藜麦(Chenopodium quinoa),又称为藜谷,发源于南半球西部南美洲的安第斯山脉[1]。2020年,中国种植面积约2万公顷,产量约2.25万t[2],其中甘肃种植约1万公顷,主栽品种为陇藜1号。藜麦中的蛋白质量分数为13%～22%[3],其主要的贮藏蛋白为清蛋白及球蛋白[4]。植物清蛋白是一类分子质量为10～20 kDa、沉降系数为2的混合贮藏型蛋白质[5],含有10～12个亚基[6],含有大量的含硫氨基酸,可溶于稀盐、水、稀酸或稀碱溶液[7]。蛋白质要发挥营养价值,需经人体消化被胃肠道吸收后才能参与到新陈代谢中。因此,研究蛋白质经胃肠道消化后的变化,对提高蛋白质利用率有着重要的意义[8]。

经消化的蛋白质可产生具有多种生物活性的小肽,具有抗癌、抗炎症及抗自由基氧化等活性,并可对人体炎症、氧化应激引发的相关疾病起到抑制作用[9]。史瑞婕[10]将杏鲍菇蛋白经3种不同方法处理后,探讨蛋白质体外消化性质的变化发现,加热、超声波和酸法脱酰胺3种处理方法均可提高杏鲍菇蛋白质的消化率和消化产物的抗氧化性。姜丰等[11]将卵白蛋白经体外模拟胃肠道消化,产物的体外抗氧化活性增强并具有浓度依赖性,其组分分子质量越小,抗氧化活性越强。Cho[12]研究米糠分离蛋白在体外模拟胃肠道消化进程中溶解度及抗氧化活性等的变化表明,模拟胃肠消化产物的抗氧化性能均高于未处理蛋白。目前,有关陇藜1号藜麦清蛋白体外消化的研究尚未见报道。

本研究以甘肃省主栽品种,陇藜1号为材料,通过体外模拟清蛋白的胃肠消化,研究其消化过程中清蛋白活性物质、结构及抗氧化活性的变化,旨在为陇藜1号藜麦清蛋白的开发利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

陇藜1号藜麦,甘肃藜美农业科技有限公司;胰蛋白酶、胃蛋白酶,北京索莱宝科技有限公司;中性吡啶、溴化钾、十二烷基硫酸钠(SDS)、DPPH、ABTS,上海源叶生物科技有限公司;其他试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

LA-8080型全自动氨基酸分析仪,日本株式会社日立高新技术科学那珂事业所;TU-1810型紫外可见分光光度计,北京普析通用仪器有限责任公司;GT10-1型高速台式离心机,北京时代北利离心机有限公司;JSM-5610型扫描电子显微镜,日本电子株式会社;JZP116型喷金机,天津轻工业学院与天津玻璃器皿厂联合研制;NicoletiS50型傅里叶变换红外光谱仪,天津市拓普仪器有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 藜麦清蛋白的提取

藜麦粒经粉碎后过60目筛,石油醚(沸程30～60 ℃)回流脱脂8 h,风干后加去离子水,调pH值至7,控制料液比1∶25.5(g/mL)、超声功率354 W、时间40 min、浸提温度36.9 ℃,水浴磁力搅拌1 h,离心、收集上清液。考马斯亮蓝法测定清蛋白浓度,计算藜麦清蛋白提取量。

1.3.2 藜麦清蛋白纯化

参考林凤英[13]的方法,并稍做调整。清蛋白提取液经硫酸铵盐析30 min,pH值为7.0的PBS缓冲液复溶,分子截留量为3 500 Da透析袋4 ℃透析48 h(每隔1 h更换一次水),真空冷冻干燥。

1.3.3 藜麦清蛋白含量测定

蛋白质、水分含量均依据相应国标进行测定。蛋白质含量测定依据GB 5009.5—2016《食品安全国家标准 食品中蛋白质的测定》;水分含量测定依据GB 5009.3—2016《食品安全国家标准 食品中水分的测定》。

1.3.4 模拟体外消化实验

参考秦晓佩等[14]的方法并适当调整。

人工模拟胃液：称取0.2 g的NaCl、0.32 g的胃蛋白酶,加入3 mol/L浓盐酸0.7 mL,用去离子水溶解后移至100 mL容量瓶,调节pH值至1.2±0.1。

