非酒精性脂肪肝(non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)是最普遍的慢性肝病之一。随着高脂饮食(high fot diet,HFD)在生活中的普及,肥胖率在全球范围内逐年递增,NAFLD的发病率也快速增加,已经影响了全球约25%的人口[1]。NAFLD作为一种引起肝脏脂肪堆积的慢性肝病,伴随着胰岛素抵抗[2]、2型糖尿病[3]、心脏病[4]等并发症,会进一步发展为肝硬化和肝纤维化[5-6]。尽管NAFLD发病比例很高,但目前尚未有针对性的上市药物来治疗NAFLD。虽抗糖尿病药物[7]、抗脂质药物[8]和天然胆汁酸[9]被用于NAFLD的治疗,但存在缺陷[10-11],其中用于治疗Ⅱ型糖尿病的盐酸二甲双胍因其具有抑制肝脏脂肪堆积和改善肝脏炎症的双重作用被推荐用于改善NAFLD[12]。通过药物治疗,减肥手术[13]和生活方式干预[14]是目前用于治疗 NAFLD 的措施,但会引发手术风险和生活方式改变。近年来的研究表明,海洋来源的天然化合物可用于治疗NAFLD,如贻贝多糖[15]、虾青素[16]、壳寡糖[17]、壳聚糖[18]等。海洋生物活性肽作为独特的生物活性化合物,是当前海洋食品功能因子研究的重点,发挥着多种生物学作用,如抗氧化、抗炎、降脂、护肝等生物活性,是丞待开发的天然产物,引起了广大学者的关注[19]。海洋生物活性肽对NAFLD的改善作用也有报导[20-21]。因此,海洋生物活性肽可能成为辅助治疗NAFLD的新研究方向与新研究领域。

笔者课题组前期研究表明,鮟鱇鱼皮是鮟鱇鱼加工过程中的副产物,其粗蛋白质含量高(占干鱼皮的78.85%),脂质组成合理,二十二碳六烯酸(DHA)和二十碳五烯酸(EPA)总量占脂肪酸的22.93%,符合人们的营养需求,值得进行开发利用[22]。应用胃蛋白酶提取的鮟鱇鱼皮胶原蛋白具有较好的抗氧化活性[23],以其为原料提取的鮟鱇鱼皮酶溶胶原蛋白肽(PSCP)对HFD诱导的肾损伤具有调节作用[24]。而有关PSCP对HFD诱导的小鼠NAFLD是否具有调节作用,目前尚未见报道。本研究拟通过HFD诱导小鼠构建NAFLD模型,以盐酸二甲双胍为阳性对照药,从体内途径探讨PSCP对小鼠NAFLD的修复作用及相关机制。本研究旨在为海洋生物活性肽在慢性肝病功能食品中的应用及提高鮟鱇鱼皮的生物附加值提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

无特定病原体级C57BL/6小鼠(体质量16～18 g),上海吉辉实验动物饲养有限公司[动物生产许可证号：SCXK(沪)2017-0012],饲养于浙江海洋大学动物房。全价鼠粮,浙江省实验动物中心;D12492鼠粮,苏州双狮实验动物饲料科技有限公司。2种饲料配方表见表1。

新鲜鮟鱇鱼皮,中国水产舟山海洋渔业有限公司;盐酸二甲双胍,天津中新药业集团股份有限公司;低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽(GSH)、丙二醛(MDA)、过氧化氢酶(CAT)试剂盒,苏木素-伊红(hematoxylin-eosin,HE)染液,江苏南京建成生物工程研究所;HRP-羊抗兔IgG(二抗)、抗磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)抗体,武汉博士德生物工程有限公司;核转录因子κB(NF-κB)亚基p50和p65、κB抑制因子激酶(IKKα)、NF-κB抑制蛋白α(IκBα)抗体、RIPA裂解液、5×上样缓冲液,上海碧云天生物技术有限公司;腺苷5′-单磷酸活化蛋白激酶α(AMPKα)、磷酸化腺苷5′-单磷酸活化蛋白激酶α(p-AMPKα)、胆固醇调节元件结合蛋白1(SREBP-1)抗体,Affinity Biosciences;TBST缓冲液,北京索莱宝科技有限公司;spurr包埋剂,美国Electron Microscopy Sciences公司。

