腐败希瓦氏菌(Shewanella putrefaciens)是引起冷藏水产品腐败的革兰氏阴性特定腐败菌,会造成冷藏水产品产生恶性硫臭等不良气味,营养成分和食用价值流失[1]。革兰氏阴性菌细胞外膜成分庞杂,其中脂蛋白是外膜的重要成分之一,其氮端在细胞内膜由脂质加以修饰成熟后吸附在细胞外膜内叶或内膜外叶上,亦称脂锚定蛋白,在细菌营养获取和应激反应调节中发挥着重要作用[2-4]。控制革兰氏阴性菌脂蛋白转运的系统被称为外膜脂蛋白定位(lipoproteinouter membrane localization, Lol)系统,该系统特异性指导脂蛋白的靶向定位,使脂蛋白得以顺利表达,实现其生理功能。

Lol系统主要包含5个蛋白质:LolA、LolB、LolC、LolD和LolE[5]。脂蛋白需要经过细胞周质空间方能从细胞内膜到达细胞外膜,主要由3个步骤完成。先由LolC、LolD、LolE形成接收脂蛋白的复合物,将脂蛋白传递给LolA,LolB再从LolA接收脂蛋白[6],最后将其传递至外膜[7]。LolB可视为Lol系统的最后一个工作站,负责脂蛋白结合、膜靶向定位和膜结合。研究发现若缺失LolB,LolA会在周质空间内会不断堆积,达到一定数量后对细胞产生毒性[8]。大肠杆菌(Escherichia coli)的LolB是脂蛋白转运的关键一环,缺乏LolB的细胞将不能运送脂蛋白[9-11]。此外当黄单胞杆菌(Xanthomonas campestrispv. campestris)缺失lolB基因后,对胁迫的耐受性降低,表现在编码主要胞外酶和应激相关蛋白的基因表达降低,这些基因是黄单胞杆菌附着、胁迫耐受性和产生毒力必需的关键基因[12]。以细胞壁和细胞膜的组分作为靶点的抗菌药物的开发已成为研究热点,鉴于脂蛋白对革兰氏阴性细菌的重要性,LolB的结构功能解析可能成为靶向控制细菌转运脂蛋白的关键,对研究细菌的靶向控制具有重要意义。

目前,腐败希瓦氏菌脂蛋白定位系统中LolB蛋白的结构功能特点和表达情况尚不清楚。本研究拟对水产品腐败希瓦氏菌lolB基因进行克隆,通过生物信息学的方法分析腐败希瓦氏菌LolB的理化性质和结构功能特点,通过实时荧光定量PCR(RT-PCR)技术分析lolB基因在腐败希瓦氏菌受环境胁迫(饥饿、乙醇、渗透压、低温或高温)和群体感应信号分子诱导时的表达特性,旨在为腐败希瓦氏菌脂蛋白转运系统的研究提供一定参考,为进一步抑制水产品腐败希瓦氏菌提供新思路。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

腐败希瓦氏菌SP22分离于腐败的大菱鲆,于-80 ℃贮藏。

细菌基因组DNA提取试剂盒、GeneRed核酸染料,天根生化科技(北京)有限公司; PCR酶(2×EasyTaq PCR SuperMix)、电泳检测 DNA Marker (Trans2K Plus DNA Marker)、 6×DNA Loading Buffer,北京全式金生物技术有限公司;LB营养肉汤、Biowest琼脂糖,青岛高科园海博生物技术有限公司;PCR引物、EZ-10总RNA小量提取试剂盒、RNase-Free DNA 清除试剂盒、固相 RNase 清除剂、溶菌酶、 TE 缓冲液,生工生物工程(上海)股份有限公司; PrimeScript reagent Kit with gDNA Eraser、 TB Green Premix Ex Taq,宝日医生物技术(北京)有限公司。

