诺丽(Morinda citrifolia Linn.)又称为海滨木巴戟、海巴戟天、诺尼、水冬瓜,被子植物门(Angiospermae)木兰纲(Magnoliopsida)茜草目(Rubiales)茜草科(Rubiaceae)巴戟天属(Morinda)植物,是一种热带常绿多年生阔叶灌木或小乔木,常见于夏威夷、塔希提等南太平洋热带诸岛,以及我国海南岛、西沙群岛和台湾岛。诺丽果实和果汁中富含生物活性成分,如丝氨酸、车叶草苷酸、泛醌、多酚和黄酮等[1],一直被用作民间药物,具有较强的抑菌性、抗氧化和抗肿瘤能力[2] ,对高血压、糖尿病和消化不良等多种疾病具有辅助治疗作用[3-4] 。诺丽果被制成功能性食品在亚洲、欧洲和北美洲等地区的国家销售[5]。2002年经欧盟评估认为诺丽果汁是食用安全的食品[6],2010年我国卫生部(公告第9号)批准诺丽果浆作为新资源食品使用。

植物可以说是一种隐藏的微生物资源库,其内生活着各色内生菌。植物内生菌是一种在整个生命周期或部分时间都寄生在植物组织内部且并不会引起任何症状的微生物[8]。几乎所有的植物都有自己的内生菌群落,一般情况下植物与内生菌均会建立一种和谐共生的关系。内生细菌可以为其寄主植物产生少量且重要的生物活性化合物[9],在植物生长过程中提供促进和保护作用[10],从而保护自然界的生物多样性。随着科技进展,利用细菌或真菌来生产药品或功能性食品成了一种十分经济可靠的方法,而植物内生菌于植物内部产生的多种次级代谢产物为这一思路提供了更多可能性[11]。

对于内生菌与其产出的生物活性化合物目前已有很多报道,如从红豆杉分离出了能够产紫杉醇的内生菌[12],此外还有研究发现某些植物内生菌具有抑制病原菌生长或者杀死害虫的作用[13-14],也为寻求农作物生物农药的替代品提供了新的思路与来源。尽管内生菌已经被发现100多年,但直到近年来有关植物内生菌的研究才引起了研究人员的广泛关注,许多学者正努力试图破译植物与其内生菌之间的相互作用关系[14-15]。目前关于水稻、玉米和卷心菜等主要农作物品种中的内生菌研究已经展开[16-17],但大量特色或者小众植物的内生菌仍然有待进一步研究探索,这之中自然也包括诺丽[18]。

目前已有研究从诺丽果实中分离得到多种内生菌资源[19-20],并且已经有研究人员发现了诺丽果内生菌所能产生的抑菌物质并测定了活性,从而在微生物角度提出了新的抑菌化学物质来源[21]。除此之外,诺丽果较强的抗氧化性也使得其内生菌的抗氧化性和相关机制不断被研究[22]。这两种与诺丽果主要能力息息相关的功能,同样在内生菌的研究中作为关键活性被尤其关注。现有关于诺丽果内生菌的研究大多聚焦于分离并鉴定内生菌或是诺丽果相关功能的探讨,几乎没有对内生菌与诺丽果在关键生物活性上的协同作用的研究[2]。本研究以海南4种不同品种的诺丽果为实验材料,在探究诺丽果中内生细菌多样性的同时筛选对常见病原菌具有拮抗活性的诺丽果内生菌,并结合抗氧化活性测定挑选出功能优异的菌株进行分类鉴定。在此基础上探讨内生菌与植物的相互作用关系,希望可为今后研究内生菌和宿主功能的协调性和统一性提供帮助,为具有特定功能的诺丽果内生菌的筛选应用提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

4种诺丽果均由海南西沙诺丽生物科技有限公司于2021年7月采摘,后立即送至实验室进行分析处理。

所用试剂均为分析纯。无水乙醇、次氯酸钠,上海沪试实验室器材股份有限公司。LB培养基、TSA培养基、R2A培养基、GoldView核酸染料,北京索莱宝科技有限公司。Fast DNA®SPIN Kit for Soil,美国MP Biomedicals公司。凝胶回收试剂盒,美国赛默飞公司。NEBNext Ultra II RNA 文库制备试剂盒,美国Lumiprobe公司。Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with GC Buffer,北京诺为生物技术有限公司。DNA marker,北京博奥拓达科技有限公司。总抗氧化能力检测试剂盒(比色法),南京建成生物工程研究所。

