食物过敏严重危害人群的健康,探究有效的防治食物过敏的方法一直是过敏性疾病研究的热点,目前主要有避免疗法、食品加工处理法和特异性免疫疗法等[1]。避免疗法是指避免摄入含有食物过敏原的食物;食品加工处理法是采用某些加工方法,如热处理、辐照或糖基化,使食物过敏原的结构发生变化或失去活性,但这些方法不能完全消除其致敏性;特异性免疫疗法依据给药途径,分为皮下免疫治疗(subcutaneous immunotherapy, SCIT)、口服免疫治疗(oral immunotherapy, OIT)、舌下免疫治疗(sublingual immunotherapy, SLIT),其中在食物过敏中OIT方面的研究较多[2]。特异性免疫疗法的治疗原理都是通过诱导机体相关淋巴组织,刺激调节性T细胞(Treg)增殖,抑制免疫应答,增强机体对过敏原产生免疫耐受[3]。据有关牛奶OIT方面的研究,其脱敏效果达到37%～57%[4-6]。而口服耐受性是一个抗原依赖过程,因此食用过敏原是不可避免的。食用完整食物过敏原蛋白的OIT在控制花生和牛奶等主要食物过敏方面取得了重要进展[7-8]。然而这种治疗也可能导致过敏者产生严重的过敏反应,而不是耐受性[2]。因为完整的过敏原同时含有T细胞表位和B细胞表位,后者被认为是OIT副作用的致病因素[9]。为了避免发生潜在的过敏症状,可以食用含有T细胞表位的过敏原或其特定序列衍生肽,当肠道中的抗原呈递细胞接受时,这些表位可能会涉及耐受性的发生[10]。

β-乳球蛋白(β-lactoglobulin, β-LG)是牛乳中的主要过敏原,约占乳清蛋白质量的50%,占牛乳总蛋白的10%,并且约有82%的牛乳过敏患者对β-LG过敏[11]。绝大多数牛乳过敏反应属于IgE介导的Ⅰ型超敏反应,人体会在摄入牛乳后出现速发型(1 h内)或迟发型(1 h后)过敏症状。发生这种过敏反应的患者通常会出现一系列临床症状:大部分患者至少有2种器官系统会出现过敏症状,约50%～70%患者出现皮肤过敏症状,50%～60%患者出现胃肠道过敏症状以及20%～30%患者出现呼吸道过敏症状[12]。关于β-LG的B细胞表位研究报道较多,而β-LG的T细胞表位改善过敏患者口服免疫耐受的机制有待研究。因此制备和鉴定具有T细胞表位和口服免疫耐受作用的β-LG水解物对于保障牛乳过敏人群的安全饮食具有重要意义。

本研究以牛乳主要过敏原β-LG为研究对象,通过生物信息学预测β-LG的T细胞表位,并通过质谱鉴定β-LG水解物多肽氨基酸序列。体外T细胞增殖实验和体内口服耐受性实验筛选能释放β-LG T细胞表位的蛋白酶,制备富含T细胞表位和口服免疫治疗作用的β-LG水解物。研究旨在揭示β-LG的T细胞表位增强口服免疫耐受性的作用机制,以期为新型抗过敏乳基料的开发和临床治疗牛乳过敏提供参考数据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

β-LG、霍乱霉素,美国Sigma公司;L-亮氨酸、邻苯二甲醛,上海源叶生物技术公司;N-乙酰半胱氨酸,北京Biotopped公司;乙醇,美国Mreda公司;碱性蛋白酶(alcalase)、复合蛋白酶(protamex)、中性蛋白酶(neutrase)、木瓜蛋白酶(papain)、胰蛋白酶(trypsin),丹麦诺维信公司;蛋白酶(protease M),日本天野公司;60只3～4周龄SPF级雌性BALBc小鼠,北京维通利华公司;IL-4、IL-5、IL-13、IL-17、IFN-γ、组胺、几丁质酶-3样 1 (CHI-3L1)ELISA试剂盒,英国Abcam公司;MTT Assay试剂盒,北京百奥莱博科技有限公司。