1.2 仪器与设备

BSA124S型电子天平,德国SartoriusAG公司;CF16RXI型日立低温离心机、Hitachi H-7650型透射电镜、HITACHI L-8900型氨基酸分析仪,日本Hitachi公司;SpectraMax M2型多功能酶标仪,美国Molecular Devices公司;RM2135型切片机、HI1210型摊片机、H1220型烤片机,德国Leica Microsystems Nussloch公司;CX31型光学显微镜、CCD-NC6051型显微摄像仪,日本Olympus公司;mini sub cell型电泳系统,美国Bio-Rad公司;1260 Infinity II型高效液相色谱,美国Agilent Technologies公司;Fluor Chem FC3型Alphaview化学发光成像分析系统,美国ProteinSimple公司。

1.3 实验方法

1.3.1 PSCP的制备和组成分析

PSCP依据Miao等[24]的方法制备,将鮟鱇鱼皮胶原蛋白与酸性蛋白酶在50 ℃、pH 3.0环境下反应5 h,制备得到具有高抗氧化活性的PSCP。采用高效液相色谱法,色谱柱为TSK凝胶G2000SWXL分析柱,流动相为乙腈、水和三氟乙酸(体积比40∶60∶0.05),流速为0.5 mL/min,紫外检测波长为220 nm,甘三肽(189.17 Da)、RV-15(十五肽RVAPEEHPVEGRYLV,1 750.81 Da)、抑肽酶(6 511.51 Da)和细胞色素C(12 384 Da)为标准样品,绘制分子质量标准曲线,计算样品的分子质量分布。将PSCP置于充氮的加压螺旋玻璃管中,加入6 mol·L-1的HCl(含体积分数为2%的苯酚),在110 ℃下水解24 h,经定容、干燥、柠檬酸钠缓冲液(pH值为2.2)溶解。采用氨基酸分析仪,通过峰面积计算样品中的氨基酸浓度。

1.3.2 实验动物饲养与处理

将C57BL/6雄性小鼠置于(22±2) ℃、55%±5%湿度、光/暗(12 h/12 h)循环的条件下,适应性饲养1周,随机分为两组：正常组(8只)和模型组(40只)。正常组使用常规全价饲料喂养,模型组使用HFD喂养4周,以建立NAFLD模型。然后将造模小鼠随机分为5组(每组8只),即模型组(常规饲料喂养)、阳性药物组(每日按体质量灌胃0.65 mg/kg盐酸二甲双胍)、PSCP低、中和高剂量组(每日按体质量灌胃50、100、200 mg·kg-1的PSCP),继续喂养6周。小鼠可以自由饮食,每天灌胃前记录小鼠摄食量。每周定时记录体质量至实验结束。

1.3.3 小鼠肝脏指数测定及显微结构观察

饲养结束后,小鼠禁食不禁水24 h,经摘眼球取血后脱颈处死小鼠。快速取出肝脏称重,观察肝脏的大体形态,经生理盐水清洗吸干后称重,并按式(1)计算脏器指数。

脏器指数=m肝脏/m小鼠×100%。

(1)

式(1)中,m肝脏为小鼠肝脏质量,g;m小鼠为小鼠体质量,g。

肝脏经质量分数为4%的多聚甲醛固定24 h,经梯度脱水、二甲苯透明、透蜡后石蜡包埋成块,切成4 μm厚的组织切片,常规HE染色、中性树胶封片、显微镜进行观察并拍照。透射电镜观察肝脏超微结构委托浙江大学电镜中心进行,具体步骤：取0.5 cm2的肝脏立即置于体积分数为2.5%戊二醛中固定,PBS液漂洗,经质量分数为1%的锇酸固定 1～2 h后用PBS漂洗,经脱水、渗透后用Spurr包埋,切成厚度的70～90 nm的组织切片,最后用柠檬酸铅溶液和醋酸双氧铀乙醇饱和溶液各染色5～10 min,在电镜下观察并拍照。