1.2 仪器与设备

Qubit 3.0型荧光定量仪、SorvallTM LegendTM Micro 17R 微量离心机,美国赛默飞公司;Agilent 2100型生物分析仪,美国Agilent公司;NovaSeq6000型高通量测序仪,美国Illumina公司;FTC-3000P型定量PCR仪,加拿大Funglyn Biotech公司;YX-280D型压力蒸汽灭菌器,合肥华泰医疗设备有限公司;DYY-8C型电泳仪、WD-9413B凝胶成像仪,北京六一仪器厂。

1.3 实验方法

1.3.1 样品处理

根据品种不同,将4种诺丽果分别标号为L、R、C和T(L为长果,R为圆果,C为连体果,T为大溪地诺丽果),见图1。

使用无菌水彻底清理诺丽果表面,随后将其浸入70%的乙醇水溶液中,3 min后取出,再浸入质量分数为2.6%的次氯酸钠水溶液中,5 min后用体积分数为70%的乙醇水溶液清洗30 s。最后参考文献[23]的方法,用无菌水反复冲洗5次,使用无菌滤纸擦干水,放入密封袋中,并取最后一次清洗的无菌水少量涂布于PDA平板上,用于检测表面灭菌效果,观察对照平板无菌落生长,可以在实验中使用。

1.3.2 诺丽果内生细菌的高通量测序

使用Fast DNA®SPIN Kit for Soil从每个诺丽果(2 g)中提取总DNA。通过PCR扩增6份细菌DNA样本的V5～V7区,并使用集合指数序列对样本进行区分。用于扩增的引物为799F(5′-ACGTCATCCTTCC-3′)和1193R(5′-AACMGGATTAGATACCCKG-3′),并在引物799F的5′端添加8 bp的条形码作为样本识别。PCR过程中使用带GC缓冲液的高保真PCR母版,过程如下：首先,在95 ℃预变性5 min,然后循环26次,每个循环为94 ℃变性30 s,55 ℃退火35 s,72 ℃延伸30 s,最后72 ℃终延伸8 min。使用凝胶回收试剂盒纯化PCR产物,并使用Qubit 3.0进行精确的双链DNA浓度定量。将纯化的扩增子以等摩尔浓度汇集,并按照制造商的说明,通过NEBNext Ultra(NEB 7370 s/L)测定添加库特异性测序适配器。分别用Agilent 2100和qPCR检测文库长度分布和浓度。合格的库使用Illumina NovaSeq在PE250读取长度模式下进行测序,对测序完毕得到的数据进行质控。

1.3.3 诺丽果内生细菌分离与拮抗活性测定

将已经表面灭菌的诺丽果彻底捣碎,随后将5 g果肉和果汁混合物加入试管中,分别利用无菌水梯度稀释为1×10-1、1×10-2和1×10-3的悬液,取200 μL涂布在LB通用培养基、TSA高盐培养基、R2A贫瘠培养基上,32 ℃培养2 d,做单个菌落计数。参考文献[24]的方法,依据菌落形态在平板上随机选择具有差异性的菌株纯化后接种在LB培养基中,培养2 d后置于4 ℃环境下保存,由此得到实验中使用的诺丽果内生菌单菌株。

使用对峙平板法测定诺丽内生菌对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、黄曲霉菌(均为实验室保藏菌株)3种常见人体病原菌的拮抗活性。使用LB营养琼脂培养基分别加入适量已经摇床培养好的金黄色葡萄球菌和大肠杆菌菌液,摇匀稍做冷却后倒平板,待平板干透在其上粘好滤纸片,在滤纸片上点入少量经过摇床培养的内生菌菌液,倒置放入培养箱培养24 h后观察抑菌圈,并参考文献[25]的方法根据抑菌圈大小判断待测菌株抑菌价效。黄曲霉菌则使用PDA培养基,将真菌加入无菌水中放入玻璃珠将其打匀,接种平板24 h后点入适量内生细菌菌液于28 ℃培养,48 h后判断菌株抑菌价效,均选取能够产生抑菌圈的内生细菌进行后续实验。