1.2 仪器与设备

LAMBDA 750型紫外分光光度计,日本Hitachi公司;PHS- 3C型pH计,上海仪电科学仪器公司;SHZ- C型水浴恒温振荡器,上海龙跃仪器设备有限公司;SH- 2型磁力搅拌器,北京东方开物科学器材公司; Q Exactive HF- X型质谱仪,赛默飞科学仪器有限公司;3- 30K型低温高速离心机,美国Sigma公司;KHB ST- 360型酶标仪,上海科华实验系统公司;MDF- 382E型超低温冰箱,日本三洋公司。

1.3 实验方法

1.3.1 β-LG的T细胞表位预测

从GenBank中获取β-LG的氨基酸序列。通过免疫表位数据库IEDB(http:∥www.iedb.org/)和NetMHC(Ⅱ)/pan4.0数据集(https:∥services.healthtech.dtu.dk/service.php?NetMHCIIpan-4.0)预测T细胞表位。基于HLA-DRB1、HLA-DQB1等位基因,即DRB1*08:01、DRB1*08:02、DRB1*08:03、DRB1*08:04 、DRB1*08:09、DQB1*04:01、DQB1*04:02,预测β-LG可能的T细胞表位。结果中调整等级越小,则说明越可能为β-LG的T细胞表位。在NetMHC(Ⅱ)/pan4.0输入β-LG氨基酸序列获得预测结果,分数越高则越可能为β-LG的T细胞表位。

1.3.2 β-LG水解物的制备

将β-LG配制成质量浓度为30 mg/mL的水溶液,蛋白酶最适作用温度和pH值见表1。按β-LG质量,蛋白酶分别添加3 000 U/g,用1 mol/L的HCl或NaOH溶液调节反应体系的pH值至相应蛋白酶适宜水解pH值,水解时间为3 h。在蛋白水解过程中,需要保持反应体系的温度和pH值恒定,水解结束后需立即85 ℃水浴灭酶活10 min,一部分样品冷却至常温后放置-20 ℃冰箱中保存待测定水解度。一部分样品冷冻干燥后保存待质谱分析。

1.3.3 水解度的测定

利用OPA法测定酶解物的水解度[13]。将50 mmol/L的OPA甲醇溶液10 mL、50 mmol/L的N-乙酰半胱氨酸的水溶液10 mL、5 mL质量浓度为200 mg/mL的SDS和75 mL硼酸盐缓冲液(0.1 mol/L、pH值9.5)混合制备OPA试剂。OPA试剂避光保存,并在使用前避光持续搅拌60 min。取3.2 mL新鲜配制的OPA试剂于试管中,加入400 μL的β-LG水解物溶液或L-亮氨酸标准品,混合均匀。在室温下放置10 min后,使用紫外分光光度计在340 nm波长处测量样品或标准品的吸光值。

以L-亮氨酸为标准品绘制标准曲线。用电子天平准确称量0.327 9 g的L-亮氨酸,于100 mL容量瓶中用超纯水定容,再分别取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL上述容量瓶中溶液至6支25 mL棕色容量瓶中定容至25 mL。

β-LG游离氨基的总含量测定:盐酸水解β-LG后用氨基酸分析仪测定;参考GB5009.124—2016《食品安全国家标准 食品中氨基酸的测定》中方法进行测定。根据式(1)计算水解度(DH)。

(1)

式(1)中,c(Tx)为酶解产物的游离氨基浓度,μmol/mL;c(To)为未水解β-LG的游离氨基浓度,μmol/mL;c(NH2)为β-LG样品中游离氨基的浓度,μmol/mL。

