动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)是诱发缺血性心脏病和中风的潜在因素。《中国心血管健康与疾病报告2021》显示：中国心血管患病率正处于持续上升阶段,截至2021年我国心脑血管疾病患病人数约为3.3亿,每年约有300万人死于心脑血管疾病;而心脑血管疾病发病的主要原因之一就是动脉粥样硬化[1]。高脂饮食(high fat diet,HFD)可导致血浆胆固醇水平升高,是促进AS的重要风险因素之一,其中,富含载脂蛋白B的低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)在AS的发生与发展中起着至关重要的作用[2-3]。血液中过量的LDL-C进入动脉内膜后,触发炎症级联反应并促进AS形成;同时,伴随着富含胆固醇的泡沫细胞积累、脂质条纹形成,AS进一步发展[4-5]。高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)可促进胆固醇从外周巨噬细胞流出并逆向转运(RCT)至肝脏后被分解代谢,从而抑制AS的发展[6]。因此,调节RCT通路关键基因的表达可调控AS的发展。

肠道微生物在AS的发生中发挥重要作用。研究表明,肠道菌群的组成和结构,以及代谢产物短链脂肪酸(SCFAs)等可调节机体炎症状态、胆固醇和脂质代谢[7-8]。促炎细胞因子,包括肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白介素-6(IL-6)、白介素-1β(IL-1β)和抗炎细胞因子,如白介素-10(IL-10),在AS的发生和发展中也起着重要的作用[9]。IL-23和IL-22细胞因子是IL-10家族成员,可以控制肠道菌群促进AS代谢产物的生成,并通过调节肠道菌群稳态和炎症来远程抑制AS[10]。Caspase1-/-小鼠肠道中的促炎微生物可加速Ldlr-/-小鼠的AS形成,主要是由于SCFAs生成量的降低增加了血液中促炎细胞因子和白细胞的水平,同时引起AS斑块中中性粒细胞聚集[11]。因此,肠道菌群成为抑制AS发生和发展的新作用靶点。

一些研究表明,功能性低聚糖抑制了AS发展。郑军平等[12]发现,150 mg/kg的壳寡糖灌胃ApoE-/-小鼠12周可以有效逆转HFD喂养ApoE-/-小鼠AS的发展。饲料中添加质量分数为1%提取自酿酒酵母的甘露寡糖(MOS)可以降低雌性E3L.CETP小鼠AS斑块面积[13]。褐藻寡糖具有治疗动脉粥样硬化内皮细胞功能障碍潜力,可以通过integrin-alpha/FAK/PI3K 信号通路抑制H2O2诱导的人脐静脉内皮细胞的氧化应激和凋亡[14]。

魔芋甘露寡糖(konjac mannan oligosaccharides,KMOS)作为功能性低聚糖,是魔芋葡甘露聚糖的降解产物,主要由β-D-甘露糖和β-D-葡萄糖残基通过β-(1→4)糖苷键连接[15]。KMOS具有多种生理活性,如抗炎作用[16],抑制高脂膳食引起的小鼠肥胖[17],改善三硝基苯磺酸诱导的小鼠结肠炎[18],以及通过调节肠道菌群促进二甲双胍的降血糖效果[19]。KMOS还可以抑制抗生素对人体肠道益生菌的损伤[20]。1 800 mg·kg-1·d-1剂量的KMOS可以调节小鼠肠道功能,有效抑制地芬诺酯诱导的昆明小鼠便秘[21]。KMOS作为新食品原料,多种生理活性得到广泛报道,但尚未见KMOS对RCT途径的调节作用机制及对AS的调节作用的研究。本研究拟采用HFD诱导ApoE-/-小鼠,考察KMOS干预对小鼠AS的调节作用,探究RCT基因表达的变化,分析KMOS对肠道菌群的影响,为KMOS预防AS提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

ApoE-/-小鼠(雄性、C57BL/6背景、7周龄),北京维通利华实验动物技术有限公司,实验动物生产许可证编号：SCXK(京)2016-0006。

KMOS(聚合度2～10,其中聚合度在2～6的甘露糖质量分数为80%以上),西安源森生物技术有限公司;低脂对照饲料(D12450B)和HFD(TD10885,45%热量来自脂肪,总胆固醇添加质量分数为0.2%),北京华阜康生物科技股份有限公司,许可证编号：SCXK(京)2019-0008。低脂对照饲料中脂肪、碳水化合物和蛋白质的供能比分别为10%、70%和20%,HFD中脂肪、碳水化合物和蛋白质的供能比分别为44.6%、40.6%和14.8%。

