犀草素、山柰酚、槲皮素、甘草素、杨梅素和芦丁等健康因子。

总的来说,每个发酵时间段都有显著增强的代谢途径,这些代谢途径及其相关的代谢物促进了最终风味化合物的形成。首先,氨基酸代谢参与整个发酵周期,除了14～17 d,不同发酵时间段的氨基酸代谢差异显著,主要是精氨酸、脯氨酸、丝氨酸和色氨酸代谢,这与之前的研究结果相互印证[12],同样地,氨基酸代谢也是大曲中的主要生物功能[33]。其次是脂类代谢(0～8 d、17～36 d),包括甘油磷脂和鞘脂代谢等,而碳水化合物代谢(淀粉代谢和半乳糖代谢等)主要发生在发酵前期(0～8 d)。次级代谢和辅因子生物合成贯穿整个发酵周期,代谢为具有生物活性或者促进发酵进程的物质。因此,葡萄糖、氨基酸和磷脂类等小分子物质作为前体物,柠檬酸、异柠檬酸、α-酮戊二酸、苹果酸、琥珀酸、甘油酸和3-磷酸甘油醛等作为中间体,TCA循环将它们参与的糖酵解、丙酮酸代谢、氨基酸代谢和脂肪酸生物合成等途径联系起来,共同促进白酒风味化合物的形成。

2.4 老白干白酒酒醅中主要代谢途径分析

老白干白酒中主要特征风味物质包括酯类17种,醇类5种,醛类4种,酸类2种,酮类2种和其他3种[1],这些物质的形成主要涉及碳水化合物代谢、氨基酸代谢、脂类代谢和次级代谢。基于差异代谢物及其代谢途径分析,本研究绘制了老白干白酒发酵过程中差异代谢物涉及的可能与风味相关的代谢途径网络图,碳水化合物代谢、氨基酸代谢、脂类代谢、次级代谢依次为图6至图9。这些图中白色、红色、黑色字体分别表示样品中检测到的代谢物、在2个及以上发酵阶段具有显著差异的代谢物、可能存在于发酵过程的代谢物,实线和虚线分别表示直接和间接代谢途径。

2.4.1 碳水化合物代谢途径

碳水化合物通过微生物发酵代谢为小分子能量物质[34]。本研究发现,低聚糖棉子糖和水苏糖的相对表达量从2 d (7.18、6.49)显著降低到8 d (6.15、6.00),半乳糖和葡萄糖在0～2 d显著增加,2～8 d显著降低,同时伴随着3-磷酸甘油醛的显著增加,8 d后处于较高水平为发酵提供能量。

由图6可知,碳水化合物代谢显著存在于发酵前期,淀粉或糖原直接或间接生成单糖或二糖,经糖酵解途径生成丙酮酸,丙酮酸进入TCA循环或者丙酮酸代谢途径进而代谢为风味化合物及其前体物。例如:2,3-丁二酮、乙醇、乙酸、乙醛、乳酸、丙酸、丁酸、戊酸、己酸、辛酸、壬酸和琥珀酸等一系列长链脂肪酸[35-36]均可以通过丙酮酸代谢而成,其中,脂肪酸可以还原成相应的脂肪醇,醇类和酸类再通过酯化反应代谢为乙酸乙酯、乳酸乙酯、丁酸乙酯、丁二酸二乙酯、壬酸乙酯、戊酸乙酯、乙酸己酯、己酸乙酯、庚酸乙酯、十二酸乙酯、十四酸乙酯、十一酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯和乙酸戊酯等,它们是老白干白酒中的关键风味化合物。

2.4.2 氨基酸代谢途径

整个发酵过程中与氨基酸代谢途径相关且变化显著的代谢物最多,共涉及10种氨基酸代谢。由图7可知,前酪氨酸代谢为苯丙氨酸、酪氨酸代谢为N-羟基-L-酪氨酸的代谢途径在发酵前期(0～2 d)显著增加;同样地,色氨酸代谢为3-吲哚乙醇、谷氨酸代谢为瓜氨酸的相关物质也在这个时间段显著增加。脯氨酸和赖氨酸分别代谢为4-羟基-谷氨酸半醛和(S)-2,3,4,5-四氢吡啶-2-羧酸途径一直增加到14 d。此外,研究还发现丝氨酸代谢贯穿整个发酵周期,0～2 d 天冬氨酸代谢为3-甲硫基丙酸的途径中相关物质显著增加,6～36 d内3-甲硫基丙酸伴随着丝氨酸的减少逐渐减少,推测可能通过酯化反应生成了3-甲硫基丙酸乙酯。