1.3.4 β-LG水解物多肽的氨基酸序列分析及免疫耐受作用鉴定

使用Q Exactive HF- X型质谱仪和Nanospray Flex(ESI)离子源,设定离子喷雾电压为2.3 kV,离子传输管温度为320 ℃,质谱采用FULL SCAN采集模式,质谱全扫描范围m/z为300～1 700,一级质谱分辨率设为70 000,C-trap最大容量为1×106,C-trap最大注入时间为50 ms;选取全扫描中离子强度TOP 20的母离子使用高能碰撞裂解(HCD)方式破裂,进行二级质谱检测,二级质谱分辨率定为17 500,C-trap最大容量为2×105,C-trap最大注入时间为50 ms,肽段碎裂碰撞能量设为28%,阈强度设为2.0×104,动态排阻范围设为30 ms。质谱分析时,所用蛋白酶水解位点见表2。

通过质谱确定β-LG水解物中多肽的氨基酸序列后,与预测的T细胞表位进行比对,对部分或全部重复的多肽通过固相合成法合成[14]。通过T细胞增殖法鉴定合成多肽的免疫耐受性,参考Hou等[15]和Joost等[16]的方法,取6只β-LG致敏BALBc小鼠外周血T淋巴细胞,体外培养。用合成的多肽分别孵育细胞48 h,MTT法检测增殖细胞数,并计算其增殖指数(stimulation index, SI),即加入多肽引起T细胞增殖数量与未加多肽T细胞增殖数量的比值。SI≥2为阳性反应,即多肽具有免疫耐受作用,为T细胞表位肽。

1.3.5 β-LG水解物的口服耐受性实验

1.3.5.1 动物实验方案

BALBc小鼠在SPF标准的动物房内适应性喂养3～4 d,其间自由摄食和饮水(不含过敏原),环境温度(23±3)℃、湿度40%～70%、昼夜12 h。小鼠随机分成6组,每组10只。阴性对照(NC)组和阳性对照(PC)组在0、7、14、21、28 d,各灌胃1次,灌胃剂量按体质量分别为10 μg/kg霍乱毒素(cholera toxin, CT,溶于0.3 mL生理盐水)或5 mg/kg β-LG和10 μg/kg CT,第35天用5～10倍剂量生理盐水或β-LG激发(不含CT)。

预防组分别为Trypsin水解物处理(TH)组、Papain水解物处理(PH)组、Protamex水解物处理(PM)组和Neutrase水解物处理(NPH)组。小鼠适应性喂养3～4 d后,致敏前7天每天分别灌胃4种蛋白酶的水解物,每次灌胃20 mg(溶于生理盐水),连续灌胃7 d,之后0、7、14、21、28、35 d按照PC组的致敏激发方式灌胃β-LG。

实验过程中,每周观察小鼠的生长状况(包括小鼠的体貌特征、饮食以及精神状态等)。大剂量刺激后,观察各组动物的状态,连续观察45 min左右并进行致敏症状评分。评分标准:0分,没有异常症状;1分,抓鼻子或挠头;2分,眼睛或嘴巴周围浮肿,毛发竖立,活动减少或呼吸频率增加;3分,哮喘,呼吸困难;4分,抽搐或静止;5分,死亡。每组得分为各组小鼠只数与症状对应分数乘积之和。

大剂量激发后,小鼠眼部内眦静脉采血,加入含有或不含有EDTAK2的离心管中,轻轻混匀,4 ℃静置过夜,在4 ℃以5 000 r/min离心10 min,分离出血清或血浆。血清分装存于-20 ℃,用于特异性抗体、细胞因子、CHI-3L1和组胺的测定。血浆用于测定脾脏细胞亚群水平。

1.3.5.2 特异性抗体IgE、IgG1、IgG2a的测定

特异性抗体IgE是表征过敏模型是否成功的重要指标,采用ELISA方法并在文献[17]的基础上进行完善,测定特异性抗体IgE、IgG1、IgG2a。

1)抗原包被。以β-LG作为包被抗原,用pH值为9.6的50 mmol/L碳酸盐缓冲溶液将β-LG稀释至质量浓度为10 μg/mL,以100 μL/孔加入酶标板中,4 ℃冷藏过夜。