苏木精-伊红(H&E)染色试剂盒,北京索莱宝科技有限公司;总胆固醇(TC)试剂盒、甘油三酯(TG)试剂盒、LDL-C试剂盒、HDL-C试剂盒、谷草转氨酶(AST)试剂盒、谷丙转氨酶(ALT)试剂盒,极低密度脂蛋白(VLDL)酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒、氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)ELISA试剂盒、IL-1β ELISA试剂盒、TNF-α ELISA试剂盒、IL-6 ELISA试剂盒、单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)ELISA试剂盒、LPS ELISA试剂盒、IL-10 ELISA试剂盒,南京建成生物工程研究所;mRNA提取试剂盒、mRNA反转录试剂盒、TB Green Premix Ex-Taq试剂盒,日本Takara公司;E.Z.N.A.® Soil DNA Kit试剂盒,美国Omega Bio-Tek公司;RIPA裂解液、BCA蛋白浓度测定试剂盒,上海碧云天生物技术有限公司;ECL化学发光检测试剂盒,美国Bio-Rad公司;Zo-1、Occludin和β-actin一抗,英国Abcam公司;辣根过氧化物酶标记的抗兔IgG二抗,美国Cell Signaling Technology 公司。其他试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

1500-823型酶标仪,美国Thermo Scientific公司;CFX系列实时荧光定量(quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)仪、ChemiDoc XRS 型显影系统,美国Bio-Rad公司;Nikon Eclipse E100型显微镜,日本尼康公司;PX224ZH型万分之一天平,上海奥豪斯仪器有限公司;DH-250型电热恒温培养箱,上海胜启仪器仪表有限公司;MiSeq PE300型高通量测序平台,美国Illumina公司;1260型高效液相色谱仪,美国安捷伦技术公司。

1.3 实验方法

1.3.1 动物分组及处理

实验小鼠饲养温度为(23±2)℃,相对湿度为50%～60%,12 h光照循环。实验程序按照《国家实验动物保健研究所护理和使用指南》进行,并得到中国农业大学实验动物福利小组委员会许可,动物伦理许可号：20185001-3。7周龄ApoE-/-小鼠适应性喂养1周后,将小鼠随机分为3组(每组8只),正常饮食组(ND)、HFD组、KMOS组。饮食干预14周期间,ND组小鼠饲喂低脂对照饲料,其余各组小鼠饲喂HFD。KMOS组小鼠在HFD喂养的同时,根据预实验结果按1 200 mg·kg-1·d-1剂量灌胃KMOS。ND组和HFD组小鼠灌胃等体积的纯净水。每周测定小鼠饮食量、摄水量及体质量。饮食干预14周后,小鼠禁食12 h,用戊巴比妥钠(50 mg·kg-1)麻醉。摘眼球采集血样,并保持在4 ℃至少4 h。收集小鼠心脏、主动脉、肝脏和盲肠组织。

1.3.2 小鼠组织H&E染色

实验小鼠的心脏和主动脉用磷酸盐缓冲盐水灌注,而后放入质量分数为4%的多聚甲醛中固定,经体积分数为70%的乙醇脱水后进行小鼠主动脉石蜡包埋,从小鼠主动脉窦起始横断面每隔100 μm取切片,切片厚度5 μm。采用H&E染色试剂盒对主动脉切片进行染色,通过Image J软件(NIH,Bethesda,Mariland,USA)分析主动脉病变面积。

收集小鼠同一部位的肝脏组织,经质量分数为4%的多聚甲醛固定后进行脱水、包埋、切片,采用H&E染色、无水乙醇脱水、二甲苯透明、树胶封片,用显微镜(100×)观察并拍照。

1.3.3 小鼠血脂和血清炎症细胞因子的测定

小鼠血样在4 ℃下,以3 500 r/min离心20 min,取上层血清。选用试剂盒测定小鼠血清中TC、HDL-C、LDL-C、TG、ALT和AST水平。采用ELISA检测试剂盒分析血清VLDL、ox-LDL、IL-1β、TNF-α、MCP-1、IL-6、IL-10和LPS水平。

1.3.4 小鼠肝脏组织中mRNA转录水平的测定

利用mRNA提取试剂盒提取小鼠肝脏的总RNA,并采用mRNA反转录试剂盒反转录合成cDNA。使用TB Green Premix Ex-Taq试剂盒(日本Takara)分析目标基因的mRNA转录水平,采用Gapdh作为内参基因,PCR分析引物序列,结果如表1。采用2-ΔΔCt法计算目标基因的mRNA相对表达量。

1.3.5 小鼠肠道菌群分析

按照DNA提取试剂盒操作说明,提取小鼠盲肠内容物(每组5只)的DNA。针对V3～V4区域设计聚合酶链式反应扩增引物序列(上游引物338F：5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’、下游引物806R：5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’),通过Illumina MiSeq PE300平台进行测序(委托上海美吉生物医药科技有限公司)。肠道菌群测序原始数据经处理和优化后,按照操作分类单元(OTU,相似度≥97%)进行单元划分,在OTU分类基础上分析物种丰度和多样性。利用LEfSe软件分析肠道微生物群落的组间差异,样品Kruskal-Wallis秩和检验进行差异筛选后,通过wilcoxon秩和检验进行两两组间比较并使用线性判别分析展示P<0.05及LDA>4的菌群。