人工模拟肠液：称取0.7 g的KH2PO4,用25 mL去离子水完全溶解,依次加入0.2 mol/L的NaOH溶液及去离子水40 mL,再加入胰蛋白酶4.0 g(胰蛋白酶酶活力为2 500 U/g),溶解后转入100 mL容量瓶定容,调节pH值至7.5±0.1。

将冷冻干燥得到的藜麦清蛋白粉末分散于蒸馏水,制成质量浓度为40 mg/mL的蛋白液。将蛋白液与模拟胃液在37 ℃水浴保温15 min,取等体积的蛋白液及模拟胃液置于锥形瓶中,将锥形瓶放入37 ℃水浴摇床,控制反应时间分别为0.5、1.0、1.5、2.0 h。取不同反应时间点的消化产物加入到试管中,于95 ℃水浴灭酶5 min,迅速冰浴冷却备用。将锥形瓶中的溶液pH值调节至7.5,加入同等体积的模拟人工肠液,继续震荡水解,控制反应时间分别为2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0 h,取不同反应时间点的消化产物进行灭酶、冷却备用。

1.3.5 消化产物水解度的测定

参考何兴芬[15]的方法,采用邻苯二甲醛(OPA)法测定清蛋白的水解度。OPA试剂：将7.6 g的十水合四硼酸钠、200 mg的SDS溶于150 mL的去离子水中,配置成A液;160 mg的邻苯二甲醛(OPA)溶解于4 mL乙醇,转移到A液中,加入176 mg的二硫苏糖醇,用去离子水制成200 mL溶液即得到OPA试剂。

取400 μL清蛋白消化液加入装有3 mL OPA试剂的离心管中,混匀后于室温反应2 min,立即于340 nm波长处测定吸光值。以丝氨酸标准液(0.951 6 mmol/L)为参考,以去离子水为空白,按式(1)、式(2)计算水解度。

(1)

式(1)中,b为单位质量蛋白质含丝氨酸氨基的物质的量,mmol/g;A样品为待测样品的吸光值;A标准为丝氨酸标准液的吸光值;A空白为去离子水的吸光值;N为稀释倍数;V为上清液体积,L;m为样品质量,g;w是样品中蛋白质的质量分数,%。

水解度

(2)

式(2)中,b为单位质量原料蛋白的肽键物质的量,mmol/g;藜麦清蛋白的htot为7.03;β和α分别为常数0.4和1。

1.3.6 消化产物抗氧化活性测定

1.3.6.1 DPPH自由基清除能力测定

参考Tai等[16]的方法并作调整。取2 mL样品液,加入0.15 mmol/L的DPPH乙醇溶液(体积分数为95%)2 mL,混匀、避光反应0.5 h后5 000 r/min离心15 min,于517 nm波长处测定吸光值A1。清除率按式(3)计算。

DPPH自由基清除率

(3)

式(3)中,A2为对照组(体积分数为95%的乙醇溶液替代DPPH溶液)吸光度,A3为空白组(体积分数为95%的乙醇代替样品液)吸光度。

1.3.6.2 ABTS+自由基清除率测定

测定参考吴伟等[17]的方法并作修改。称取0.1 g的ABTS、0.029 g的过硫酸钾,溶解于100 mL磷酸盐缓冲溶液(PBS)中,室温避光下放置16 h。将储备液用PBS稀释至溶液于734 nm波长处吸光值为0.7±0.2,作为ABTS+自由基工作液。吸取0.5 mL藜麦清蛋白酶解液,加入2 mL的ABTS+工作液,涡旋震荡混匀15 s,25 ℃静置反应6 min,测定734 nm波长处吸光值。等体积无水乙醇替代样品溶液,测定的吸光值记为A0。ABTS+自由基清除率按照式(4)计算。

ABTS+自由基清除率

(4)