2)洗涤。次日倾去酶标板孔内的液体,用250 μL/孔的PBST(pH值为7.5、0.02 mol/L磷酸盐缓冲液、含有体积分数为0.1%的吐温-20)恒温震荡洗板3次,每次3 min,甩净洗涤液,在吸水纸上拍打数次,至孔内无明显液滴。

3)封闭。每孔加封闭液(含质量浓度为10 mg/mL的牛血清白蛋白的PBST溶液)150 μL进行封闭,37 ℃恒温培育1 h后去除,用250 μL/孔的PBST洗板3次,每次3 min,甩净洗涤液,在吸水纸上拍打数次,至孔内无明显液滴。

4)一抗孵育。加入小鼠血清,用抗体稀释液(含质量浓度10 mg/mL的牛血清白蛋白的PBST溶液)以体积比1∶1 000稀释血清,每孔加入100 μL,37 ℃恒温培育2 h。用PBST洗板6次,250 μL/孔,每次3 min,甩净洗涤液,在吸水纸上拍打数次,至孔内无明显液滴。

5)二抗孵育。用抗体稀释液将HRP-羊抗鼠IgE或HRP-羊抗鼠IgG1或HRP-羊抗鼠IgG2a按体积比1∶4 000稀释,以100 μL/孔加入孔内,加盖37 ℃恒温培育1.5 h。用250 μL/孔的PBST洗板6次,每次3 min,甩净洗涤液,在吸水纸上拍打数次,至孔内无明显液滴。

6)显色。加TMB溶液(0.1 mol/L、pH值为6.0的磷酸盐缓冲液10 mL,质量浓度为6 mg/mL的TMB应用液100 μL,体积分数为30%的过氧化氢15 μL配置而成)100 μL/孔,常温避光反应20 min,显示蓝色。

7)终止反应。加2 mol/L的硫酸50 μL/孔终止反应,颜色由蓝变黄。

8)测定。30 min内在450 nm波长处测定吸光值。

1.3.5.3 Th1和Th3细胞因子的测定

IL-4、IL-5、IL-13、IL-17和IFN-γ分别使用ELISA试剂盒测定。

1.3.5.4 组胺的测定

使用组胺ELISA试剂盒测定。

1.3.5.5 CHI-3L1含量测定

使用CHI-3L1 ELISA试剂盒测定。

1.3.5.6 细胞亚群的测定

根据参考文献[18]进行细胞亚群的测定。脾淋巴细胞的获取:在大剂量刺激之后,将小鼠颈椎脱臼处死,置于体积分数为75%的酒精中浸泡2 min,转移入超净台剖开腹腔,取脾脏组织,剪碎并置于200目的滤网研磨,向组织上滴加2 mL的RPMI 1640无血清培养基,至组织内绝大部分细胞被分离。将细胞收集于15 mL离心管中,以500 g离心5 min,弃掉上清后,在脾细胞沉淀中加入2 mL红细胞裂解液,轻轻吹打混匀,室温裂解2 min至红细胞完全破碎,500 g离心,弃掉上清,加入2 mL的RPMI 1640无血清培养基重悬细胞沉淀,500 g离心5 min洗涤1次,弃上清,加入1 mL的RPMI 1640无血清培养基重悬,取出15 μL进行细胞计数。

取50 μL细胞悬液,加入FITC-anti mouse CD4单抗和PE-anti mouse CD25单抗或其同型对照抗体,避光孵育30 min后,使用流式缓冲液洗涤1次,加入破膜剂孵育30 min后离心。加入APC-anti mouse Foxp3单抗,孵育30 min后洗涤1次,加入100 μL流式缓冲液重悬细胞,使用流式细胞仪测定Treg细胞(CD25+Foxp3+)分群表达水平。