1.3.6 小鼠盲肠短链脂肪酸的分析

取0.1～0.2 g盲肠内容物在超纯水中匀浆,以12 000 r/min离心10 min后,收集上清液。取100 μL上清液,依次加入50 μL浓盐酸及2.5 mL乙醚混合均匀后,室温静置20 min。上层有机相内加入1.0 mol/L的NaOH溶液500 μL,混合均匀后室温静置20 min,收集下层水相并过滤,采用高效液相色谱法测定肠道内容物中SCFAs含量。色谱条件：高效液相色谱仪和Agilent Hi-Plex柱(300 mm×6.5 mm×5 μm),流动相为超纯水和浓度为5 mmol/L的硫酸(体积比为2∶3),流速0.5 mL/min,柱温55 ℃,进样量10 μL。

1.3.7 小鼠结肠紧密连接蛋白表达的测定

使用含蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液于冰上裂解100 mg小鼠结肠组织30 min,4 ℃下以12 000 r/min离心15 min,收集上清液。使用BCA蛋白浓度测定试剂盒对收集的上清液的蛋白浓度进行测定,将所有的蛋白样品调整为相同浓度后,加入4×蛋白上样缓冲液,沸水浴处理10 min,用质量分数为8%的聚丙烯酰胺凝胶进行电泳、转膜、封闭。按照体积比为1∶1 000比例稀释Zo-1、Occludin和β-actin一抗,4 ℃孵育过夜后用TBST洗膜3次,将辣根过氧化物酶标记的抗兔IgG二抗,按体积比为1∶5 000的比例稀释,室温孵育1 h,使用ECL检测试剂盒、ChemiDoc XRS系统进行显影处理,最后使用Image J软件进行定量分析。

1.4 数据处理

实验数据采用Graphpad Prism 7.0软件进行处理。所有数据均以平均值±标准偏差表示,采用单因素方差分析(one-way ANOVA)进行显著性分析,P<0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 KMOS对HFD诱导的ApoE-/-小鼠主动脉窦病变的影响

小鼠主动脉根部切片H&E染色图和主动脉斑块面积的分析结果见图1。由图1(a)可知,相对于ND组,HFD组ApoE-/-小鼠主动脉发生了显著的AS病变,经KMOS干预后ApoE-/-小鼠主动脉窦AS斑块的形成受到抑制。由图1(b)、图1(c)可见,KMOS组的主动脉窦AS病变面积比率和AS斑块面积大小比HFD组分别降低了57.4%、57.9%。结果表明,KMOS显著减小了HFD诱导的ApoE-/-小鼠主动脉窦中的斑块病垢。

2.2 KMOS对HFD诱导的ApoE-/-小鼠脂质代谢的影响

高胆固醇血症是AS的主要危险因素之一。KMOS对HFD诱导的ApoE-/-小鼠血清脂质含量影响的实验结果见图2。由图2可知,与ND组相比,HFD组的TC、TG和LDL-C水平显著升高。经KMOS干预14周后,ApoE-/-小鼠血清中TC、TG及LDL-C水平相较于HFD组分别下降21.2%、19.6%、31.3%,而HDL-C水平升高63.0%。与HFD组相比,KMOS组小鼠的血清VLDL和ox-LDL水平降低25.8%、27.9%。结果表明,KMOS可以改善HFD诱导的ApoE-/-小鼠体内脂质代谢紊乱而抑制AS的发展。

2.3 KMOS对HFD诱导的ApoE-/-小鼠肝脏胆固醇代谢的影响

肝脏胆固醇代谢和AS的发展密切相关。KOMS对HFD诱导的ApoE-/-小鼠肝脏形态、体质量、肝脏质量以及参与胆固醇代谢的关键基因表达水平的影响,实验结果见图3。肝脏H&E染色结果表明,ND组小鼠肝脏结构正常、致密,肝细胞排列整齐[图3(a)]。HFD组小鼠肝脏出现明显的脂质积聚,表现为肝细胞肿胀、细胞质弥漫、肝脏组织切片中有大的脂滴。KMOS干预14周后,肝脏脂质聚积显著改善,肝细胞变性减轻。与HFD组相比,KMOS组小鼠血清中AST和ALT质量浓度显著降低[图3(b)]。本研究结果表明,KMOS可以在一定程度上预防HFD引起的肝功能损伤。此外,与HFD组相比,KMOS组ApoE-/-小鼠体质量和肝脏质量分别下降7.9%、14.0%[图3(c)]。

由图3(d)可知,与ND组相比,HFD组小鼠胆固醇合成相关基因Hmgcr的基因表达显著升高,而KMOS干预使Hmgcr基因mRNA的相对表达量显著降低了35.0%。与HFD组相比,KMOS组小鼠胆固醇吸收相关基因Ldlr表达水平增加1.7倍。胆固醇外流主要由Abca1、Abcg1和Sr-bi等介导。本研究结果表明,HFD组小鼠Abca1和Abcg1表达无影响,Sr-bi、Abcg5和Abcg8表达水平显著降低。KMOS显著促进调控RCT相关基因的表达,Sr-bi、Abca1、Abcg1、Abcg5和Abcg8的mRNA表达水平分别上升152.7%、38.5%、43.9%、151.4%、64.6%。由本研究结果可见,KMOS改善了HFD诱导的ApoE-/-小鼠胆固醇代谢。