氨基酸代谢通过Ehrlich途径产生挥发性风味化合物[37]。首先,氨基酸通过转氨作用转化为α-酮酸,然后脱羧为醛,最后转化为相应的醇[38]。例如,缬氨酸、异亮氨酸和亮氨酸分别代谢为异丁酸、2-甲基-1-丁酸和异戊酸,然后脱羧生成相应的醛,最后分别还原成异丁醇、2-甲基-1-丁醇和异戊醇[35],通过酯化反应可以生成乙酸异丁酯、乙酸异戊酯、异戊酸乙酯、异戊酸异戊酯和乳酸异戊酯。甲硫氨酸通过这个途径代谢为3-甲硫基丙醛和3-甲硫基丙醇[39],还可以通过合成S-腺苷-L-甲硫氨酸代谢为吡啶和愈创木酚等风味化合物。而苯丙氨酸通过这个途径代谢为苯乙酸、苯乙醇、肉桂酸和3-苯基丙酸;另外,苯乙酸脱羧代谢为甲苯后依次可以生成苯甲醇、苯甲醛和苯甲酸,以上化合物通过酯化反应会代谢为苯乙酸乙酯、苯甲酸乙酯、乙酸-2-苯乙酯、肉桂酸乙酯和3-苯基丙酸乙酯。精氨酸、脯氨酸、酪氨酸和丝氨酸先代谢为丙酮酸进而生成酸类、乙偶姻、3-甲基丁酸、对羟基苯乙醇和2,3-丁二醇等[40-41],其中,乙偶姻又是2,3,5,6-四甲基吡嗪的前体物[42]。赖氨酸发生去氨基反应后可以产生丁酸和乙酸[43],而L-苏氨酸在脱氢酶的作用下生成L-2-氨基-乙酰乙酸,进一步脱水缩合以及氧化形成2,5-二甲基吡嗪[29]。由此可见,氨基酸为醇类、醛类、酸类、酯类和吡嗪类等化合物代谢的重要前体物。

总的来说,氨基酸代谢显著存在于整个发酵周期,0～2 d多数氨基酸以及氨基酸代谢途径相关的物质显著增加,之后呈下降或者波动趋势,而酸性氨基酸天冬氨酸在整个发酵过程中呈增加趋势,精氨酸、脯氨酸和赖氨酸代谢产物在发酵中后期增加。

2.4.3 脂类代谢途径

脂类与碳水化合物、氨基酸代谢不同,脂类代谢相关的物质变化相对较小。由图8可知,0～6 d脑磷脂、卵磷脂分别显著代谢为磷脂酰甘油、α-亚麻酸和亚油酸,22 d时脑磷脂代谢为1-酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱和卵磷脂途径相关物质显著下降,其他发酵时间段变化较小。前人研究结果表明,添加脂质(甾醇和不饱和脂肪酸)增加了葡萄酒中酯类、高级醇和挥发性酸的浓度[44],甘油磷脂代谢是脂肪酸代谢的重要通路[45],其降解后可代谢为脂肪酸和甘油等,可以通过脂类调控这些风味化合物的代谢。

2.4.4 次级代谢途径

次级代谢主要是各种生物活性物质的代谢,包括甘草素、芹菜素、香豆素、槲皮素、山柰酚和杨梅素等。由图9可知,芹菜素代谢在0～2 d增加,甘草素代谢在6～14 d波动,香豆素代谢为绿原素和5-羟基阿魏酸途径,分别在0～14 d和整个发酵周期缓慢减少;槲皮素代谢过程中,儿茶素和芦丁在0～14 d显著下降。