1.2 仪器与设备

Mastercycler nexus X2型防蒸发梯度 PCR 仪,德国 Eppendorf 公司;Ge1Doc XR+型全自动凝胶成像系统,美国 Bio-Rad 公司;Legend Micro21R型微量冷冻离心机、NanoDrop One型超微量紫外可见光分光光度计、Applied Biosyetems StepOnePlus型荧光定量 PCR 仪,美国 Thermo 公司;Discovery Studio 2017 R2 软件,美国 Biovia 公司。

1.3 实验方法

1.3.1 lolB基因的克隆、序列比对及系统发育树的构建

采用细菌基因组DNA提取试剂盒提取腐败希瓦氏菌SP22基因组DNA作为PCR模板。检索腐败希瓦氏菌相关菌株基因组(GenBank: CP028435.1)的lolB基因序列,根据基因的上下游序列设计引物(上游引物:5′-CTAAGAAGCGAATCCTAAGTG-3′,下游引物:5′-CTAATGTGGTGGCAGCAT-3′)。 PCR 扩增条件:94 ℃、2 min,94 ℃、 30 s,52 ℃、30 s,72 ℃、1 min,循环30次;72 ℃延伸10 min。扩增产物经0.015 g/mL琼脂糖凝胶电泳检测后移交生工生物工程(上海)股份有限公司。使用软件 DNAMAN将得到的双向序列结果进行拼接后,提交至 BLAST (https:∥blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)进行序列比对。

利用MEGAX软件的Muscle算法将水产品中的特定腐败菌荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)、蜂房哈夫尼亚菌(Hafnia alvei),水产品中的致病菌大肠杆菌(Escherichia coli O157:H7)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus),及腐败希瓦氏菌的LolB氨基酸序列进行比对,使用邻接法(neighbor-jioning method,NJ)、Bootstrap method检验1 000次构建系统发育树[13]。序列从NCBI数据库检索下载。

1.3.2 LolB蛋白理化性质及功能区预测

ProtParam工具(https:∥web.expasy.org/protparam/)用于计算LolB蛋白的各项理化参数。 ProtScale工具(https:∥web.expasy.org/protscale/)、 Signal P5.0 Sever、 TMHMM Sever v.2.0、在线服务器NetPhos 3.1和NetNGlyc 1.0分别用于分析LolB蛋白的亲疏水性、蛋白信号肽、蛋白跨膜区、磷酸化位点和糖基化位点的预测。

1.3.3 LolB蛋白的结构域及高级结构预测

在线工具CDD(https:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)、PSIPRED(http:∥bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/)、SWISS-MODEL(https:∥swissmodel.expasy.org)分别用于预测LolB蛋白结构域、二级结构和三级结构,并对三级结构进行模型质量评估(https:∥saves.mbi.ucla.edu/)。

1.3.4 互作蛋白及配体结合位点预测

STRING(https:∥string-db.org/)和 COACH (https:∥zhanggroup.org∥COACH/)分别用于预测LolB蛋白的互作蛋白及配体结合位点。

1.3.5 lolB基因的表达特性测定

1.3.5.1 细菌培养及胁迫处理

将活化的腐败希瓦氏菌以2%接种量接种于新鲜的 0.025 0 g/mL的LB肉汤培养基中,在28 ℃、160 r/min的摇床中培养至对数生长期,此时的菌悬液记为0 h样品。将培养后的腐败希瓦氏菌分别进行不同的胁迫处理。营养胁迫:使用无菌水将培养的对数期菌悬液稀释至0.015 0、0.012 5 g/mL培养基浓度,未额外添加无菌水的培养基作为对照组(0.025 0 g/mL)。乙醇胁迫:将无水乙醇添加至对数期菌悬液,使得乙醇体积分数为0%(对照组)、5%和10%。渗透压胁迫:将NaCl添加至对数期菌悬液,使得NaCl质量浓度为0.05、0.10、0.15 g/mL,未额外添加NaCl的菌悬液作为对照组。将营养、乙醇、渗透压胁迫处理后的样品继续置于28 ℃振荡培养1、3、5 h,收集菌体备用。温度胁迫:将对数期菌悬液分别置于28 ℃(对照组)、4 ℃和45 ℃培养箱中静置培养1、3、5 h,收集菌体备用。