2.4 KMOS对HFD诱导的ApoE-/-小鼠血清炎症因子的影响

血清炎症因子可促进AS的发展,ApoE-/-小鼠血清炎症因子水平实验结果见表2。由表2可知,HFD组小鼠血清中除IL-1β水平与ND组无显著性差异外,IL-6、MCP-1、TNF-α及LPS水平显著提高。KMOS干预14周后,ApoE-/-小鼠血清中炎症细胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α和LPS水平比HFD组降低了67.7%、48.3%、49.7%、59.3%,IL-10水平提高了125.2%,但是MCP-1含量无显著性差异。实验结果表明,KMOS改善了HFD诱导ApoE-/-小鼠的机体炎症状态。

2.5 KMOS对HFD诱导的ApoE-/-小鼠肠道菌群的影响

HFD诱导ApoE-/-小鼠的肠道菌群组成的实验结果见图4。图4(a)的韦恩图显示：3组小鼠共有OTU序列数304个,ND组与HFD组、KMOS组分别共有OTU序列数382个和403个;各组均有其特异性OTU序列(ND组84个、HFD组83个、KMOS组157个),与HFD组相比,KMOS干预后HFD诱导ApoE-/-小鼠肠道中微生物群落多样性得到明显提升,OTU序列由508个增加至593个。PCA分析发现,3组之间的微生物群落结构明显分离,表明KMOS显著改变了HFD诱导ApoE-/-小鼠肠道中微生物群落结构[图4(b)]。由图4(c)可知,在门水平上,HFD显著降低了拟杆菌门(Bacteroidetes)的相对丰度,增加了厚壁菌门(Firmicutes)的相对丰度,使厚壁菌门与拟杆菌门比值高于ND组。与HFD组相比,KMOS干预降低了厚壁菌门的相对丰度,增加了拟杆菌门的相对丰度。在门水平上,KMOS显著改变了HFD诱导的ApoE-/-小鼠肠道菌群组成。

经LEfSe分析的物种进化分支图(图5)显示,ND组ApoE-/-小鼠肠道菌群中c_Clostridia、f_Muribaculaceae、g_norank_f_Muribaculaceae和g_Lachnospiraceae_NK4A136_group相对丰度较高,HFD组ApoE-/-小鼠结肠菌群中c_Bacilli、o_Erysipelotrichales和f_Erysipelotrichaceae相对丰度较高。KMOS干预14周后,ApoE-/-小鼠肠道中g_norank_f_Lachnospiraceae、g_Alistipes、g_norank_f_Ruminococcaceae等菌群丰度与其他两组相比呈显著性差异。实验结果表明,KMOS改变了HFD诱导的ApoE-/-小鼠肠道菌群组成及结构。

2.6 KMOS对ApoE-/-小鼠盲肠SCFAs生成和肠道完整性的影响

肠道紧密连接蛋白表达水平的提高可发挥肠道屏障的保护作用。ApoE-/-小鼠盲肠SCFAs含量和肠道紧密连接蛋白相对表达量的分析结果见图6。由图6(a)可知,HFD组ApoE-/-小鼠盲肠内容物中SCFAs含量比ND组明显降低,其中乙酸、丙酸和丁酸含量分别降低21.1%、29.5%、31.8%。KMOS干预14周后,ApoE-/-小鼠盲肠内容物中SCFAs含量显著增加,乙酸、丙酸和丁酸含量分别提高23.0%、30.7%、39.7%。由图6(b)可知,HFD组ApoE-/-小鼠结肠中肠道紧密连接蛋白Zo-1和Occludin的mRNA表达水平比ND组显著降低,其中Zo-1基因的mRNA表达量降低32.8%。KMOS干预14周后,ApoE-/-小鼠结肠中Zo-1和Occludin基因的表达均显著提高。采用蛋白免疫印迹检测ApoE-/-小鼠结肠中紧密连接蛋白Zo-1和Occludin的表达水平[图6(c)],HFD组ApoE-/-小鼠结肠中肠道Occludin和Zo-1的蛋白表达水平显著低于ND组。KMOS干预14周后,ApoE-/-小鼠结肠中Zo-1和Occludin蛋白的表达均显著提高,Zo-1的蛋白表达水平增加48.5%,Occludin增加73.9%。本实验结果表明,KMOS促进了ApoE-/-小鼠盲肠SCFAs的生成,同时抑制了HFD诱导引起的肠道屏障损伤。

3 讨 论

膳食营养干预可有效调节机体代谢和炎症水平,保护宿主健康,从而抑制AS的发生和发展[13,22]。饮食中添加益生元是一种有较大潜力的营养干预方式,其中功能性低聚糖作为益生元由于功能的多样性及独特性被广泛应用,但是其在AS的预防和辅助治疗方面的研究较少。KMOS作为益生元,主链主要以β-1,4糖苷键连接,分子质量分布为342～1 639 Da[21]。KMOS具有调节免疫、抗肥胖、调节葡萄糖代谢、改善胰岛素抵抗以及抑制便秘等生物活性[15,17,23-24]。本研究采用KMOS(1 200 mg·kg-1·d-1)干预HFD诱导的ApoE-/-小鼠14周,结果显示,KMOS可能通过调节胆固醇代谢和肠道菌群抑制ApoE-/-小鼠AS的进展。