式(4)中,A0为等体积无水乙醇替代样品溶液的吸光值,A1为样品溶液的吸光值。

1.3.6.3 总还原力测定

总还原力的测定参考Chen等[18]的方法并作修改。在试管中加入1.5 mL的酶解液,并与1.5 mL的PBS缓冲液(0.2 mol/L、pH值为6.6)及1.5 mL的铁氰化钾溶液(质量分数为1%)混匀,在温度50 ℃条件下水浴20 min,与2.5 mL的三氯乙酸溶液(体积分数为10%)充分摇匀,室温静置8 min,于4 ℃、6 500 r/min条件下离心12 min。取2.5 mL的上清液与2.5 mL的去离子水混匀,加入0.5 mL的FeCl3溶液(质量分数为0.1%),混匀后在室温下反应10 min,8 000 r/min离心5 min,收集上清液并测定其在700 nm波长处的吸光度。还原力按式(5)计算。

还原力=A1-A0。

(5)

式(5)中,A1为样品吸光值,A0为空白组(PBS缓冲液代替样品液)吸光值。

1.3.6.4 Fe2+螯合能力测定

参考刘倩霞等[19]的方法。取2 mL的酶解液于离心管中,加入2 mmol/L的FeCl3溶液0.2 mL,室温静置5 min,然后加入5 mmol/L的菲啰嗪溶液0.4 mL,于4 000 r/min条件下离心5 min。收集上清液测562 nm波长处的吸光值。Fe2+螯合能力按式(6)计算。

Fe2+螯合率

(6)

式(6)中,As为样品吸光值;Ac为对照组吸光值(去离子水代替样品液)。

1.3.6.5 Cu2+螯合能力测定

参考刘倩霞等[19]的方法。2 mL的酶解液中依次加入2 mmol/L的CuSO4溶液2 mL,中性吡啶2 mL,质量分数为0.1%的邻苯二酚紫溶液40 μL,立即涡旋混匀,室温放置反应5 min,立即于632 nm波长处测定吸光值。Cu2+螯合能力按式(7)计算。

Cu2+螯合率

(7)

式(7)中,As为样品吸光值;Ab为对照组(去离子水代替样品溶液)吸光值。

1.3.7 消化产物游离氨基酸的测定

参考秦晓佩等[14]的方法,吸取不同时间点的取样备用的待测消化液0.4 mL于离心管中,加入质量分数为1%的磺基水杨酸溶液3.6 mL,静置沉淀90 min,温度4 ℃条件下8 000 r/min离心10 min,吸取管内上清液过孔隙为0.22 μm的水相滤膜,滤液装入棕色液相小瓶,采用氨基酸分析仪测定。

仪器条件：柱温箱程序升温,58 ℃ (0～37 min)、70 ℃ (37～44 min)、75 ℃(44～74 min)、58 ℃ (74～85 min);流动相流速为0.2 mL/min;检测波长采用440 nm和570 nm双波长同时检测;反应器温度为115 ℃;流动相为pH值为2.2～4.6的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液,洗脱时间为32 min,进样量为20 μL。

1.3.8 消化产物蛋白质二级结构的测定

参考张忠慧等[20]和刘媛等[21]的方法,采用红外光谱仪在500～4 000 cm-1的波数内对消化产物进行扫描,扫描次数为30次,间隔0.1 s进行扫描。

1.3.9 消化产物微观结构观察

参照Gong等[22]的方法并修改。将冻干的清蛋白消化物粉末均匀地粘在导电胶上,喷金机真空喷金处理后将其固定在载物台,进行观察。

1.4 数据处理

实验重复3次,采用SPSS 25.0及Excel进行分析,单因素方差分析差异显著性,采用Origin 2018软件作图,Peak Fitv 4.1.2进行红外光谱数据分析。

2 结果与分析

2.1 消化时间对水解度的影响

陇藜1号藜麦清蛋白模拟体外消化不同时间水解度变化见图1。由图1可知,在胃蛋白酶消化阶段(0.5～2.0 h),随消化时间延长,蛋白质的水解度逐渐升高,但幅度不大。在进入胰蛋白酶消化阶段,清蛋白水解度开始大幅度提升。在模拟肠消化的前30 min(2.0～2.5 h)内,水解度显著提升至35.52%,为模拟胃消化结束时的1.91倍。当模拟消化时间达到4.0 h时,水解度达到39.13%,说明蛋白质的消化程度逐渐增大。然而,当蛋白质消化时间达到5.5 h时,水解度变化差异不显著(P>0.05),说明蛋白质的消化速率减慢。其原因可能是由于消化进程的持续,消化底物不断减少,而消化产物不断增加,产生了竞争抑制,同时酶活性降低,进而使蛋白质的消化速率减慢。付媛[23]的研究表明,苦荞清蛋白经胰蛋白酶单一酶酶解3 h后,水解度为7.86%。本研究在模拟消化结束时的水解度可达到39.60%,水解度呈逐渐增长趋势,与江连洲等[24]的研究结果基本一致。