1.3.5.2 群体感应信号分子诱导及分子对接实验

分别向1.3.5.1节培养的对数期菌悬液中添加10 μmol/L的外源信号分子C6-HSL、C12-HSL和C14-HSL,与未添加信号分子的对数期菌悬液(对照组)共同置于28 ℃振荡培养1、3、5 h,收集菌体备用。利用分子对接技术进一步分析C6-HSL、C12-HSL和C14-HSL与LolB蛋白的相互作用:在Pubchem下载3种信号分子的结构,在Discovery Studio上对1.3.3节得到的LolB蛋白模型去除水分子、添加氢原子和定义受体活性位点;对小分子进行full minimization预处理。将处理好的蛋白质和小分子在DS软件下的“CDOCKER”进行对接,根据“-CDOCKER ENERGY”筛选出和LolB结合最佳的小分子,分析LolB蛋白和信号分子之间的相互作用。

1.3.5.3 实时荧光定量PCR分析

收集菌体后,按照总RNA提取试剂盒的操作方法提取RNA,并采用分光光度法检测RNA纯度,琼脂糖凝胶电泳法检测RNA完整度。依照 PrimeScript reagent Kit with gDNA Eraser 试剂盒的说明先后进行去除基因组 DNA反应和反转录反应得到模板cDNA样品。lolB基因RT-PCR上游引物序列为5′-GCATGGGAATTACAGGGCAAACTTG-3′,下游引物序列为5′-CCTAGCATTGTCGTGAGCGTGAG-3′。以16S rRNA为内参基因,其上游引物序列为5′-GGAGGAAGGTGGGGACGA-3′,下游引物序列为5′-GACTACGACGAGCTTTGTGAGATTA-3′。利用2× SYBR Green Abstart PCR Mix试剂盒进行实时荧光定量PCR反应,反应程序设定为95 ℃ 预变30 s、95 ℃变性5 s、60 ℃退火30 s,循环40次,采用2-△△Ct法进行分析。

1.4 数据处理

每组实验均进行3次重复,数据表示为平均值±标准偏差。统计分析采用 SPSS 19.0软件进行,当P<0.05时数值具有显著性差异。采用Origin 9图像分析软件生成所需图表。

2 结果与分析

2.1 lolB基因的克隆、序列比对及系统发育树分析

目的片段的PCR扩增产物凝胶电泳结果如图1(a)。经双向测序,得到的测序峰图良好。序列与NCBI数据库中腐败希瓦氏菌WS13、200等多个菌株的lolB基因序列一致性为100%,序列全长645 bp,表明测序获得的序列为腐败希瓦氏菌SP22的lolB序列,可用于后续分析。通过 MEGAX 构建的7个水产品腐败菌和致病菌的LolB蛋白系统发育树结果如图1(b)。图1(b)结果表明:该系统发育树有2个主分支,其中副溶血性弧菌、蜂房哈夫尼亚菌及大肠杆菌聚类在同一分支;而腐败希瓦氏菌和恶臭假单胞菌、荧光假单胞菌及铜绿假单胞菌聚类在同一分支,表明它们的序列相似性较高并且具有较近的亲缘关系[14],蛋白质功能上可能更具有相似性。

M: DNA marker,1～3:目的基因lolB。
图1 腐败希瓦氏菌外膜脂蛋白受体lolB基因 PCR扩增产物及LolB蛋白系统发育树
Fig.1 PCR amplification products of outer membrane lipoprotein receptor lolBof Shewanella putrefaciensand phylogenetic tree of LolB