取50 μL细胞悬液,加入PE-anti mouse CD69单抗和FITC anti-mouse CD183/CXCR3单抗或其同型对照单抗,孵育30 min后,使用流式细胞仪测定效应Th1(CD69+CD183/CXCR3+)细胞分群表达水平。

取50 μL细胞悬液,加入FITC-anti mouse CD69单抗和PE-anti mouseT1/ST2单抗或其同型对照,流式细胞仪检测效应Th3(CD69+T1/ST2+)细胞分群表达水平。

1.4 数据处理

实验数据采用Microsoft Excel 2003和SPSS 13.0进行统计分析,结果以平均值±标准差(SD)表示。各组数据进行方差分析(One-way ANOVA),比较均值使用Duncan’s极差检验,P<0.05认为存在显著性差异。

2 结果与分析

2.1 β-LG的T细胞表位预测结果

利用IEDB得出β-LG的T细胞表位(表3),其主要集中在3段氨基酸序列上,即AA26～46、AA110～128、AA154～173。NetMHC(Ⅱ)/pan4.0预测的β-LG可能的T细胞表位见表4,由表4可知β-LG可能的T细胞表位集中在5段氨基酸序列上,即AA13～29、AA32～46、AA55～69、AA83～108、AA160～174。结合二者的预测结果,可以得出β-LG可能的T细胞表位区可能在6段氨基酸序列,分别为AA13～29、AA26～46、AA55～69、AA83～108、AA110～128、AA154～174。

2.2 蛋白酶酶解β-LG水解物的水解度

采用OPA法测定各蛋白酶酶解β-LG水解物的水解度,结果如图1。由图1可知,Protease M和Alcalase酶解β-LG的水解物水解度较高,分别为45.66%和44.81%, Neutrase和Protamex酶解β-LG的水解物水解度较低,分别为10.19%和13.44%,Papain酶解β-LG的水解物水解度为34.95%,Trypsin酶解β-LG的水解物水解度为20.61%。

2.3 不同β-LG水解物多肽氨基酸序列分析及免疫耐受作用鉴定

不同β-LG水解物肽段AA序列见表5。由表5可知,6种蛋白酶中,Trypsin酶解β-LG的水解物10条肽段与预测的T细胞表位部分或全部重叠,Protamex酶解β-LG的水解物5条肽段与预测表位部分或全部重叠,Neutrase酶解β-LG的水解物4条肽段与预测表位部分重叠,Papain酶解β-LG的水解物1条肽段与预测表位部分重叠,而Alcalase和Protease M酶解β-LG的水解物在表2水解位点下未检测出多肽序列。与预测T细胞表位部分或全部重复的多肽通过T细胞增殖实验鉴定免疫耐受作用,结果见表5。由表5可知除了多肽IRLS,其他多肽都具有免疫耐受性。附上DEALEKFDKALKALPMHIRLS多肽的一级质谱图,见图2。所以选取Trypsin、Protamex、Neutrase、Papain 4种蛋白酶酶解β-LG的水解物进行口服免疫耐受实验。

2.4 不同β-LG水解物的口服耐受性

2.4.1 实验小鼠的临床症状

小鼠临床症状见表6。由表6可知,NC组10只小鼠都没有过敏症状;PC组6只小鼠有呼吸急促、嘴巴和尾巴周围出现皮疹、呼吸频率加快的症状,3只小鼠刺激后静止不活动,产生颤抖和肌肉收缩的症状,1只小鼠死亡;TH组9只小鼠无症状,1只小鼠抓挠鼻子和嘴巴,产生较轻微过敏现象; PM组8只小鼠无症状,2只小鼠抓挠鼻子和嘴巴,产生较轻微过敏现象;PH组8只小鼠无症状,2只小鼠抓挠鼻子和嘴巴,产生较轻微过敏现象; NPH组2只小鼠眼睛和嘴巴周围肿胀、活动减少、呼吸频率高,6只小鼠产生呼吸急促、嘴巴和尾巴周围出现皮疹、呼吸频率加快,2只小鼠在刺激后无活动,产生颤抖和肌肉收缩的症状。