1.3.4 小鼠血清和肝脏组织中生化指标检测

小鼠血浆静置2 h,4 ℃环境下3 500 r/min离心10 min,取上清,按照试剂盒说明书进行TC、TG、ALT、AST、HDL-C和LDL-C含量的测定。取小鼠肝脏组织用研钵研磨,生理盐水稀释,配置成质量分数为1%的肝组织匀浆液,按照试剂盒说明书进行GSH、CAT、MDA和SOD含量的测定。

1.3.5 小鼠肝脏蛋白表达水平检测

取小鼠肝脏组织,液氮研磨获得肝脏组织粉末,加入300 μL裂解缓冲液、涡旋充分混匀、裂解30 min,收集上清液,用BCA试剂盒测定裂解液蛋白浓度。取相同浓度的肝组织蛋白提取液,与5×上样缓冲液混合,将混合物在100 ℃煮沸5 min,于-80 ℃冰箱存放备用。配制分离胶(丙烯酰胺体积分数为10%)、浓缩胶(丙烯酰胺体积分数为5%),各组样品上样后进行SDS-PAGE电泳。将蛋白条带转移到PVDF膜上,TBST溶液清洗,用质量分数为5%牛血清白蛋白封闭1 h,一抗4 ℃孵育过夜,TBST溶液清洗,二抗孵育1 h。采用Alphaview化学发光成像分析系统显影并分析蛋白表达情况。GAPDH被用作参考蛋白。

1.4 数据处理

每个实验重复3次,并进行统计分析。使用GraphPad Prism 8.3.0和Origin 2019b Bit对不同组间的结果进行方差分析及绘图,P<0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 PSCP的分子质量和氨基酸组成分析

高效液相色谱检测PSCP中活性肽的分子质量分布结果见图1。由图1可知,PSCP的相对分子质量大于10 kDa的活性肽的质量分数仅为0.259%,分子质量5～10 kDa的活性肽的质量分数为2.609%,分子质量3～5 kDa的活性肽的质量分数为6.663%,分子质量1～3 kDa的活性肽的质量分数为30.481%,分子质量小于1 kDa的活性肽的质量分数为59.988%。PSCP中以分子质量小于3 kDa的活性肽占比高,而小分子质量的胶原蛋白肽更易被吸收利用,具有进一步研究的价值。

PSCP中氨基酸组成见表2。由表2可知,PSCP富含甘氨酸(Gly,148.53 mg/g),丙氨酸(Ala,78.17 mg/g),脯氨酸(Pro,72.54 mg/g)和谷氨酸(Glu,69.93 mg/g)。其中,必需氨基酸(Thr、Val、Met、Ile、Leu、Phe、His、Lys)占总氨基酸质量的20.543%,非必需氨基酸(Asp、Ser、Glu、Gly、Ala、Tyr、Arg、Pro)占总氨基酸质量的79.457%。

2.2 PSCP对小鼠体质量和肝脏指数的影响

各组小鼠体质量的变化和肝脏指数见图2。由图2可知,在前4周与正常组相比,造模组体质量增幅较大。改为正常饲料后,模型组和正常组的体质量继续升高,而阳性药物组和PSCP组的体质量开始下降。但小鼠的摄食量没有显著的变化,可能是因为PSCP和阳性药物降低了小鼠的食物利用率导致小鼠体质量的变化。实验结果显示：与正常组相比,模型组小鼠的肝脏指数升高(P<0.05),阳性药物组和PSCP中、高剂量组的肝脏指数略高于正常组(P<0.05),但低于模型组(P<0.05);PSCP低剂量组肝脏指数高于正常组(P<0.05),与模型组相比无显著变化。小鼠肝脏指数变化可能是由于HFD引起小鼠肝脏脂肪过度积聚[25]。而PSCP和阳性药物可以减轻肝脏脂肪沉积。

2.3 PSCP对小鼠肝脏形态的影响

各组小鼠肝脏大体形态的变化见图3。由图3可知,正常组小鼠肝脏体积较小,呈鲜亮的暗红色;模型组肝脏体积较大,颜色偏黄,肝脏表面可见些许脂肪斑点;阳性药物组肝脏色泽鲜亮,与正常组差别不大;PSCP低、中剂量组的肝脏比模型组颜色鲜亮。实验结果表明,PSCP对非酒精性脂肪肝有一定的改善作用。

