丙酮酸又称2-氧代丙酸,是一种重要的有机酸,在生物体的代谢过程中发挥着重要作用;同时,丙酮酸也作为一种必不可少的前体物质,参与许多有机化合物的合成[1]。丙酮酸钙作为膳食补充剂,具有加速脂肪消耗、减轻体重等功效[2]。目前丙酮酸已广泛应用到食品、制药、农化等行业[3-4]。

丙酮酸的工业化生产主要是化学合成法,虽然其转化率高,但是污染重、效益低。微生物发酵法生产丙酮酸具有原料来源广泛、成本低、反应条件温和等优势,已经逐渐成为研究热点。目前生产丙酮酸的宿主有大肠杆菌、毕赤酵母、解脂耶氏酵母、光滑球拟酵母、谷氨酸棒杆菌、酿酒酵母等[5-10]。

谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum,C.glutamicum)是一种非致病的革兰氏阳性菌[11],被FDA认证为食用、药用安全菌株[12],可以用于色氨酸[13]、赖氨酸[14]、缬氨酸[15]、谷氨酸[16]等氨基酸的生产。谷氨酸棒杆菌作为有机酸生产菌相比其他菌株具有生产速度快,不产生内毒素,可以利用不同碳源为底物,对有毒化合物高耐受等优势[17];并且,在谷氨酸棒杆菌中,当促使丙酮酸转化为乙酰辅酶A的基因受到抑制时,谷氨酸棒杆菌可以葡萄糖为底物大量积累丙酮酸[18]。因此,本研究选取谷氨酸棒杆菌作为底盘细胞来进行丙酮酸的生产。

目前研究者提升丙酮酸的产量主要是通过敲除编码丙酮酸脱氢酶复合体基因(PDHc)[19-20]和敲除编码丙酮酸醌氧化还原酶基因pqo来实现[21],对流向其他副产物代谢通路的研究相对较少。本实验以野生型谷氨酸棒杆菌为出发菌株,拟通过敲除丙酮酸降解途径关键酶基因(丙酮酸醌氧化还原酶基因pqo、丙酮酸羧化酶基因pyc、转氨酶基因alaT、缬氨酸-丙酮酸氨基转移酶基因avtA、丙酮酸脱氢酶基因aceE)弱化丙酮酸的降解,并通过加强表达丙酮酸生物合成途径关键酶基因(转酮醇酶基因tkt、转醛酶基因tal、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶基因pck)增加合成丙酮酸前体物的供应,构建一株高效生产丙酮酸的菌株,以期为日后微生物发酵生产丙酮酸提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

菌株、质粒信息见表1,主要引物信息见表2。

蛋白胨、酵母粉、脑心浸出液(BHI),英国Oxoid公司;异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG),上海瑞永生物科技有限公司;LB液体培养基干粉,北京索莱宝科技有限公司;丙酮酸标准品,上海源叶生物科技有限公司;ClonExpress II One Step Cloning Kit试剂盒、Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase试剂盒,南京诺唯赞生物科技股份有限公司;质粒提取试剂盒、DNA 回收试剂盒、基因组提取试剂盒,生工生物工程(上海)股份有限公司;丙酮酸检测试剂盒,苏州科铭生物技术有限公司。其他试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

LDZM-80L型立式高压蒸汽灭菌锅,上海申安医疗器械厂;GY-2101型金属浴,美国Crystal公司;MDF-86V408型超低温冰箱,安徽中科都菱商用电器股份有限公司;YP10001型电子天平,上海精密仪器仪表有限公司;ZQPZ-115型振荡培养箱,天津莱玻特瑞仪器设备有限公司;Synergy H1型酶标仪,美国Bio Tek仪器有限公司;5424R型小型台式高速离心机,德国Eppendorf股份有限公司;Tone 96型PCR仪,德国Biometra公司;JY-ECP3000型核酸电泳仪,北京君意东方电泳设备有限公司;Essential V4型凝胶成像仪,英国UVItec公司。

1.3 实验方法

1.3.1 培养基的配置

蔗糖筛选培养基(g/L)：牛脑心浸出液37、硫酸铵10、硫酸镁0.5、磷酸二氢钾0.2、磷酸二氢钠0.3、蔗糖100、琼脂粉20,115 ℃高温灭菌20 min。