1.3.4 诺丽果内生细菌抗氧化性的测定

参考文献[26]的方法测定诺丽果内生细菌抗氧化性。将2 μL能够产生抑菌圈的诺丽果内生菌加入1 mL LB肉汤培养基中,放入28 ℃摇床培养24 h。使用总抗氧化能力(total antioxidant capacity,T-AOC)检测试剂盒(比色法),按照说明书进行操作,利用分光光度计测定内生菌的总抗氧化性。

1.4 数据处理

参考文献[27]的方法处理获得的原始数据。使用NGS tookit软件处理获得的原始数据,以消除低质量reads(参数为默认值)。参考文献[28]的方法使用FLASH软件,对各样本正向和反向fastq文件进行拼接。根据每个样本的Barcode序列使用QIIME软件中的Split_libraries_fastq.Py脚本,来得到每个样本的分拆序列。参考文献[29]的方法使用MOTHUR软件得到Clean Tags,并修剪Barcodes和引物序列。根据数据库RDP 16S rDNA参考db128对序列进行过滤和去噪,以去除嵌合体序列,并参考文献[30]的方法通过贝叶斯方法进行分类,去除非16S rDNA序列(例如未知序列,以及古细菌、叶绿体、线粒体和蓝藻序列)。

参考文献[31]的方法进行序列聚类。使用VSEARCH软件以97%的序列相似性将处理后的序列聚类为OTUs。根据OTU丰度选择具有代表性的OTU序列。将OTU表细化为样本中的最小序列数,以直接比较每个植物群的Alpha和Beta多样性值。基于UniFrac距离矩阵的非度量多维尺度分析(non-metric multidimensional scaling,NMDS)(根据样本之间的距离估计相似性),使用MOTHUR语言中的 vegan包(v.2.2)来评估诺丽果的微生物群落组成的差异。

2 结果与分析

2.1 诺丽果内生细菌的多样性分析

研究分析采用MOTHUR软件自带的dgc算法,测序后过滤出非目标片段,获得了总计约591459条细菌16S rDNA片段序列(108 764～170 568)。为确定所选样品是否具有代表性,将从4种诺丽果中鉴定得到的内生菌的OUT数目进行稀疏曲线的绘制,见图2。由图2可知,4种诺丽果的稀疏曲线随着测序深度增加而逐渐趋向平坦,所选样品具有代表性。为评估诺丽果微生物群落的丰度和均匀度,进行Alpha多样性指数分析,包括OTU数量、ACE、Chao1、Shannon和Simpson指数值,结果见表1。Chao1、ACE指数与OTU数量主要描述样品的物种丰富程度,而Shannon指数和Simpson指数描述了物种多样性,Shannon指数越高,群落多样性越高。由表1可知,细菌的OTU数量、Chao1和ACE指数在诺丽果L中最为显著,其次是诺丽果T;细菌的Shannon指数值在诺丽果L中最高,在诺丽果R中最低。为研究样品共有和独有的OTU数量绘制Venn图,见图3。由图3可知,在97%序列相似性水平下,诺丽果C、L、R、T的细菌OTU数量为14、25、21、23。诺丽果L中的OTU数量最高,其次是诺丽果T,诺丽果C中的OTU数量最低,4种诺丽果的独特性从高到低分别是诺丽果L、T、R、C。