2.4 PSCP对小鼠肝脏微观结构的影响

小鼠肝脏的HE染色结果见图4。由图4可以看出,正常组小鼠肝小叶结构清晰,肝索排列整齐,肝细胞呈多边形。模型组肝索排列混乱,肝窦变窄,肝细胞边界模糊,胞质内出现大量空泡,呈现脂肪变性,部分细胞核消失呈现坏死性改变;阳性药物组肝小叶、肝细胞结构与正常组较为接近。PSCP低、中剂量组肝细胞脂肪变性得到改善,细胞内的空泡数量减少。PSCP高剂量组肝小叶结构清晰,肝索放射状排列,肝细胞形态规则,与阳性药物组和正常组较为相似。

2.5 PSCP对小鼠肝细胞结构的影响

小鼠肝脏透射电镜结果见图5。由图5可知,正常组小鼠肝细胞胞质内线粒体和糖原丰富,且未见明显的脂滴。模型组肝细胞内线粒体数量减少并呈肿胀状态,糖原减少,胞内有大量且大小不等的电子密度低的圆形脂滴(饱和脂肪酸含量高)。阳性药物和PSCP干预后,低、中剂量组脂滴数量减少,线粒体和内质网数量增多,高剂量组脂滴数量的减少更明显,且脂滴的电子密度高(不饱和脂肪酸含量高),线粒体肿胀减轻,糖原和内质网数量接近于正常组。

2.6 PSCP对小鼠血清肝功能指标的影响

小鼠血清肝功能指标的变化见图6。从图6可以看出,与正常组相比,模型组小鼠血清的TC、TG、LDL-C、ALT和AST含量显著升高(P<0.05),HDL-C显著降低(P<0.05)。与模型组相比,高剂量PSCP和阳性药物对血清的TC、TG、LDL-C、ALT、AST和HDL-C含量改善效果显著(P<0.05),中剂量PSCP对血清的TC、TG、LDL-C、ALT和AST含量改善效果显著(P<0.05),对HDL-C的效果不显著。低剂量PSCP对血清的TG、LDL-C、ALT和AST含量改善效果显著(P<0.05),对TC和HDL-C的效果不显著;且PSCP引起的变化具有剂量依赖性。研究结果表明,给予PSCP后能恢复高脂饲料诱导的小鼠肝功能与脂代谢水平。

2.7 PSCP对小鼠肝组织抗氧化能力的影响

小鼠肝组织抗氧化能力指标的检测结果见图7。由图7可知,与正常组相比,模型组小鼠肝脏中GSH、SOD和CAT含量显著降低(P<0.05),MDA含量显著升高(P<0.05)。与模型组相比,PSCP中、高剂量和阳性药物对小鼠肝脏中的GSH、SOD、CAT和MDA含量改善效果显著(P<0.05);PSCP低剂量对肝脏中SOD、CAT和MDA含量改善效果显著(P<0.05),对GSH的改善效果不显著,其中PSCP引起的变化呈现出剂量依赖性。中、高剂量的PSCP给药组中的GSH、SOD、CAT和MDA水平与阳性药物组相近。研究结果表明,PSCP可以改善NAFLD小鼠肝组织内的抗氧化能力。

2.8 PSCP对小鼠肝组织AMPK信号通路相关蛋白表达的影响

AMPK信号通路相关蛋白的表达结果见图8。由图8可知,与正常组相比,AMPKα和p-AMPKα在模型组中的表达量显著降低(P<0.05),SREBP-1表达显著升高(P<0.05)。与模型组相比,AMPKα和p-AMPKα在PSCP低、中剂量组中的表达量显著升高(P<0.05),在高剂量组和阳性药物组中无显著影响。100 mg·kg-1的PSCP是引起AMPKα和p-AMPKα表达升高的最大剂量。SREBP-1在PSCP高剂量组中的表达量显著降低(P<0.05),在PSCP低、中剂量组和阳性药物组中无显著变化。

2.9 PSCP对小鼠肝脏NF-κB信号通路相关蛋白表达的影响

NF-κB信号通路中相关蛋白的表达见图9。由图9可知,与正常组相比,模型组NF-κB p50、NF-κB p65和IKKα的表达量升高(P<0.05),IκBα表达显著降低(P<0.05)。与模型组相比,NF-κB p50、IKKα和IκBα在PSCP低、中、高剂量组和阳性药物组中的改善效果显著(P<0.05)。NF-κB p65在PSCP高剂量组中显著降低(P<0.05),在PSCP低、中剂量组和阳性药物组中无显著变化。