2.2 消化产物抗氧化活性变化

2.2.1 DPPH和ABTS+自由基清除率的变化

模拟消化过程中,藜麦清蛋白自由基清除率变化情况见图2。由图2可知,清蛋白体外消化产物对DPPH自由基清除率变化大体趋势与其水解度相似。对照组清蛋白的DPPH自由基清除率为23.58%,经模拟胃部消化2.0 h后,水解产物对DPPH自由基清除率达到32.39%,高于对照组8.81%。在消化2.0～2.5 h,即胰蛋白酶消化前0.5 h内,水解产物对DPPH自由基清除率显著提升(P<0.05),随后虽有上升,但幅度相对较小。在模拟体外消化4.5 h时,DPPH自由基清除率达到最高值58.43%,为清蛋白的2.48倍。

图2结果表明,对照组藜麦清蛋白ABTS+自由基清除率为10.89%。在胃蛋白酶消化期间,藜麦清蛋白消化产物对ABTS+自由基清除作用呈上升趋势,2.0 h时为62.60%,极显著高于对照组(P<0.05)。在模拟肠消化前期(2.5 h)时,产物对ABTS+自由基清除率为79.51%,之后其变化差异不显著(P>0.05)。

2.2.2 总还原力变化藜麦清蛋白在模拟体外消化过程中的总还原能力的变化情况见图3。由图3可知,0～3.5 h的消化产物总体呈上升趋势,之后其变化差异不显著(P>0.05)。胃蛋白酶消化期间总还原力达到了0.169,高于对照组6.90%;胰蛋白酶消化前期(2.0～2.5 h)还原力显著提升(P<0.05),但在2.5～3.0 h变化不显著,随时间延长(3.5 h)还原力值升至最大值,为0.280,之后差异不显著(P>0.05),为对照组还原能力的2.77倍。这可能是由于消化产物中甲硫氨酸、甘氨酸及脯氨酸等的释放量增加,更有利于多肽链中其他氨基酸残基在抗氧化方面发挥其作用的缘故[25]。

2.2.3 金属离子螯合能力变化

清蛋白模拟体外消化过程中金属离子螯合能力的变化见图4。由图4可知,对照组Fe2+螯合率为12.32%,在模拟胃消化、胰腺消化的前30 min内,均呈显著升高趋势(P<0.05),在消化0.5～2.0 h、3.0～5.0 h,Fe2+螯合率虽有所增加但增幅不显著(P>0.05);清蛋白在胃蛋白酶水解2.0 h后,Fe2+螯合率升至27.85%,为对照组的2.26倍,在胰蛋白酶水解结束时(5.0 h)达到66.84%,分别高出对照组、模拟小肠消化前期(2.5 h)的54.52%和41.42%。

模拟消化产物的Cu2+螯合能力变化与Fe2+不同,对照组的Cu2+螯合率为7.98%,经过胃蛋白酶消化0.5 h后,Cu2+螯合率显著升高至12.88%,高于对照组4.90%,之后清蛋白水解产物的Cu2+螯合率略有增加,但在3.0～5.0 h差异不显著(P>0.05)。消化结束时,消化产物Cu2+整合率为15.74%。通过对比2种金属离子螯合率,Cu2+螯合率远低于Fe2+螯合率,这可能是因为藜麦清蛋白经胃、胰酶水解后形成的肽链中Fe2+配位点要高于Cu2+配位点的原因[26]。