阿魏酸脱羧后可以形成2-甲氧基-4-甲基苯酚、对乙基苯酚、4-乙基-2-甲氧基苯酚和4-乙烯基-2-甲氧基苯酚等酚类化合物[46]。通过苯丙氨酸代谢的生物活性成分槲皮素、甘草素、甘草苷和柚皮素是止痛作用的标志物[47],芹菜素对酒精引起的肝损伤具有保护作用[48],槲皮素、山柰酚和柚皮素是治疗冠心病的关键活性成分[49];另外,适量的功能活性成分(儿茶素、槲皮素、对香豆酸和没食子酸等)有利于酒体果香和花香的维持[50]。所以,可以通过生物活性成分的含量调控香气的强度,而这些黄酮类生物活性成分在老白干白酒中的功效及其对风味化合物代谢的影响有待进一步研究。

2.4.5 关键差异代谢物代谢途径

通过不同发酵时间点的差异代谢物、差异代谢途径及其相关的代谢物和代谢途径网络图汇总了11条关键代谢途径和18个关键差异代谢物,见图10。碳水化合物代谢在发酵前期活跃,主要是淀粉和蔗糖代谢以及半乳糖代谢,关键差异代谢物中,葡萄糖先增后减,而6-O-α-D-半乳糖基-D-葡萄糖醇、3-β-D-半乳糖基-sn-甘油和6-磷酸-乳糖逐渐增加;氨基酸代谢在发酵前期和后期较为显著,发酵前期,与丙氨酸、天冬氨酸及谷氨酸代谢,苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成和精氨酸和脯氨酸代谢相关的1-吡咯啉-5-羧酸、天冬氨酸半醛和苯丙氨酸变化显著,TCA循环中的苹果酸在前期减少;发酵后期,与甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢及半胱氨酸和蛋氨酸代谢相关的丝氨酸和谷氨酰胺减少;甘油磷脂代谢和α-亚麻酸代谢是较为关键的脂类代谢,PG和LysoPC在0～2 d先激增之后逐渐减少,PE和亚油酸波动较大;次级代谢在前中期活跃,主要是与芹菜素、槲皮素、甘草素和儿茶素代谢相关的芹菜素-7-葡萄糖苷、槲皮素-3-β-D-葡萄糖苷、杨梅素和表儿茶素逐渐减少。另外,研究结果表明,酒醅不仅是白酒关键风味化合物形成的基础,也是个功能库,众多功能因子有待开发和应用。

3 结 论

本研究采用UPLC-MS/MS技术,对老白干白酒发酵过程中的酒醅代谢物进行了鉴定,通过主成分分析和显著性差异分析,筛选出了差异代谢物,并通过KEGG数据库注释分析,揭示了这些差异代谢物可能参与的代谢途径。共检测到2 157种代谢物,其中172种为极显著差异代谢物(VIP>2,P<0.01,|log2(FC)|>0.1)。发酵前期(0～8 d)差异代谢物最多,共128种极显著差异代谢物(P<0.01),包括氨基酸、肽及其类似物,脂类,杂环类和碳水化合物及其结合物等;发酵中期(8～17 d)有22种极显著差异代谢物(P<0.01),其中氨基酸、肽及其类似物(8～14 d)代谢显著上调,而脂类和黄酮类化合物代谢交替上调;发酵后期(17～36 d)有33种极显著差异代谢物(P<0.01),氨基酸、肽及其类似物和脂类代谢物先显著上调后显著下调。差异代谢物显著富集了104条代谢途径,除14～17 d外,氨基酸代谢显著参与整个发酵周期;脂类代谢发生于发酵前期和后期,黄酮类代谢是发酵前中期,碳水化合物代谢发生于发酵前期。丝氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸半醛、葡萄糖、苹果酸和槲皮素等18种代谢物在多个发酵时间段差异显著或参与多个代谢途径,它们参与到8条关键的代谢途径,包括半乳糖代谢,甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢,精氨酸和脯氨酸代谢,苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成,甘油磷脂代谢及黄酮、异黄酮和黄酮醇生物合成等。本研究进一步解析和推测了代谢风味化合物的通路,可为解析老白干白酒发酵过程中的风味代谢机制提供理论依据。

附录:补充数据

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Appendix:supplementary data

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Metabolite Characteristics Analysis During Fermentation of Laobaigan Baijiu Based on Non-Targeted Metabonomics Technology

GENG Xiaojie1, CHEN Erbao1, MA Zhiying1, WANG Xinlei2, WANG Bowen1,*, ZHENG Fuping1,*, SUN Jinyuan1, ZHANG Yuhang2, LI Zexia2