3 讨 论

NAFLD通常表现为肝脏脂肪过度积聚,HFD诱导是建立NAFLD模型最常用的方法[26]。本研究制备的PSCP以分子质量小于3 kDa的活性肽为主,富含的甘氨酸,在抗肥胖、炎症和代谢综合征方面起着重要的作用[27]。PSCP和阳性药物可以明显改善高脂饮食造模后的肝脏形态,能调节NAFLD的肝组织结构。ALT和AST水平是判断肝功能最灵敏和最常用的生化指标[28],应用PSCP和阳性药物可降低NAFLD小鼠血清中的ALT和AST含量,恢复肝脏的代谢功能。

脂质代谢障碍,线粒体功能障碍,氧化应激等诸多因素,都会导致NAFLD的发生[29]。肝脂肪变性的关键特征表现为TG在肝细胞中的过度堆积[30]。因此,减轻肝脏脂肪变性和改善肝脏脂质代谢是预防NAFLD的潜在策略[31]。PSCP和阳性药物给予后改善了NAFLD小鼠血清肝功能指标,并调节了LDL-C和 HDL-C的水平,从而使肝脏的脂质代谢接近正常。基于活性氧过度产生导致的氧化应激与NAFLD的加剧密切相关[32],PSCP和阳性药物可以改善NAFLD小鼠肝脏中氧化应激相关指标,PSCP高剂量组的效果与阳性药物接近。因此,PSCP可增强内源性抗氧化系统,抵抗活性氧的侵袭,减轻NAFLD的脂肪堆积和氧化应激反应。

AMPK是一种能量传感器蛋白激酶,在调节细胞能量代谢中起关键作用,经代谢酶的直接磷酸化发挥调节作用,并通过转录调节因子的磷酸化产生长期效应[33]。实验结果显示：AMPKα、p-AMPKα在模型组中的表达量显著降低,AMPK的激活被抑制,导致其抑制能量产生途径,使蛋白质、碳水化合物和脂质生物合成能力减弱;而PCSP给药组和阳性药物组的AMPKα、p-AMPKα表达升高,促进AMPK的激活。SREBP-1对脂肪酸的合成与代谢以及甘油三酯的代谢有着重要的影响,其转位到细胞核中并激活参与胆固醇生物合成和脂质稳态的基因的转录[34]。模型组的SREBP-1表达显著升高,促进胆固醇生物合成,进而破坏肝脏细胞的脂质稳态,PSCP组和阳性药物组的SREBP-1表达降低,抑制了胆固醇的生物合成,起到保护细胞内脂质稳态的作用。研究结果表明,PSCP可以通过AMPK途径来改善NAFLD小鼠肝脏的脂质沉积。

有研究表明,AMPK可通过调节NF-κB某些蛋白活性,参与到NAFLD病理过程中,发挥着间接抑制肝脏炎症反应的作用[35-36]。NF-κB是一种多效性转录因子,广泛存在于机体的各种细胞,在受到外界刺激后激活,参与细胞的炎性反应,与细胞的凋亡过程紧密相关[37]。HFD诱导后使肝脏脂肪积蓄和游离脂肪酸含量增多,导致脂质代谢困难,造成体内氧化应激,进而激活NF-κB通路蛋白引发炎症反应[38]。PSCP可能作用于 NF-κB复合体,抑制NF-κB复合体的激活,使其以非活性状态IκBα在细胞中存在,从而减轻了小鼠NAFLD的炎症,促进肝脏的改善。

4 结 论

本研究以鮟鱇鱼皮为原料,提取分子质量小于3 kDa、富含甘氨酸的PSCP。研究结果表明,PSCP可以改善HFD引起的小鼠NAFLD病变,包括肝脏的形态结构和肝功能恶化。蛋白免疫印迹结果表明,PSCP可能是通过促进AMPKα信号通路的激活,抑制SREBP-1、NF-κB复合体的表达来改善脂质沉积、提高抗氧化能力和抑制炎症。研究结果旨在促进PSCP在护肝方面的应用,为海产品生物活性肽预防和改善NAFLD的新型护肝功能食品的开发提供理论依据。