2.2 LolB蛋白理化性质及功能区分析

通过ProtParam预测的腐败希瓦氏菌LolB相关理化性质如表1。由表1可知,该蛋白质氨基酸组成中带负电荷氨基酸的数目大于带正电荷氨基酸的数目,为酸性蛋白质。LolB蛋白的不稳定指数小于40,可定义为稳定蛋白[15]。LolB蛋白N端具有亲水性,C端具有疏水性,其中第19个氨基酸位点处存在最大值2.33,疏水性较强;在第74位氨基酸位点处存在最小值-3.100,亲水性较强,LolB蛋白的总平均亲水性为负值,表明该蛋白质为亲水性蛋白。了解LolB蛋白某个氨基酸位点详尽的亲水、疏水性,可利用蛋白质分子动力学技术按需修正位点稳定性[16]。信号肽和跨膜区预测LolB蛋白含有显著信号肽切割位点,位于第25位氨基酸和第26位氨基酸之间(LGG-CQ),不存在跨膜区结构,分析其定位于细胞膜外侧,结合相关研究可预测腐败希瓦氏菌LolB蛋白是一种细胞外膜脂锚定蛋白[8]。LolB共有21个超过阈值的磷酸化位点,其中包含丝氨酸(Ser)位点11个,苏氨酸(Thr)位点9个,酪氨酸(Tyr)位点1个。未预测到蛋白LolB的糖基化位点。

表1 腐败希瓦氏菌外膜脂蛋白受体LolB的理化性质

Tab.1 Physicochemical properties of outer membrane lipoprotein receptor LolB of Shewanella putrefaciens

理化性质分子式C1070H1699N291O321S5M/u23936.32脂肪族指数96.68不稳定指数32.83半衰期(大肠杆菌中)/h>10总平均亲水性-0.346氨基酸数量214等电点5.66带正电荷氨基酸数量比例/%9.3带负电荷氨基酸数量比例/%11.6

2.3 LolB的结构域与高级结构分析

通过 CDD 预测的LolB结构域如图2(a)。由图2(a)可知,构成LolB疏水核心位点的23个残基已映射到查询序列中,还存在脂质结合位点于第85位氨基酸残基(L),属于LolA折叠类超科,该超科内还含周质分子伴侣蛋白LolA和周质蛋白RseB等[17-18]。LolB蛋白二级结构中,α-螺旋结构占全序列23.36%,无规则卷曲占46.26%,β-折叠占25.7%,β-转角占4.67%,无规则卷曲和β-折叠是蛋白质二级结构的主要组成体系。通过选取 SWISSMODEL 中大肠杆菌的1iwm.2链为模板,进行LolB的三级结构的同源建模,结果如图2(b)。图2(b)表明,LolB蛋白是一种典型的桶状结构。LolB三级模型经PROCHECK检验,拉式构象结果显示LolB氨基酸残基占有利区域88.2%、额外允许区域11.8%、一般允许区域0%和不允许区域0%,而氨基酸残基占有利区和额外允许区的总比例高于90%时即符合立体化学的规则[19]。Verify 3D检验结果显示,LolB模型的平均分≥0.2的氨基酸量为100%,而平均分≥0.2的氨基酸的量达到80%时模型质量合格。结果表明,LolB蛋白三级模型质量良好。LolB的整体结构与周质分子伴侣蛋白LolA十分相似,它们都是由11条反平行的β链折叠成一个不完整的β桶状结构,在桶的内部存在1个疏水腔,2个环状的结构覆盖在β桶上,2个α螺旋结构在桶和环之间[20]。