(1.Key Laboratory of Brewing Molecular Engineering of China Light Industry/Beijing Laboratory of Food Quality and Safety/Key Laboratory of Alcoholic Quality and Safety of China Light Industry,Beijing Technology and Business University,Beijing 100048,China; 2.Hebei Hengshui Laobaigan Liquor Co. Ltd.,Hengshui 053000,China)

Abstract：Metabolites during Baijiu fermentation process are closely related to its unique style characteristics.Characteristics and succession of metabolites for Laobaigan Baijiu during its fermentation process have not been comprehensively analyzed.The metabolites of fermented grains during the fermentation process of Laobaigan Baijiu were identified by ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometer.The differential metabolites were screened by principal component analysis and significant difference analysis,and then the possible metabolic pathways of these differential metabolites were annotated by KEGG database.Results showed that 2 157 metabolites were detected in 9 samples of fermented grains with different fermentation time,of which 172 were extremely significant different metabolites (VIP>2,P<0.01,|log2(FC)|>0.1).In different stages of fermentation,the expression levels of various metabolites were different.In the early stage of fermentation (0-8 d),there were the most differential metabolites,with 128 extremely significant differential metabolites (P<0.01).The metabolism of amino acids,peptides and their analogs,lipids,heterocyclic compounds,carbohydrates,and carbohydrate conjugates was significantly up-regulated.In the middle stage (8-17 d),there were 22 metabolites with extremely significant differences (P<0.01).The metabolism of amino acids,peptides and their analogs was significantly up-regulated (8-14 d),and lipids metabolism was up-regulated first and then down-regulated,while flavonoids metabolism was down-regulated first and then up-regulated.In the later stage (17-36 d),there were 33 metabolites with extremely significant differences,and the metabolism of amino acids,peptides and their analogs,and lipids was up-regulated first and then down-regulated.In addition,104 metabolic pathways were annotated by KEGG database,and the metabolic network diagram was depicted accordingly.In different stages of fermentation,some metabolic pathways such as carbohydrate metabolism,lipid metabolism,flavonoid metabolism,and amino acid metabolism became more active mainly in the early stage of fermentation (P<0.05),flavonoid metabolism was more active in the middle stage of fermentation (P<0.05),lipid metabolism and amino acid metabolism were more vigorous in the late stage of fermentation (P<0.05).Eighteen metabolites,such as serine,glutamine,and aspartate semialdehyde,showed significant differences in several fermentation stages,and they annotated galactose metabolism,glycine,serine and threonine metabolism,arginine and proline metabolism,phenylalanine,tyrosine and tryptophan biosynthesis,and glycerophosphate metabolism,which may be the potential pathways to produce flavor compounds.Based on metabonomics technology,the characteristics and succession of metabolites during the fermentation process of Laobaigan Baijiu were revealed,which could provide a theoretical basis for analyzing the flavor metabolism mechanism during the fermentation process of Laobaigan Baijiu.

Keywords：Laobaigan; flavor compounds; fermented grains; metabolomics; metabolic pathway

中图分类号：TS262.3

文献标志码：A

doi：10.12301/spxb202400133

文章编号：2095-6002(2024)04-0045-16

引用格式：耿晓杰,陈尔豹,马志莹,等.基于非靶向代谢组学技术解析老白干白酒发酵过程中的代谢物特征[J].食品科学技术学报,2024,42(4):45-60.

GENG Xiaojie,CHEN Erbao,MA Zhiying,et al.Metabolite characteristics analysis during fermentation of Laobaigan Baijiu based on non-targeted metabonomics technology[J].Journal of Food Science and Technology,2024,42(4):45-60.

收稿日期：2024-03-04

基金项目：国家自然科学基金资助项目(32102119);河北省重点研发计划项目(20327107D);河北省科技计划项目(215A9935D)。

Foundation：National Natural Science Foundation of China (32102119); Key R&D Projects of Hebei Province (20327107D); Science and Technology Project of Hebei Province(215A9935D).

第一作者：耿晓杰,女,博士研究生,研究方向为白酒酿造微生物与风味化学。

*通信作者：王柏文,男,副教授,博士,主要从事白酒酿造微生物与风味化学方面的研究;郑福平,男,教授,博士,博士生导师,主要从事白酒化学方面的研究。

(责任编辑：李 宁)