3.1 KMOS对ApoE-/-小鼠脂质代谢的影响

HFD诱导的血脂异常是诱发AS形成的重要因素之一[2]。血液循环中血脂过高会导致LDL渗透至血管内皮并经氧化修饰形成ox-LDL后局部沉积,沉积的脂蛋白招募单核巨噬细胞和平滑肌细胞吞噬脂质后形成泡沫细胞,诱导慢性炎症并加速AS发展[2]。研究表明,MOS可调节肥胖、代谢综合征和2型糖尿病的脂质代谢[17,25]。Hoving等[13]研究了饲料中添加质量分数为1%的MOS对雌性E3L.CETP小鼠AS的调节作用,MOS干预14周可抑制AS的发展,降低血清中的胆固醇含量,但甘油三酯含量并未发生显著变化。另有研究表明,对西方饮食诱导的肥胖小鼠采用添加KMOS(400 mg·kg-1·d-1)饮食干预4周后发现,小鼠血清中脂质组成及含量显著改善(TC、TG、LDL-C和HDL-C)[17]。本研究发现,KMOS干预能降低HFD引起的ApoE-/-小鼠主动脉窦AS斑块面积,ApoE-/-小鼠血清脂质含量也显著改善。KMOS抑制HFD引起的ApoE-/-小鼠体质量和肝脏质量增加的同时,肝脏组织脂质积聚和肝细胞变性均得到有效缓解。本研究结果表明,KMOS能调控小鼠脂质代谢水平,调节肝脏胆固醇代谢,有效抑制机体血脂异常。Yan等[26]以HFD诱导ApoE-/-小鼠构建AS模型,口服灌胃马尾藻甾醇(50 mg·kg-1·d-1)干预2周,通过调节ApoE-/-小鼠肝脏胆固醇代谢减轻血脂异常及AS的发展。该文献对于马尾藻甾醇发挥的胆固醇代谢调节作用与肠道、肠道菌群等因素之间的相关性未进行研究。雌性E3L.CETP小鼠经MOS干预14周后,AS得到有效抑制,但是小鼠肝脏中Cyp7a1和Cyp27a1基因表达水平无显著变化[13]。MOS可抑制脂肪组织脂肪生成相关基因的表达,进而抑制由于西方饮食诱导引起的雄性ICR小鼠肥胖[17]。为了进一步探究KMOS对小鼠主动脉及肝脏的脂质代谢调节机制,本研究对ApoE-/-小鼠肝脏RCT途径相关基因表达进行分析。结果表明,KMOS干预通过Sr-bi和Ldlr基因表达水平的提高促进了胆固醇从血液到肝脏的转运,从而降低血液中的胆固醇含量;同时Abcg5和Abcg8基因小鼠肝脏中表达的提高进一步促进了更多的胆固醇外排进入胆囊,从而抑制了肝脏中胆固醇的代谢失调。因此,KMOS很可能通过调节RCT途径,抑制HFD诱导的ApoE-/-小鼠血脂代谢异常。

3.2 KMOS对ApoE-/-小鼠炎症水平的影响

脂质代谢异常与炎症反应密切相关,而AS的发展过程中炎性反应处于长期持续激活状态[4-5]。研究表明,KMOS干预显著降低西方饮食诱导引起的肥胖小鼠血清炎症因子水平,如IL-6和TNF-α[14],而炎症可以导致大鼠RCT途径受损,促进细胞对脂质的摄取和蓄积,抑制细胞内的脂质流出,导致机体脂质代谢紊乱,进而促进AS的发展[27]。本研究发现,KMOS干预14周后,HFD诱导的ApoE-/-小鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α、MCP-1和LPS水平显著降低。因此,KMOS可能通过降低小鼠血清炎性因子水平,调节HFD诱导ApoE-/-小鼠的脂质代谢紊乱。