王正旋[27]研究大米蛋白经模拟胃消化120 min、小肠消化300 min后,产物的还原力、过氧化氢清除力以及金属离子(Fe2+和Cu2+)螯合能力等的变化,结果表明：大米主要贮藏蛋白谷蛋白(RPG)消化性强于大米醇溶蛋白 (RPP);经胃-胰两步水解,RPG在自由基及H2O2清除,Fe2+、Cu2+螯合方面均显著强于RPP。

2.3 消化产物游离氨基酸分析

陇藜1号藜麦清蛋白经模拟胃肠消化后水解产物中的游离氨基酸含量及变化见表1和图5。

由表1可知,在体外消化1～5 h,随着消化时间的延长,消化产物的疏水性氨基酸Val及Ala含量逐渐增加,分别从1.44、2.60 μg·mL-1升至2.04、3.67 μg·mL-1。图5可以看出,游离氨基酸含量呈上升趋势,与清蛋白水解度-时间曲线的大体趋势相似。在胃部消化结束(2.0 h)时的含量为8.76 μg·mL-1,经过胰蛋白酶水解后显著上升至5.46 μg·mL-1,其原因可能是酶解作用使得消化产物裂解出更多的游离氨基酸,Val、Ala等疏水性氨基酸的存在提高了肽与自由基的相互作用及抗氧化性[25]。蛋白质经体外模拟消化能够产生一定量的游离氨基酸、大量生物活性肽[28],对清除自由基具有良好的作用。

2.4 消化产物二级结构变化

消化产物及清蛋白红外光谱见图6。模拟消化产物酰胺I带(1 700～1 600 cm-1)经拟合,得到的不同时间点的消化产物二阶导数光谱,见图7。

由图7可知,藜麦清蛋白的FTIR在1 650 cm-1处有一个小峰,属蛋白质的一个特征峰[29],主要由CO的伸缩震动引起[26]。对各峰判定归属及指认后的百分含量见表2。各峰判定依据为：波数 1 650～1 658 cm-1属于α-螺旋结构,波数 1 610～1 640 cm-1属于β-折叠结构,波数 1 660～1 695 cm-1属于β-转角结构,波数在1 640～1 650 cm-1属于无规则卷曲结构。由表2可知,消化产物的各二级结构含量受消化阶段及消化时间的影响。在整个模拟消化进程中,β-转角含量较未消化清蛋白显著增加(P<0.05),α-螺旋及无规则卷曲含量随着消化时间的推移先降低后升高,而β-折叠含量的变化规律与之相反。α-螺旋含量在胰蛋白酶消化结束时达到34.57%,高于未消化清蛋白的12.06%。在模拟胃液消化过程中,消化产物无规则卷曲含量从24.69%降至15.34%。经过消化后,蛋白质结构发生变化。江连洲等[24]对不同品种大豆分离蛋白(SPI)消化产物的结构分析发现,陕豆125号的SPI二级结构中α-螺旋含量随消化时间推移总体上呈增加趋势。本研究在消化1.5～5.0 h的变化规律与江连洲等[24]的研究结果一致,而其他结构的变化存在一定差异,这可能是因大豆蛋白与藜麦蛋白的组成及分子结构不同所致。

2.5 消化产物显微结构变化

藜麦清蛋白及其模拟消化产物在扫描电镜放大1 000倍和4 000倍时的观察结果见图8。由图8可知,藜麦清蛋白呈现较大的片层结构,表面较粗糙。经过胃蛋白酶酶解2.0 h,清蛋白发生解离,蛋白颗粒明显变小,在放大4 000倍时观察到无序排列呈致密结构,孔隙较多。经两步酶解,模拟体外消化结束(5.0 h)时,产物变为絮状颗粒。由此可知,经过消化后,藜麦清蛋白表面微观结构发生了明显的变化。在模拟消化后,藜麦清蛋白结构由原来的片层结构变成絮状小颗粒,表面孔隙增加,使藜麦清蛋白在酶解过程中更易与酶接触进而发生相互作用,更加有利于酶进入藜麦蛋白内部结构,形成更多的小分子肽段及氨基酸等,进一步提高消化产物的水解度及抗氧化活性。这与毛小雨等[28]的研究结果一致。