为了展示了4种诺丽果细菌在菌门水平的分布比较,绘制菌门水平百分比堆积柱状图和菌属水平百分比堆积柱状图,见图4。由图4(a)可知,4种诺丽果中属于变形菌门的细菌均十分丰富,特别是诺丽果R(96.3%),4种诺丽果中也存在着一定比例的厚壁菌门(Firmicutes)和放线菌门(Actinobacteriota)细菌,其中诺丽果T中所含厚壁菌门细菌比例相对较高(28.5%),诺丽果R中相对较低(2.6%),而放线菌门细菌占比总体较少且差别不大,平均在3.5%。此外,于另外3种诺丽果中均存在的拟杆菌门(Bacteroidota)在诺丽果R中不存在。由图4(b)可知,4种诺丽果细菌的主要构成在菌属水平上有着明显不同,在4种诺丽果中检出了内生细菌归属于35个属,诺丽果C中的优势属为短波单胞菌属(Brevundimonas)(21.0%)和泛菌属(Pantoea)(21.0%),诺丽果R为泛菌属(Pantoea)(37.0%),诺丽果L为短波单胞菌属(Brevundimonas)(18.4%)和副拟杆菌属(Parabacteroides)(16.7%),诺丽果T为假单胞菌属(Pseudomonas)(30.9%)和芽孢杆菌属(Bacillus)(28.5%),这些菌属在以往的诺丽微生物研究中也作为优势菌属出现[19,32-33]。为以呈现菌属水平绝对值方式揭示细菌群落和诺丽果之间的相关性,从而体现各菌属在不同诺丽果中的丰度差异绘制热图,见图5。综合分析可知,4个不同品种诺丽果中优势菌属为短波单胞菌属(Brevundimonas)、泛菌属(Pantoea)和芽孢杆菌属(Bacillus)。

为研究不同品种诺丽果微生物群落间的差异进行NMDS分析,结果见图6。由图6可知,诺丽果T与其他诺丽果点距离相对较远,可以看出其与其他诺丽果群落差异较大,而其他3种诺丽果的点距离也有差距,表明这些诺丽果的微生物群落整体差异较大。

2.2 诺丽果内生细菌的分离和拮抗活性分析

从C、L、R、T的4种诺丽果中共分离出114株内生细菌,其中诺丽果C中32株,诺丽果L中39株,诺丽果R中32株,诺丽果T中11株。使用3种不同致病菌(金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和黄曲霉菌)对这些内生细菌进行拮抗实验,结果见图7。图7表明共有28株内生细菌对金黄色葡萄球菌有显著的抑制作用,7株对大肠杆菌有抑制作用,6株对黄曲霉菌具有抑制作用。

为了对不同品种诺丽果的拮抗性内生菌拮抗效果进行比较,测量了抑菌圈直径,见表2至表4。由图7、表2至表4的结果进行综合分析可知,L和C诺丽果中分离出的对3种致病菌有拮抗作用的内生细菌数量比较多,诺丽果C对金黄色葡萄球菌拮抗内生细菌数量最多,但拮抗效果一般,诺丽果R和T中的拮抗内生细菌数量少,但拮抗效果都较为明显。比较抑菌圈平均大小可以明显发现,诺丽果内生细菌对金黄色葡萄球菌的拮抗活性远高于对大肠杆菌的拮抗活性,可能是由于芽孢杆菌分泌的次生代谢物对金黄色葡萄球菌的抑制作用更强[34]。而对黄曲霉菌有抑菌效果的内生菌出现在诺丽果C和诺丽果L中,且对大肠杆菌及黄曲霉菌有抑制作用的菌株均对金黄色葡萄球菌有抑制作用,这些菌株产生的抑菌次生代谢物是否为同一种物质还有待进一步研究。

本研究使用的3种致病菌被广泛报道出现在食品中,对人体普遍具有较大危害性[35-37]。目前生物技术已经在各种产品的生产、贮藏等环节中得到应用[38- 39],从诺丽果中得到的对一种甚至几种人体致病菌有良好抑制作用的内生菌,在食品、医药等行业具有很大的应用潜力。

2.3 具有抑菌活性的内生细菌抗氧化性

为评价诺丽果内生菌抑菌性与抗氧化性的相关性,将所筛选到的具有抑菌性的诺丽果内生细菌利用总抗氧化性(total antioxidant capacity,T-AOC)检测试剂盒测定其抗氧化性,结果见表5。结果表明：诺丽果R中拮抗性内生细菌总体具有较高的抗氧化能力,其次是诺丽果L;诺丽果C中分离出拮抗性内生细菌数量最多,但细菌抗氧化能力值普遍较低,该结果与拮抗活性测试结果相对应。具有抑菌性的诺丽果内生菌均具有一定的抗氧化性,同时具有更高抗氧化性的内生菌抑菌圈直径更大,这与 Nilasari等[21]对诺丽内生菌的相关研究一致,可以推测植物内生菌的抑菌性一部分是依靠其产生的具有抗氧化性的物质所实现的,证实了细菌抑菌性与其抗氧化性之间具有相关性,为日后研究内生菌相关代谢产物奠定了基础。