3.3 KMOS对ApoE-/-小鼠肠道菌群和肠道屏障的影响

肠道菌群不仅可以影响AS风险因素,如肥胖、血压等,还可以直接影响动脉粥样硬化斑块的形成[28]。双环醇(200 mg·kg-1)干预20周可以通过调节肠道菌群改善ApoE-/-小鼠主动脉弓胆固醇酯积累,缓解动脉粥样硬化的发展[29]。屎肠球菌(Enterococcus faecium)132菌株和副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)201菌株能够降低高胆固醇血症大鼠血脂水平[30]。在本研究中,HFD组与ND组不同的微生物菌落结构表明,HFD组小鼠的菌群失调,同时HFD组小鼠拟杆菌门相对丰度显著降低。动物实验和志愿者实验表明,厚壁菌门和拟杆菌门与肥胖显著相关[31],而g_Oscillibacter丰度在肥胖小鼠体内显著降低[32]。KMOS干预不仅增加了拟杆菌门相对丰度,还促进了g_Oscillibacter在小鼠肠道中富集。对3 432名中国人的全基因组测序结果表明,粪便中Oscillibacter和Alistipes的相对丰度增加与血液中甘油三酯浓度下降呈正相关[33],而Oscillibacter和Alistipes为KMOS组小鼠肠道优势菌株。因此,KMOS可能通过调节脂质代谢相关菌群丰度抑制ApoE-/-小鼠脂质代谢紊乱。此外,本研究发现,HFD组小鼠肠道菌群失调的同时,ApoE-/-小鼠肠道紧密连接蛋白表达水平下降,表明肠道屏障功能受损。肠道菌群平衡的破坏会引发肠道低度炎症,导致肠上皮细胞屏障损伤,大量细菌及细菌产物进入循环,进而引发全身系统性炎症,加速AS的发展[11,34]。KMOS干预增加了小鼠肠道菌群的丰度及多样性,特别是与抗炎相关的菌群,如f_Ruminococcaceae、f_Rikenellaceae和g_Bacteroides等。g_Bacteroides有助于预防冠心病,减少小鼠肠道微生物脂多糖生成并抑制AS[35]。f_Ruminococcaceae丰度的增加和f_Desulfovibrionaceae丰度的降低均可抑制肠道炎症的增加[36]。因此,KMOS通过调节小鼠肠道菌群抑制炎症,从而保护小鼠肠道屏障。与HFD组小鼠相比,KMOS干预在促进肠道紧密连接蛋白表达的同时,提高了小鼠盲肠内容物中SCFAs的含量。SCFAs是肠道上皮细胞的重要能量来源,有助于肠道稳态和上皮完整性,SCFAs的提高既能降低宿主体内炎症,又可以抑制AS的发展[37]。而SCFAs含量的增加可能与产短链脂肪酸细菌例如f_Ruminococcaceae丰度增加有关。因此,KMOS可能通过调节ApoE-/-小鼠的肠道菌群结构和代谢,保护肠道屏障功能并促进SCFAs的产生,从而抑制AS的发展。

4 结 论

研究了KMOS对HFD诱导的ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化的调节作用,发现KMOS可以有效减小ApoE-/-小鼠主动脉斑块面积,改善血脂代谢,促进肝脏RCT途径相关基因的表达。KMOS还能够调节肠道菌群结构,提高盲肠内容物中SCFAs含量,维护肠道屏障的完整性。因此,KMOS通过调节ApoE-/-小鼠胆固醇代谢和肠道微生物群,显著改善了HFD诱导的ApoE-/-小鼠AS发展。但是AS的发病机制非常复杂,后续将对肠道菌群在KMOS调节AS发展的作用机制方面进行深入研究,如KMOS对ApoE-/-小鼠胆固醇代谢调节作用与肠道菌群调节作用的相关性等,以期为益生元干预AS发展提供理论依据。

参考文献：

[1] 国家心血管病中心.中国心血管健康与疾病报告 2021 [R].北京：科学出版社,2022.

National Center for Cardiovascular Diseases.Annual report on cardiovascular health and diseases in China (2021) [R].Beijing：China Science Publishing &Media Ltd,2022.

[2] BAIGENT C,BLACKWELL L,EMBERSON J,et al.Efficacy and safety of more intensive lowering of LDL cholesterol：a meta-analysis of data from 170,000 participants in 26 randomised trials [J].Lancet,2010,376：1670-1681.

[3] CHANG T,STREJA E,MORADI H.Could high-density lipoprotein cholesterol predict increased cardiovascular risk ?[J].Current Opinion in Endocrinology,Diabetes and Obesity,2017,24：140-147.

[4] LIBBY P,BURING J,BADIMON L,et al.Atherosclerosis [J].Nature Reviews Disease Primers,2019,5：56.

[5] GISTERÅ A,HANSSON G.The immunology of atherosclerosis [J].Nature Reviews Nephrology,2017,13：368-380.

[6] MARQUES L,DINIZ T,ANTUNES B,et al.Reverse cholesterol transport：molecular mechanisms and the non-medical approach to enhance HDL cholesterol [J].Frontiers in Physiology,2018,9：526.

[7] ASCHER S,REINHARDT C.The gut microbiota：an emerging risk factor for cardiovascular and cerebrovascular disease [J].European Journal of Immunology,2018,48：564-575.

[8] BATTSON M,LEE D,WEIR T,et al.The gut microbiota as a novel regulator of cardiovascular function and di-sease [J].Journal of Nutritional Biochemistry,2018,56：1-15.

[9] FATKHULLINA A,PESHKOVA I,KOLTSOVA E.The role of cytokines in the development of atherosclerosis [J].Biochemistry,2016,81：1358-1370.

[10] FATKHULLINA A,PESHKOVA I,DZUTSEV A,et al.An interleukin-23-interleukin-22 axis regulates intestinal microbial homeostasis to protect from diet-induced athero-sclerosis [J].Immunity,2018,49：943.