图2 LolB的结构域及三级结构
Fig.2 Domain and tertiary structure of LolB

图3 LolB蛋白互作网络及配体结合位点
Fig.3 Interaction network and ligand binding site of LolB

2.4 LolB蛋白的互作蛋白和配体结合位点分析

LolB蛋白的互作蛋白及配体结合位点分析见图3。细胞中许多蛋白基本功能的实现离不开与蛋白质之间的相互作用。通过 STRING 数据库预测到10个与腐败希瓦氏菌外膜脂蛋白LolB存在相互作用的蛋白质,结果如图3(a)。由图3(a)可知,蛋白质间以不同颜色的连线来表现互作方式,连线颜色越多样,表明蛋白质间的互作关系越密切。与预期结果一致,周质空间伴侣蛋白LolA与LolB存在相互作用,在脂蛋白的转运过程中,LolA的β桶口加宽,桶中心的螺旋发生位移,而LolA桶的开口处就是脂蛋白相互作用位点,LolB和LolA的蛋白折叠结构相似,因此它们是通过各自β桶结构进行脂蛋白运输,类似于一种“口对口的”交接方式[21-22]。保守假定蛋白(ABP74170.1)参与脂蛋白从内膜到外膜的易位,LolC和LolE家族跨膜蛋白(ABP75875.1)参与脂蛋白的跨膜释放,ABC转运相关蛋白(MacB)是一种包含跨膜结构域的非规范的ABC转运蛋白,可以与LolB蛋白共同表达[23]。4-二磷酰-2-C-甲基-D-赤藓糖醇激酶(IspE)是参与MEP(2-C-methyl-D-erythritol 4-phosphate)途经的第4种酶,对细菌存活至关重要[24],该酶可能和LolB合作在异戊二烯生物合成中催化4-二磷酰-2-C-甲基-D-赤藓醇的第2位羟基的磷酸化。甲苯耐受性家族蛋白可以降解甲苯以增加细胞膜刚性,LolB蛋白可能参与去除甲苯这一过程。LolB可能和N-乙酰谷氨酸合成酶(ArgA)参与L-精氨酸生物合成的第1个关键步骤——催化谷氨酸和乙酰辅酶A产生N-乙酰谷氨酸。LolB存在与催化型裂解转糖酶(MltF)裂解N-乙酰氨基甲酸和N-乙酰葡糖胺之间糖苷键的可能性,以维持胞壁质的稳定性。另外除了蛋白IspE外,LolB和其余9个蛋白质都存在明显的共表达关系。利用 COACH 分析蛋白LolB的配体结合位点,结果如图3(b)。由图3(b)结果可知,配体结合位点残基在53、70、79、128、130、184、195和197位氨基酸,已知LolB和LolA在彼此疏水腔入口处发生相互作用,是脂蛋白酰基链的结合位点[25]。

2.5 环境胁迫下lolB基因的表达情况分析

不同小写字母表示组间数据差异显著(P<0.05)。
图4 不同环境胁迫下lolB基因的表达结果
Fig.4 Results of lolBgene expression under different environmental stress

图5 lolB基因在不同信号分子刺激下的表达量变化及作用模式
Fig.5 Expression changes and action mode of lolBgene in response to different signaling molecules stimulation

通过 RT-PCR 技术测定营养胁迫、乙醇胁迫、渗透压胁迫和温度胁迫对lolB基因表达量的影响,结果如图4。由图4可知,对照组的lolB基因呈持续表达的趋势,表明lolB可能是维持腐败希瓦氏菌正常生命活动的重要基因,这与大肠杆菌中LolB蛋白的关键性相似[10]。由图4(a)可知,当LB肉汤培养基浓度为0.015 0 g/mL时,lolB在5 h时显著上调表达,约是对照组(0.025 0 g/mL)的4倍、0 h的18倍;然而当LB肉汤培养基浓度为0.012 5 g/mL时,严重饥饿引起lolB基因表达显著下调;特别是在相同处理时间下,0.012 5 g/mL培养基下lolB基因的表达显著低于0.015 0 g/mL培养基处理组。这可能由于在营养物质含量降低时细菌通过调动细胞膜透过性来提高营养物质摄入,因而,与膜脂蛋白转运有关的lolB基因表达上调;而在遇到较强营养缺乏时,则不再调动lolB基因,采用其他的应对策略。已有研究报道,LolB运输脂蛋白也是细菌获取营养的关键[2]。由图4(b)可知,体积分数5%的乙醇处理后,lolB基因在1、3、5 h的表达量分别是对照组的1.6、2.0、1.5倍,呈上升趋势;10%的乙醇处理后3 h和5 h的lolB表达量显著下调。在相同处理时间下,随着处理时间的延长,5%乙醇体积分数下lolB基因表达量显著高于10%处理组,这与营养胁迫时的结果相类似。乙醇对细胞的损伤首先从接触细菌的外膜开始,推测在5%乙醇下,细菌通过调动lolB基因,增加脂蛋白转运,进而维持膜的完整性,但随着乙醇体积分数增大,细胞生存受到影响,则改变了应对该胁迫的主要通路。由图4(c)可知,lolB持续高表达抵抗渗透压胁迫;额外添加0.05 g/mL的NaCl时,lolB在1、3、5 h表达量呈上升趋势,分别约是对照组的2.0、1.5、3.0倍。不同NaCl质量浓度下,处理1 h时lolB基因表达量随着NaCl质量浓度的增大而逐渐升高,而随着处理时间的延长,lolB基因表达量随着NaCl质量浓度的增大而逐渐降低,表明lolB基因表达受盐质量浓度和处理时间的影响。由图4(d)可知,4 ℃培养时,lolB基因的表达与对照组相似,呈上升趋势;热胁迫下lolB在1 h时显著上调表达,约是对照组和4 ℃培养时的2.0倍,表明高温对lolB基因表达的影响较大,这与黄单胞杆菌缺失lolB基因后对耐热性降低的现象相似[12]。腐败希瓦氏菌作为革兰氏阴性菌相较于革兰氏阳性菌拥有复杂的细胞外膜,由脂蛋白等多种成分形成保护性屏障以抵抗外界复杂环境,脂蛋白的正确定位必须依靠脂蛋白转运系统进行。而LolB蛋白负责脂蛋白转运系统工作的最后一步,将脂蛋白传递至细胞外膜。本研究结果表明:当腐败希瓦氏菌遭受环境胁迫时,lolB基因大多显示上调表达模式;而胁迫压力加强时大多数情况下呈先升后降的表达趋势。黄单胞杆菌缺失lolB基因后会影响编码胞外酶基因表达和细胞膜的完整性来应对胁迫[12],lolB基因表达调控可以改善脂蛋白运输,进而维持细胞膜功能,应对不利环境,因此推测lolB基因可能在腐败希瓦氏菌应对胁迫时发挥维持细胞膜完整性和透过性的功能。