2.4 具有关键生物活性的内生细菌鉴定结果

为进一步确定诺丽果内生菌优良关键活性与细菌种属之间的关联,综合考虑内生菌来源、抑菌效果和抗氧化效果,从具有良好主要功能性的诺丽果内生细菌中挑选出8株做进一步鉴定。经16S rDNA鉴定,结合NCBI BLAST比对后,结果利用软件MEGA中邻接法(neighbor-joining method)所建立的系统发育树显示,这8株菌均属于芽孢杆菌属(Bacillus),见图8,这与高通量多样性分析中的结果是相一致的。对这些菌株进行进一步的gyrA基因鉴定,结果显示8株芽孢杆菌分别属于3个种,分别为枯草芽孢杆菌种(Bacillus subtilis)、短小芽孢杆菌种(Bacillus pumilus)和摩加夫芽孢杆菌种(Bacillus mojavensis),见图9。

目前对于芽孢杆菌功能性及其机理的相关研究已较为丰富,大量研究报道了这3种细菌均在食品、医药、生物防治等领域具有广泛的应用前景[40-42]。很多报道指出细菌的功能与其分泌的次生代谢物有关,例如罗晓娇等[43]发现了解淀粉芽孢杆菌的抑菌性质的同时分离出其产生的具有抑菌活性的脂肽类代谢产物;Wu等[44]从芝麻香型白酒大曲中分离出了11株能抑制大肠杆菌和金黄色葡萄球菌生长的芽孢杆菌,可以推测诺丽果的抑菌能力很大一部分来自其内生菌以及其产生的抑菌活性物质。并且目前多项研究发现了多种芽孢杆菌对非酒精性脂肪肝具有治疗效果[45-46],结合此前梁寒峭等[47]的诺丽果汁对于肝损伤具有治疗效果和诺丽果汁可以降低血液胆固醇水平的报道,可以推测诺丽果汁在肝损伤治疗和降血脂等方面的功效与其内生菌有关。其他诺丽果与其对应生长时期内生菌之间功能性关联的研究[48],也得出类似的结论,宿主与内生菌的功能具有关联性,这样的结论也与植物-微生物互作学说相吻合[49]。

诺丽作为一种药食同源的植物,其内提取出的功能性化学物质不断被研究报道,安全性也逐渐得到了证实[50-51],而这些有益化学物质来源于诺丽果实中的内生菌的可能性也在不断地研究中浮出水面[21,48]。探究诺丽果中内生菌多样性,并分离出主要功能性良好的多株内生菌,能够为今后植源性益生菌的相关研究及其代谢产物的利用提供更多实验依据。另外,据报道诺丽果实中的抗菌和抗氧化物质为酚类、东莨菪亭和环烯醚萜类等[52-53]。然而,还需要进一步的研究来确定细菌产生的功能性物质是否与果实中存在的抗氧化、抗菌功能化合物相同,在今后的研究中笔者会进一步明确关键生物活性物质与内生微生物的关系,深入研究物质产生背后的代谢机制,这对于植物-微生物互作研究以及微生物在工业生产方面应用至关重要。

3 结 论

本研究通过高通量测序技术(HTS)比较了4种诺丽果(长果标号为L、圆果标号为R、连体果标号为C、大溪地诺丽果标号为T)中内生细菌多样性的区别,并通过抑菌性实验和抗氧化性的测定探讨了不同品种诺丽果内生细菌的关键生物活性与其多样性之间的关系。通过对比OTU数量发现4种诺丽果中内生细菌多样性从高到低分别是L、T、R、C,且虽然4种诺丽果中内生细菌群落存在显著差异,但其共同的优势菌属为短波单胞菌属(Brevundimonas)、泛菌属(Pantoea)和芽孢杆菌属(Bacillus)。此外,通过对峙平板实验发现在分离出的内生细菌中共有28株对金黄色葡萄球菌有显著的抑制作用,7株对大肠杆菌有抑制作用,6株对黄曲霉菌具有抑制作用。进一步对具有抑菌活性的内生细菌进行总抗氧化性测定,发现具有抑菌性的诺丽果内生细菌均具有一定的抗氧化性,同时具有更高抗氧化性的内生细菌抑菌圈直径更大。从各品种的内生细菌中各挑选出两种关键活性较高的菌株进行鉴定,发现8株内生细菌均属芽孢杆菌属(Bacillus),分别属于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、摩加夫芽孢杆菌(Bacillus mojavensis)和短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus),结合芽孢杆菌相关研究及此前研究可以发现诺丽果与其内生菌的功能具有关联性,证实了植物-微生物相互作用学说,为今后研究内生菌和宿主功能的协调性和统一性奠定了基础,同时为具有特定功能的诺丽果内生菌的筛选应用奠定了理论基础。