发酵培养基(g/L)：葡萄糖100、玉米浆20、硫酸铵20、磷酸二氢钾1、乙酸钠5、硫酸镁0.5、一水硫酸锰0.01、七水硫酸亚铁0.01、维生素B1 0.001、维生素B6 0.006、维生素B3 0.008、维生素B12 0.2、生物素2.5×10-5、碳酸钙10。其中,玉米浆、葡萄糖分别使用115 ℃高温灭菌20 min,盐类及维生素过滤除菌,使用前混合。

1.3.2 质粒的构建

1)敲除质粒的构建：质粒pK18mobsacB为自杀质粒,携带蔗糖致死基因sacB,可通过2次同源重组的方法将基因敲除。以野生型谷氨酸棒杆菌基因组为模板,分别扩增丙酮酸醌氧化还原酶基因pqo上下游同源臂片段,各约为500 bp,采用PCR扩增的方式,将pK18mobsacB质粒线性化,然后将上下游同源臂和线性化后的pK18mobsacB质粒进行连接[22],分别以U-pqo-F、D-pqo-R为上下游引物进行测序,测序正确即可获得敲除质粒pK18mobsacB△pqo。其余基因敲除质粒的构建方法相同。

2)表达质粒的构建：质粒pEC-XK99E为大肠-谷棒穿梭质粒,携带trc强启动子,可以用来高效表达内源基因。以野生型谷氨酸棒杆菌基因组为模板,分别以tkt-F、tkt-R为上下游引物扩增转酮醇酶基因tkt,以tal-F、tal-R为上下游引物扩增转醛酶基因tal,以pck-F、pck-R为上下游引物扩增磷酸烯醇丙酮酸羧激酶基因pck,将pEC-XK99E质粒线性化,目的基因与线性化的pEC-XK99E质粒进行连接[23],采用PCR扩增的方式进行验证获得组成型表达质粒pEC-XK99E-tkt-tal-pck。

1.3.3 敲除菌株的筛选

将构建好的敲除质粒pK18mobsacB△pqo,通过电转化的方法转入野生型谷氨酸棒杆菌感受态细胞中,培养2 h收集细胞涂布于含卡那霉素的LB平板培养基上,30 ℃培养36～48 h,在这个过程中发生第1次同源重组,经菌落PCR验证,筛选出正确的转化子接种于LB液体培养基中培养12 h,培养过程中细胞发生第2次同源重组,将培养液适当稀释涂布于含有蔗糖的固体筛选培养基中,进行第2轮筛选。随机挑取蔗糖平板上的转化子[24],分别以U-pqo-F、D-pqo-R为上下游引物进行PCR扩增,以野生型菌株为对照,通过凝胶电泳验证扩增产物的条带大小,条带正确的菌株即为QC01菌株。其余菌株筛选方法相同。

1.3.4 生长曲线测定

将测序正确的菌株QC01、QC02、QC03、QC04、QC05、pEC01、ATCC13032分别划线于BHI平板上,30 ℃培养48 h,挑取单菌落接种于LB液体培养基中作为种子,30 ℃、220 r/min过夜培养16 h,以种子液等OD值分别转接到LB培养基中,30 ℃、220 r/min摇瓶振荡培养36 h,每4 h测定1次OD值,记录菌株生长情况[25]。

1.3.5 发酵培养实验

取构建好的QC01、QC02、QC03、QC04、QC05、pEC01以及野生型菌株ATCC13032分别划线于BHI平板上,30 ℃培养48～72 h;挑取菌体接种于LB液体培养基中作为种子液,30 ℃、220 r/min培养18～20 h;按4%的接种量转接至含有10 g/L碳酸钙的25 mL发酵培养基中,30 ℃、220 r/min 发酵72 h,必要情况下添加IPTG、卡那霉素[26]。