2.6 群体感应信号分子诱导lolB基因的表达情况及分子对接分析

导致水产品腐败的革兰氏阴性菌主要利用信号分子N-酰基高丝氨酸内酯(N-acyl-homoserine lactones,AHLs)介导群体感应系统,AHLs是由N-酰基高丝氨酸内酯环和包含4～18个碳的酰基侧链构成[26],自然界发现的最小的AHLs为丁基高丝氨酸内酯(butyl-homoserine lactone,C4-HSL)[27]。相关研究报道,希瓦氏菌很少产信号分子但会窃听环境中的信号分子来加速致腐进程[28],其中外源信号分子C6-HSL、C12-HSL和C14-HSL会诱导希瓦氏菌生物膜形成量增加[29]。群体感应信号分子对lolB基因表达情况的影响及作用方式如图5。由图5(a)可知,与对照组相比,外源信号分子C6-HSL、C12-HSL、C14-HSL的添加均诱导了lolB基因的表达。但lolB基因对C12-HSL的响应时间最短,1 h的表达量约是对照组的6倍;对C6-HSL响应最强烈,5 h时约是0 h的17倍、对照组的2倍。C14-HSL对lolB的诱导表达模式与对照组相似。通过分子对接技术分析信号分子与LolB作用方式如图5(b)、(c)。结果显示,唯有C6-HSL和LolB蛋白对接成功,对接能为-20.895 5 kcal/mol,和LolB蛋白的Leu51氨基酸残基通过π-烷基相互作用对接,表明Leu51残基可能是希瓦氏菌LolB蛋白的关键氨基酸,信号分子或群体感应系统可能在转录水平或蛋白质水平影响腐败希瓦氏菌LolB蛋白的功能。