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Effect and Mechanism of Pepsin-Solubilized Collagen Peptides from Lophius litulo Skin on Non-Alcoholic Fatty Liver Disease in Mice

CAO Hongjie,ZHANG Wen,MIAO Bingtao,REN Xiangyu,YE Jiena,TANG Yunping,YANG Zuisu*

(Zhejiang Provincial Engineering Technology Research Center of Marine Biomedical Products/School of Food and Pharmacy,Zhejiang Ocean University,Zhoushan 316022,China)

Abstract：To investigate the effect and mechanism of pepsin-solubilized collagen peptides from of Lophius litulo skin (PSCP) on high fat diet (HFD) induced non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD) in C57BL/6 mice.Forty-eight C57BL/6 mice were fed with high-fat diet for 4 weeks to induce the nonalcoholic fatty liver disease model.The mice were then treated with metformin,low,medium and high dose PSCP for 6 weeks.The serum physiological and biochemical indexes,liver oxidative stress level,liver histopathology changes and protein expression levels of the mice in each group were measured respectively.The experimental results show that compared with the model group,total cholesterol (TC),triglyceride (TG),low-density lipoprotein (LDL-C),aspartate aminotransferase (AST) and alanine aminotransferase (ALT) levels in the positive drug group and high dose PSCP group were significantly decreased (P<0.05),and HDL-C levels were significantly increased (P<0.05).glutathione (GSH),superoxide Dismutase (SOD),and catalase (CAT) activities in liver of the positive drug group,middle dose and high dose PSCP groups were significantly increased (P<0.05),while malondialdehyde (MDA) contents were significantly decreased (P<0.05).Hematoxylin-eosin (HE) staining and transmission electron microscopy showed that the liver structure of the positive drug group and PSCP groups was significantly improved.The results of protein immunoblotting showed that,compared with the normal group,the protein expression levels of AMPKα,p-AMPKα,and IκBα in the liver of model group were significantly decreased (P<0.05),while the protein expression levels of SREBP-1,p65,p50,and IKKα were significantly increased (P<0.05).However,after administration of the positive drug and PSCP,the protein expression levels of AMPKα,p-AMPKα,and IκBα were increased,and the protein expression levels of SREBP-1,p65,p50,and IKKα were decreased.The result showed that PSCP could effectively improve the biochemical indices of NAFLD mice and restore the liver tissue structure,and the mechanism might be related to AMPK/NF-κB pathway transduction.

Keywords：pepsin-solubilized collagen peptides from Lophius litulo skin;non-alcoholic fatty liver disease;blood lipids;AMPK/NF-κB pathway;inflammcotion

中图分类号：TS201.4

文献标志码：A

doi：10.12301/spxb202200938

文章编号：2095-6002(2023)03-0072-13

引用格式：曹洪杰,张文,缪秉陶,等.鮟鱇鱼皮酶溶胶原蛋白肽对小鼠非酒精性脂肪肝的影响及作用机制[J].食品科学技术学报,2023,41(3)：72-84.

CAO Hongjie,ZHANG Wen,MIAO Bingtao,et al.Effect and mechanism of pepsin-solublized collagen peptides from Lophius litulo skin on non-alcoholic fatty liver disease in mice[J].Journal of Food Science and Technology,2023,41(3)：72-84.

收稿日期：2022-10-12

基金项目：国家自然科学基金面上项目 (82073764);浙江省公益技术研究项目(LGN21D060002);浙江省“三农九方”农业科技协作计划揭榜挂帅项目(2022SNJF064)。

Foundation：National Natural Science Foundation of China (82073764);Zhejiang Provincial Public Welfare Technology Research Program (LGN21D060002);Zhejiang Province “Triple Agriculture Nine Aspects Cooperation”Science and Technology Cooperation Program (2022SNJF064).

第一作者：曹洪杰,男,硕士研究生,研究方向为海洋药物与海洋生物资源综合利用。

*通信作者：杨最素,女,教授,主要从事海洋药物与海洋生物资源综合利用方面的研究。

(责任编辑：郝一铭)