1.3.6 丙酮酸含量测定

按照丙酮酸含量测定试剂盒说明书进行。

1.4 数据处理

所有实验重复测定3次,采用Excel 2010软件进行数据处理及表格绘制。

2 结果与分析

2.1 代谢支流关键基因敲除对丙酮酸合成的影响

2.1.1 敲除菌株的鉴定

菌株QC01、QC02、QC03、QC04、QC05基因敲除验证结果如图1。以ATCC13032为出发菌株,导入质粒pK18mobsacB△pqo,经过2次同源重组后,挑取单菌落以U-pqo-F、D-pqo-R为上下游引物进行菌落PCR验证,验证结果如图1(a)。已知用于敲除的上、下游同源臂各为500 bp,由图1(a)可以看出,出发菌株条带大小约为2 700 bp,QC01条带大小约为1 000 bp,表明敲除菌株QC01构建成功。

在QC01的基础上继续导入质粒pK18mobsacB△pyc,挑取单菌落以U-pyc-F、D-pyc-R为上下游引物进行菌落PCR验证,验证结果如图1(b)。QC01条带大小约为4 200 bp,QC02条带大小约为1 000 bp,表明敲除菌株QC02构建成功。

在QC02的基础上继续导入质粒pK18mobsacB△alaT,挑取单菌落以U-alaT-F、D-alaT-R为上下游引物进行菌落PCR验证,验证结果如图1(c)。QC02条带大小约为2 300 bp,QC03条带大小约为1 000 bp,表明敲除菌株QC03构建成功。

在QC03的基础上继续导入质粒pK18mobsacB△avtA,挑取单菌落以U-avtA-F、D-avtA-R为上下游引物进行菌落PCR验证,验证结果如图1(d)。QC03条带大小约为2 100 bp,QC04条带大小约为1 000 bp,表明敲除菌株QC04构建成功。

在QC04的基础上继续导入质粒pK18mobsacB△aceE,挑取单菌落以U-aceE-F、D-aceE-R为上下游引物进行菌落PCR验证,验证结果如图1(e)。QC04条带大小约为3 700 bp,QC05条带大小约为1 000 bp,表明敲除菌株QC05构建成功。

2.1.2 敲除代谢支流菌株发酵评价

本研究通过基因敲除手段来提高丙酮酸产量,野生型菌株及敲除菌株丙酮酸产量见图2。丙酮酸是糖酵解途径的最终产物,同时又连接着三羧酸循环(TCA),因为它很容易作为底物代谢成为其他产物,所以在细胞中难以积累,因此提高丙酮酸产量的有效方法之一是弱化产物降解[5]。在谷氨酸棒杆菌中,丙酮酸醌氧化还原酶(由pqo基因编码)催化丙酮酸合成乙酸[27-28],为了减少丙酮酸转化为乙酸的代谢流,拟敲除出发菌株ATCC13032中的pqo基因,得到QC01菌株,摇瓶发酵结果表明,丙酮酸的产量提升了136%,达到1.30 g/L。

丙酮酸羧化酶(由pyc基因编码)是谷氨酸棒杆菌回补途径的关键酶,催化丙酮酸生成草酰乙酸,从而进入TCA循环。因此,本研究在QC01的基础上进一步敲除pyc,得到QC02菌株,切断了丙酮酸合成草酰乙酸的途径,在一定程度上弱化了TCA循环的回补途径,从而增加丙酮酸的积累,QC02菌株的丙酮酸产量较QC01提升了15%,达到1.50 g/L。

在谷氨酸棒杆菌中L-丙氨酸有2种合成方式,一种是由alaT基因编码的转氨酶催化谷氨酸合成L-丙氨酸,另一种是由avtA基因编码的缬氨酸-丙酮酸氨基转移酶催化缬氨酸合成L-丙氨酸。Wieschalka等[18]发现敲除这2个基因可以减少谷氨酸棒杆菌中L-丙氨酸含量,增加丙酮酸产量。动力学研究显示,alaT编码的转氨酶是主要的L-丙氨酸合成酶[29],因此,在QC02菌株的基础上进一步敲除alaT基因,获得QC03菌株,但发酵后丙酮酸的产量无明显提升,仅提升4%,为1.56 g/L。罗玉常[30]研究同样表明,单独敲除alaT基因后,其目标产物产量并没有上升。通过进一步在QC03的基础上敲除缬氨酸-丙酮酸氨基转移酶avtA基因,发现QC04菌株丙酮酸产量提升了39%,达到了2.17 g/L。并且同时敲除这2个基因,并没有造成谷氨酸棒杆菌L-丙氨酸的营养缺陷,说明在谷氨酸棒杆菌中,还有其他潜在路径可以催化合成L-丙氨酸。