3 结 论

LolB在腐败希瓦氏菌不同菌株间序列一致性较高,为亲水性酸性蛋白,不含跨膜结构,但含有显著信号肽切割位点,为脂锚定蛋白,含有显著的磷酸化位点。LolB是LolA超家族的成员之一,其蛋白质的三级结构是典型的桶状结构,含明显的配体结合活性位点。LolB与LolA等10个蛋白质存在相互作用关系,这些蛋白质除了参与脂蛋白转运和跨膜释放外,还与维持细胞壁稳定性和增强细胞膜刚性等功能有关。lolB基因可能在腐败希瓦氏菌应对饥饿、乙醇、渗透压及高温胁迫时发挥重要作用。群体感应信号分子可以诱导lolB的表达,推测其可能位于群体感应系统的下游调控通路中。在后续研究中可通过lolB基因敲除、过表达等手段进一步研究lolB基因的功能,分析其所在的基因调控通路。本研究旨在为进一步探究基于LolB的腐败希瓦氏菌生存致腐机制和开发或寻找LolB靶向抑制剂提供一定理论参考。

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Structure, Function and Gene Expression Analysis of Outer Membrane Lipoprotein Receptor in Shewanella putrefaciensfrom Aquatic Products

ZHOU Wenxuan, LI Qiuying*, CUI Fangchao, TAN Xiqian, SUN Tong, LI Jianrong*

(College of Food Science and Engineering/National &Local Joint Engineering Research Center of Storage, Processing and Safety Control Technology for Fresh Agricultural and Aquatic Products, Bohai University, Jinzhou 121013, China)

Abstract: Outer membrane lipoprotein receptor LolB is a key factor for gram-negative bacteria to transport lipoprotein. Bioinformatics methods and real-time fluorescence quantitative PCR were used to investigate the physicochemical properties, structure and function of LolB in Shewanella putrefaciensfrom aquatic products and its gene expression changes under different environment. The results showed that lolBgene had high sequence conservation property and LolB was a stable hydrophilic protein with a molecular weight of about 23 ku. LolB contained signal peptides and 21 phosphorylation sites, but had no transmembrane structure. The secondary structure of LolB was mainly random coil and β -folding, and the tertiary structure was β barrel-shaped. LolB was predicted to interact with a variety of proteins, including LolA of lipoprotein transport system, LolC and LolE family transmembrane proteins, ABC transport-related proteins, catalytic cracking glycotransferase involved in increasing cell membrane rigidity and maintaining cytoplasmic stability. Fluorescence quantitative PCR results showed that the expression of lolBgene was up-regulated when the bacteria were subjected to a certain degree of stravation, ethanol, osmotic pressure and high temperature stress, which presented a trend of up-regulation and then down-regulation with the increase of stress degree. At 4 ℃, lolBgene expression pattern was similar to that of the control group. Exogenous signal molecules C6-HSL induced high expression of lolBand could interact with Leu51 residue of LolB protein through π-alkyls. It was hoped that the results could provided a preliminary analysis of the function of LolB in S. putrefaciensand offered a new idea for the targeted inhibition of S. putrefaciensin aquatic products.

Keywords: Shewanella putrefaciens; lipoprotein outer membrane localization system; outer membrane lipoprotein receptor LolB; real-time fluorescence quantitative PCR; bioinformatic analysis; environmental stress

中图分类号: TS201.3; TS254.4

文献标志码: A

doi:10.12301/spxb202200376

文章编号:2095-6002(2023)02-0131-10

引用格式:周文萱,李秋莹,崔方超,等.水产品腐败希瓦氏菌外膜脂蛋白受体结构、功能及基因表达分析[J]. 食品科学技术学报,2023,41(2):131-140.

ZHOU Wenxuan, LI Qiuying, CUI Fangchao, et al. Structure, function and gene expression analysis of outer membrane lipoprotein receptor in Shewanella putrefaciensfrom aquatic products[J]. Journal of Food Science and Technology, 2023,41(2):131-140.

收稿日期: 2022-04-10

基金项目: 辽宁省自然科学基金资助项目(2020-MS-288)。

Foundation: Natural Science Foundation Program of Liaoning Province (2020-MS-288).

第一作者: 周文萱,女,硕士研究生,研究方向为水产品腐败菌致腐机制。

*通信作者:

李秋莹,女,讲师,博士,主要从事水产品保鲜及质量安全控制方面的研究;

励建荣,男,教授,博士,博士生导师,主要从事水产品和果蔬贮藏加工及质量安全控制方面的研究。

(责任编辑:张逸群)