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Diversity and Key Biological Activities of Endophytic Bacteria in 4 Varieties of Hainan Noni Fruit

SUN Biqi1,SHI Hanbo1,TIAN Liang2,WANG Wei3,LIU Yang1,*

(1.School of Chemistry and Bioengineering,University of Science and Technology Beijing,Beijing 100083,China;2.Hainan Xisha Noni Biological Technology Co Ltd,Sanya 572024,China;3.Research Center for Wild Animal and Plant Resource Protection and Utilization,Qiongtai Normal University,Haikou 571127,China)

Abstract：Noni fruit is rich in bioactive components with strong antagonistic and antioxidant activities.This study was carried out to explore the difference of endophytic bacterial diversity in Hainan noni fruit and the connection between their key activities and diversity.The common dominant bacterial genera from 4 varieties of noni fruit (long fruit labeled L,round fruit labeled R,conjoined fruit labeled C,and Tahitian fruit labeled T) was identified by high-throughput sequencing technology as Brevundimonas,Pantoea and Bacillus.The antagonistic activity of endophytic bacteria was tested,then the total antioxidant activity of the endophytic bacteria with antagonistic activity was further determined.It was found that there was antioxidant activities among all the endophytic bacteria with antibacterial activity,and the antioxidant values were found to be in the range of 3.07-20.78 U·mL-1,and the antioxidant activities of the endophytic bacteria were positively correlated with antagonistic activities.Eight endophytic strains from 4 varieties of noni fruit with strong activities were selected for 16S rDNA and gyrA molecular identification.The endophytic bacteria were identified as Bacillus and belonged to Bacillus subtilis,Bacillus mojavensis and Bacillus pumilus,respectively.The results of this study compared the diversity differences of endophytic bacteria communities in different varieties of noni fruit from the perspective of microbiology,and explored the correlation between the function of endophytic bacteria and endophytic community,confirming the theory of plant-microbial interactions.It was hoped that this study could provide help for the future research on the coordination and unity of endophytic bacteria and their host functions,provide a theoretical basis for the screening and application of endophytic bacteria with specific functions in noni fruit,and provide more ideas for the application of endophytic bacteria in the food industry and the research on the interaction between plants and microorganisms.

Keywords：noni;endophytic bacteria;antagonistic activity;antioxidant activity;antibacterial activity

中图分类号：TS255.1

文献标志码：A

doi：10.12301/spxb202200785

文章编号：2095-6002(2023)03-0085-13

引用格式：孙碧琪,史涵博,田亮,等.4种海南诺丽果内生细菌多样性及其关键生物活性研究[J].食品科学技术学报,2023,41(3)：85-97.

SUN Biqi,SHI Hanbo,TIAN Liang,et al.Diversity and key biological activities of endophytic bacteria in 4 varieties of Hainan noni fruit[J].Journal of Food Science and Technology,2023,41(3)：85-97.

收稿日期：2022-08-09

基金项目：国家外国专家项目(QN2021105002L);中央高校基本科研业务费资助项目(FRF-TP-20-044A2)。

Foundation：National Foreign Expert Program of China (QN2021105002L);Fundamental Research Funds for the Central Universities (FRF-TP-20-044A2).

第一作者：孙碧琪,女,硕士研究生,研究方向为植物内生菌。

*通信作者：刘 洋,男,副教授,博士,主要从事植物与微生物相互作用方面的研究。

(责任编辑：李 宁)