在有氧条件下,谷氨酸棒杆菌内大部分丙酮酸被丙酮酸脱氢酶复合体(PDHc)转化为乙酰辅酶A,因此,控制乙酰辅酶A的代谢通量对丙酮酸的积累具有重要意义[31]。PDHc是由3种不同酶组成的多酶复合体,包括aceE编码的丙酮酸脱氢酶(E1),aceF编码的二氢硫辛酰转乙酰基酶(E2)和lpdA编码的二氢硫辛酸脱氢酶 (E3),积累丙酮酸的方法之一就是删除这3种PDHc酶组分中的任何一种[5]。因此,本研究又在QC04的基础上敲除aceE基因,使QC05菌株发酵液中丙酮酸产量达到了14.64 g/L,是菌株QC04产量的6.7倍。

2.1.3 敲除代谢支流菌株生长状况分析

野生型菌株及敲除菌株生长曲线见图3。由图3可以看出,敲除pqo、pyc基因对谷氨酸棒杆菌的生长状态无明显影响,单独敲除alaT基因时,菌株的生长状态也无明显变化,但当同时敲除2个转氨酶基因alaT和avtA之后,菌株的生长明显受到影响,因此,下一步的工作重点可以放在不影响菌体生长的前提下,减少副产物L-丙氨酸的积累。在敲除aceE基因后,菌株的生长状态发生了大幅下降,这是因为中心代谢途径缺乏乙酰辅酶A而导致工作障碍,这时需要添加外源二级碳源,如乙酸盐等来保证菌体的正常生长[32]。因此,又在QC05菌株的种子液中添加了5 mg/mL的乙酸钠观察其生长曲线,发现菌株恢复正常的生长。QC05菌株添加乙酸钠后的丙酮酸产量见图4。由图4可以看出,QC05菌株丙酮酸产量与未添加外源碳源相比严重下降,只有10.12 g/L,推测原因可能是,谷氨酸棒杆菌具有将乙酸转化成乙酰辅酶A的能力,细胞恢复生长,代谢加快,从而促进丙酮酸转化为乳酸等副产物[26],导致产量降低。

2.2 合成途径关键基因过表达对丙酮酸合成的影响

增加前体物的供应,是提高产物产量的另一有效策略[33],过表达菌株丙酮酸产量见图5。本研究对3个谷氨酸棒杆菌内源基因进行过表达,分别是编码转酮醇酶的基因tkt、编码转醛酶的基因tal和编码磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的基因pck,以期提高参与合成丙酮酸的前体物质的含量。将质粒pEC-XK99E-tkt-tal-pck通过电转化导入构建好的菌株QC05中,即可得到菌株pEC01,经72 h摇瓶发酵,丙酮酸产量达到了15.39 g/L,与野生型菌株相比提高了28倍。其中,转酮醇酶tkt基因和转醛酶tal基因可以在糖酵解和磷酸戊糖途径之间建立可逆反应,这2个基因的过表达可以增加磷酸戊糖途径中3-磷酸甘油醛和6-磷酸果糖进入糖酵解途径的通量[34-35]。磷酸烯醇丙酮酸羧激酶pck基因可以催化草酰乙酸生成磷酸烯醇式丙酮酸,其在丙酮酸激酶的催化下生成丙酮酸,并将高能磷酸根转移到ADP上生成ATP[36-37]。

3 结 论

本研究以野生型谷氨酸棒杆菌为出发菌株,首先敲除编码丙酮酸醌氧化还原酶基因pqo,减少丙酮酸向乙酸的代谢流,丙酮酸产量由0.55 g/L提升至1.30 g/L;在此基础上又敲除编码丙酮酸羧化酶基因pyc,减少了丙酮酸向草酰乙酸的转化,产量进一步提升至1.50 g/L;继而又敲除编码转氨酶基因alaT、编码缬氨酸-丙酮酸氨基转移酶基因avtA,以减少丙酮酸向L-丙氨酸的转化,产量达到2.17 g/L;最后敲除编码丙酮酸脱氢酶基因aceE,摇瓶发酵72 h,丙酮酸的产量达到14.64 g/L。为了进一步增加丙酮酸通路代谢流,以质粒pEC-XK99E为载体,同时过表达编码转酮醇酶基因tkt、转醛酶基因tal、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶基因pck,发酵液中丙酮酸的产量最终达到15.39 g/L。