[11] BRANDSMA E,KLOOSTERHUIS N,KOSTER M,et al.A proinflammatory gut microbiota increases systemic inflammation and accelerates atherosclerosis [J].Circulation Research,2019,124：94-100.

[12] 郑军平,原旭冰,孟宪璞,等.壳寡糖抑制ApoE基因敲除小鼠动脉粥样硬化的形成[J].沈阳农业大学学报,2018,49：150-157.

ZHENG J P,YUAN X B,MENG X P,et al.Chitosan oligosaccharides inhibit the occurrence of atherosclerosis in ApoE-/- mice [J].Journal of Shenyang Agricultural University,2018,49：150-157.

[13] HOVING L,KATIRAEI S,HEIJINK M,et al.Dietary mannan oligosaccharides modulate gut microbiota,increase fecal bile acid excretion,and decrease plasma cholesterol and atherosclerosis development [J].Mole-cular Nutrition and Food Research,2018,62：1700942.

[14] ZHAO J,HAN Y,WANG Z,et al.Alginate oligosaccharide protects endothelial cells against oxidative stress injury via integrin-alpha/FAK/PI3K signaling [J].Biotechnology Letters,2020,42：2749-2758.

[15] ZHU D,YAN Q,LI Y,et al.Effect of konjac mannan oligosaccharides on glucose homeostasis via the improvement of insulin and leptin resistance in vitro and in vivo[J].Nutrients,2019,11：1705.

[16] ZENG Y,ZHANG J,ZHANG Y,et al.Prebiotic,immunomodulating,and antifatigue effects of konjac oligosaccharide [J].Journal of Food Science,2018,83：3110-3117.

[17] YAN S,SHI R,LI L,et al.Mannan oligosaccharide suppresses lipid accumulation and appetite in western-diet-induced obese mice via reshaping gut microbiome and enhancing short-chain fatty acids production [J].Molecular Nutrition and Food Research,2019,63：1900521.

[18] LIU R,LI Y,ZHANG B.The effects of konjac oligosaccharide on TNBS-induced colitis in rats [J].International Immunopharmacology,2016,40：385-391.

[19] ZHENG J,LI H,ZHANG X,et al.Prebiotic mannan-oligosaccharides augment the hypoglycemic effects of metformin in correlation with modulating gut microbiota [J].Journal of Agricultural and Food Chemistry,2018,66：5821-5831.

[20] MAO Y,SONG A,YAO Z,et al.Protective effects of natural and partially degraded konjac glucomannan on Bifidobacteria against antibiotic damage [J].Carbohydrate Polymers,2018,181：368-375.

[21] LIU X,CHEN S,YAN Q,et al.Effect of konjac mannan oligosaccharides on diphenoxylate-induced constipation in mice [J].Journal of Functional Foods,2019,57：399-407.

[22] YU Y,LUO T,LIU S,et al.Chitosan oligosaccharides attenuate atherosclerosis and decrease non-HDL in ApoE-/- mice [J].Journal of Atherosclerosis and Thrombosis,2015,22：926-941.

[23] 温永平,唐季清,韩冬,等.魔芋甘露寡糖对酸奶免疫调节活性的影响 [J].食品科学,2021,42：133-142.

WEN Y P,TANG J Q,HAN D,et al.Effects of konjac mannanoligosaccharide fortiflcation on immunomodulatory activity of yogurt [J].Food Science,2021,42：133-142.

[24] LI T,YAN Q,WEN Y,et al.Synbiotic yogurt contain-ing konjac mannan oligosaccharides and Bifidobacterium animalis SSP.lactis BB12 alleviates constipation in mice by modulating the stem cell factor (SCF)/c-Kit pathway and gut microbiota [J].Journal of Dairy Science,2021,104：5239-5255.

[25] WANG H,ZHANG X,WANG S,et al.Mannan-oligosaccharide modulates the obesity and gut microbiota in high-fat diet-fed mice [J].Food &Function,2018,9：3916-3929.

[26] YAN Y,NIU Z,WANG B,et al.Saringosterol from sargassum fusiforme modulates cholesterol metabolism and alleviates atherosclerosis in ApoE-deficient mice [J].Marine Drugs,2021,19：485.

[27] MCGILLICUDDY F,DE L,HINKLE C,et al.Inflammation impairs reverse cholesterol transport in vivo[J].Circulation,2009,119(8)：1135-1145.

[28] KOMAROFF A.The microbiome and risk for atherosclerosis [J].JAMA,2018,319：2381-2382.

[29] LI X,CUI J,ZHENG W,et al.Bicyclol alleviates atherosclerosis by manipulating gut microbiota [J].Small,2022,18：2105021.

[30] YANG L,XIE X,LI Y,et al.Evaluation of the cholesterol-lowering mechanism of Enterococcus faecium strain 132 and lactobacillus paracasei strain 201 in hypercholesterolemia rats [J].Nutrients,2021,13：1982.