3 结 论

经胃-胰蛋白酶两步水解后,藜麦清蛋白的水解度不断增加。在模拟消化结束(5.0 h)时达到了39.60%。清蛋白消化产物具有很强的还原力以及DPPH、ABTS+自由基的清除作用、对Fe2+的螯合能力较强,但对Cu2+的螯合能力较小。游离氨基酸在消化结束时达到了4.546×10-2 mg·mL-1,氨基酸含量越高活性越强,酶解物抗氧化活性越强。模拟消化产物中β-转角含量显著增加,α-螺旋及无规则卷曲含量随着消化时间的推移先降低后升高,但β-折叠含量的变化与之相反。扫描电镜结果显示,经胃蛋白酶酶解,清蛋白颗粒明显变小,无序排列呈致密结构,孔隙较多。模拟体外消化结束时,产物变成更小的絮状颗粒,表面积进一步增大。研究结果表明,藜麦清蛋白水解度高、消化产物游离氨基酸大幅增加、抗氧化性好。

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Antioxidant Activity and Structural Characteristics of Digestion Products of Longli 1 Quinoa Albumin in Vitro

JIAO Fei 1,2,YANG Qian3,YANG Chao4,GAO Juan 1,2,ZHANG Zhaoyun4,ZHANG Zhihua4,YANG Fumin4,*

(1.Jinchang Food Inspection and Testing Center,Jinchang 737100,China;2.Gansu Quinoa Product Quality Supervision and Inspection Center,Jinchang 737100,China;3.Gansu Institute of Business and Technology,Lanzhou 730020,China;4.College of Food Science and Engineering,Gansu Agricultural University,Lanzhou 730070,China)

Abstract：To study the antioxidant activity and its structural characteristics of albumin from Longli 1 quinoa seeds,quinoa albumin as raw material,the antioxidant activity and structural changes of quinoa albumin during in vitro simulated digestion were analyzed by Fourier transform infrared spectroscopy and scanning electron microscope.The results showed that the degree of hydrolysis of quinoa albumin and the release of free amino acids increased significantly with the digestion of pepsin and trypsin,reaching 39.60% and 45.46 mg/L respectively at the end of simulated digestion.After simulated gastrointestinal digestion,DPPH· and ABTS+· scavenging rate,total reducing power,Fe2+ chelation rate and Cu2+ chelation rate of albumin digestion products were 58.43%,79.51%,0.280,66.84% and 15.74%,respectively,which were 34.85%,68.62%,0.179,54.52% and 7.76% higher than those of undigested albumin.In the whole process of simulated digestion,the content of β-angle increased significantly,while the content of α-helix and random coil decreased first and then increased with the passage of digestion time.The content of β-fold increased first and then decreased.Scanning electron microscope observation showed that after pepsin hydrolysis,the digested particles become significantly smaller and disorderly arranged in a dense structure.The surface area and the pore size of digested particles increased.The research results were aimed to provide a basis for the further utilization of quinoa albumin of Longli 1 quinoa seeds.

Keywords：quinoa albumin;external digestion;degree of hydrolysis;antioxidant activity;structural change

中图分类号：TS201.4

文献标志码：A

doi：10.12301/spxb202200852

文章编号：2095-6002(2023)03-0116-11

引用格式：焦斐,杨倩,杨超,等.陇藜1号藜麦清蛋白体外消化产物抗氧化活性及结构特征分析[J].食品科学技术学报,2023,41(3)：116-126.

JIAO Fei,YANG Qian,YANG Chao,et al.Antioxidant activity and structural characteristics of digestion products of Longli 1 quinoa albumin in vitro[J].Journal of Food Science and Technology,2023,41(3)：116-126.

收稿日期：2022-09-06

基金项目：甘肃省市场监督管理局科技计划项目(SSCJG-SP-202101;SSCJG-SP-202113);甘肃农业大学科研项目(GSAU-ZL2015-048)。

Foundation：Science and Technology Project of Gansu Administration for Market Regulation(SSCJG-SP-202101;SSCJG-SP-202113);Science and Research Project of Gansu Agricultural University(GSAU-ZL2015-048).

第一作者：焦 斐,女,工程师,主要从事食品安全检测方面的研究。

*通信作者：杨富民,男,教授,主要从事食品加工方面的研究。

(责任编辑：郝一铭)