本研究使用的谷氨酸棒杆菌发酵生产丙酮酸与化学合成相比,产生的污染少,对环境更加友好,可为日后微生物发酵生产丙酮酸提供理论基础和参考。但是目前发酵培养基的成本较高,并且与大肠杆菌和解脂耶氏酵母相比,本研究丙酮酸产量还是相对较低,原因一是没有进行发酵罐水平的生产,二是流向丙酮酸的代谢支流没有完全敲除,且细胞代谢较慢。下一步研究可以针对以下几个方向：1)对乙酸钠、碳酸钙以及维生素等的添加量进行优化;2)敲除流向乳酸、缬氨酸、亮氨酸、苹果酸的代谢流;3)针对细胞内的辅因子进行动态调控;4)谷氨酸棒杆菌可以利用多种碳源,可以引入木糖以及阿拉伯糖代谢途径,选择利用麦秸秆水解液等廉价木质纤维素为原料进行丙酮酸生产。

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Modification of Corynebacterium glutamicum by Metabolic Engineering for Pyruvate Production

FANG Zhe,CAO Wenjun,LIU Juan,ZHANG Siqi,XIAO Zhiqiang,SHAN Yang*

(Longping Branch,College of Biology,Hunan University,Changsha 410082,China;Institute of Agricultural Product Processing,Hunan Academy of Agricultural Sciences/Hunan Province Key Lab of Fruits &Vegetables Storage,Processing,Quality and Safety/Hunan Province International Joint Lab on Fruits &Vegetables Processing,Quality and Safety,Changsha 410125,China)

Abstract：Pyruvate is an essential organic acid which plays an important role in the energy metabolism of living organisms.As a precursor,pyruvate can be involved in the biosynthesis of many organic compounds.Therefore,metabolic engineering was used to modify Corynebacterium glutamicum for pyruvate production.Five key genes (pyruvate quinone oxidoreductase gene pqo,pyruvate carboxykinase gene pyc,aminotransferase gene alaT,valine-pyruvate aminotransferase gene avtA,pyruvate dehydrogenase gene aceE),related to pyruvate metabolic tributaries in Corynebacterium glutamicum,were successfully knocked out by homologous recombination.The concentration of pyruvate reached 14.64 g/L after 72 h of fermentation in shaking flasks.Then,transketolase gene tkt,transaldolase gene tal,and phosphoenolpyruvate carboxykinase gene pck were overexpressed to increase the supply of precursors for pyruvate synthesis.After 72 h of fermentation in shake flasks,pyruvate production reached 15.39 g/L,which was 28 times higher than that of the wild-type strain.This study aimed to provide theoretical reference for application of pyruvic acid production by microbial fermentation.

Keywords：Corynebacterium glutamicum;pyruvate;metabolic engineering;homologous recombination;overexpression

中图分类号：TS201.3;TS255.1

文献标志码：A

doi：10.12301/spxb202200573

文章编号：2095-6002(2023)03-0139-09

引用格式：方哲,操文军,刘娟,等.利用代谢工程改造谷氨酸棒杆菌产丙酮酸研究[J].食品科学技术学报,2023,41(3)：139-147.

FANG Zhe,CAO Wenjun,LIU Juan,et al.Modification of Corynebacterium glutamicum by metabolic engineering for pyruvate production[J].Journal of Food Science and Technology,2023,41(3)：139-147.

收稿日期：2022-05-27

基金项目：湖南省农业科技创新项目(2021CX05)。

Foundation：Agricultural Science and Technology Innovation Project of Hunan Province (2021CX05).

第一作者：方 哲,女,硕士研究生,研究方向为食品生物化学。

*通信作者：单 杨,男,研究员,中国工程院院士,主要从事农产品加工及质量安全方面的研究。

(责任编辑：张逸群)