[31] TURNBAUGH P,LEY R,MAHOWALD M,et al.An obesity-associated gut microbiome with increased capacity for energy harvest [J].Nature,2006,444：1027-1031.

[32] WU J,WANG K,WANG X,et al.The role of the gut microbiome and its metabolites in metabolic diseases [J].Protein Cell,2021,12：360-373.

[33] LIU X,TONG X,ZOU Y,et al.Mendelian randomization analyses support causal relationships between blood metabolites and the gut microbiome [J].Nature Gene-tics,2022,54：52-61.

[34] LI B,XIA Y,HU B.Infection and atherosclerosis：TLR-dependent pathways [J].Cellular and Molecular Life Sciences,2020,77：2751-2769.

[35] YOSHIDA N,EMOTO T,YAMASHITA T,et al.Bacteroides vulgatus and Bacteroides dorei reduce gut microbial lipopolysaccharide production and inhibit atherosclerosis [J].Circulation,2018,138：2486-2498.

[36] MAO J Z,WANG D X,LONG J Y,et al.Gut microbiome is associated with the clinical response to anti-PD-1 based immunotherapy in hepatobiliary cancers [J].Journal for Immunotherapy of Cancer,2021,9：003334.

[37] KASAHARA K,KRAUTKRAMER K,ORG E,et al.Interactions between roseburia intestinalis and diet modu-late atherogenesis in a murine model [J].Nature Microbiology,2018,3：1461-1471.

Regulatory Effect and Mechanism of Konjac Mannan Oligosaccharides on Atherosclerosis in ApoE-/- Mice

LI Junyi1, ZHEN Hongmin2, LI Yanxiao3, WANG Nannan1, YANG Shaoqing1,JIANG Zhengqiang1,*

(1.College of Food Science and Nutritional Engineering /Key Laboratory of Food Bioengineering (China National Light Industry),China Agricultural University,Beijing 100083,China;2.School of Food and Health,Beijing Technology and Business University,Beijing 100048,China;3.College of Engineering,China Agricultural University,Beijing 100083,China)

Abstract：Konjac mannan oligosaccharides (KMOS) have a variety of beneficial effects on human health,but their regulator effects on atherosclerosis (AS) and the involved molecular mechanisms have not been well understood.In this study,AS model was established by feeding ApoE-/- mice with high fat diet (HFD) for 14 weeks and used for investigating the effects of KMOS intervention on aortic lipid accumulation,serum lipid,and inflammatory factors.The regulatory effect of KMOS on gut microbiota of AS mice was analyzed by using Illumina high-throughput sequencing technology.The results showed that KMOS supplementation significantly inhibited the increase of body and liver weight induced by HFD.Comparing with HFD group,the area ratio and total area of plaque lesions in aortic sinus induced by HFD was reduced by 57.4% and 57.9%,respectively after KMOS treatment.The total serum cholesterol levels and low-density lipoprotein cholesterol levels were decreased by 21.1% and 31.1%,whereas the high-density lipoprotein cholesterol level was significantly increased by 63.0% after KMOS treatment.Meanwhile,lipid accumulation in the liver of HFD induced ApoE-/- mice was significantly improved.The levels serum inflammatory factors (tumor necrosis factor α,interleukin-6,interleukin-1β,and monocyte chemotactic protein-1) were reduced by KMOS,compared with AS model group.Moreover,the expression of genes associated with liver cholesterol reverse transport was significantly increased by KMOS.Furthermore,KMOS inhibited the dysbiosis of gut microbiota in ApoE-/- mice induced by HFD with increased relative abundances of g_norank_f_Lachnospiraceae,g_Alistipes,and g_norank_f_Ruminococcaceae.The production of short chain fatty acids in the cecum was promoted and the expression of intestinal tight junction proteins was increased by KMOS to prevent the impairment of intestinal barrier function.Thus,KMOS could alleviate the development of AS in ApoE-/- mice induced by HFD through the regulation of cholesterol metabolism and gut microbiota.This results aimed to provide theoretical basis for development of KMOS related functional food.

Keywords：atherosclerosis;konjac mannan oligosaccharides;gut microbiota;cholesterol metabolism;inflammatory factors

中图分类号：TS201.4;TS202.1

文献标志码：A

doi：10.12301/spxb202200591

文章编号：2095-6002(2023)03-0041-13

引用格式：栗君谊,甄红敏,李延啸,等.魔芋甘露寡糖对ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化的调节作用及机制[J].食品科学技术学报,2023,41(3)：41-53.

LI Junyi,ZHEN Hongmin,LI Yanxiao,et al.Regulatory effect and mechanism of konjac mannan oligosaccharides on atherosclerosis in ApoE-/- mice[J].Journal of Food Science and Technology,2023,41(3)：41-53.

收稿日期：2022-06-22

基金项目：国家“十三五”重点研发计划项目(2021YFC2100302)。

Foundation：National Key Research and Development Program of China (2021YFC2100302).

第一作者：栗君谊,女,博士研究生,研究方向为益生元功能活性。

*通信作者：江正强,男,教授,博士,主要从事食品生物技术方面的研究。

(责任编辑：叶红波)