2.4.2 小鼠血清特异性抗体水平

小鼠血清特异性抗体IgE、IgG1、IgG2a水平测定结果见图3。由图3可知,PC组、NPH组小鼠血清中特异性抗体IgE、IgG1、IgG2a水平均显著高于NC组(P<0.05),而TH组、PM组、PH组与NC组均无显著差异(P>0.05)。这说明Trypsin、Protamex、Papain酶解β-LG的水解物显著地改善了小鼠的致敏反应,连续灌胃7 d使小鼠产生了口服耐受性,而中性蛋白酶水解物未显著降低小鼠的致敏反应。

2.4.3 小鼠血清Th1相关细胞因子水平

血清Th1相关细胞因子水平结果见图4。由图4可知,TH组、PM组、PH组血清IFN-γ和IL-17水平均显著高于PC组(P<0.05),说明Trypsin、Protamex、Papain酶解β-LG水解物显著抑制了小鼠过敏的发生,具有免疫耐受作用。NPH组与NC组、PC组无显著性差异(P>0.05),则说明Neutrase酶解β-LG水解物未使小鼠发生免疫耐受作用。

2.4.4 小鼠血清Th3相关细胞因子水平

小鼠血清Th3相关细胞因子水平结果见图5。由图5可知,TH组、PM组、PH组血清IL-4、IL-5、IL-13水平均显著低于PC组(P<0.05),NPH组与PC组无显著差异(P>0.05)。说明Trypsin、Protamex、Papain酶解β-LG的水解物显著抑制了小鼠过敏的发生,Neutrase酶解β-LG水解物未使小鼠发生免疫耐受作用。

2.4.5 小鼠血清组胺水平

组胺存在于机体组织的肥大细胞或嗜碱性粒细胞中。当机体发生过敏反应时,这些细胞会释放大量组胺。血清组胺水平检测结果见图6。由图6可知,TH组、PM组、PH组3组小鼠的组胺水平与NC组小鼠无显著差异(P>0.05),与PC组小鼠有显著差异(P<0.05)。这说明Trypsin、Protamex、Papain酶解β-LG的水解物对过敏小鼠组胺的释放有抑制作用,成功增强了小鼠免疫耐受。但NPH组与PC组并无显著差异(P>0.05),说明Neutrase酶解β-LG的水解物没有成功提升小鼠免疫耐受性。

2.4.6 CHI-3L1测定结果

在过敏反应中,几丁质酶可以通过调节TGF-β的表达和Foxp3+Treg细胞的数量发挥作用,可以减轻过敏炎症。血清CHI-3L1水平检测结果见图7。由图7可知,TH组、PM组、PH组小鼠血清CHI-3L1水平与NC组无显著差异(P>0.05),但却显著低于PC组(P<0.05),这说明Trypsin、Protamex、Papain 3组的β-LG水解物对过敏小鼠血清CHI-3L1水平升高具有抑制作用,成功提升了小鼠免疫耐受性。但NPH组与PC组并无显著差异(P>0.05),说明Neutrase的β-LG水解物没有成功提高小鼠的免疫耐受性。

2.4.7 小鼠脾脏T淋巴细胞亚群变化

2.4.7.1 Th1细胞亚群水平

小鼠脾脏Th1细胞亚群水平见图8。 由图8可知,与NC组比较,PC组、NPH组小鼠脾脏Th1细胞亚群水平差异不显著,TH组、PH组和PM组小鼠脾脏Th1细胞亚群水平显著高于NC组,说明这3组小鼠脾脏的Th1细胞数量显著增加。

2.4.7.2 Th3细胞亚群水平

速发型食物过敏又称为Th3型过敏反应,小鼠脾脏Th3细胞亚群水平见图9。由图9可知,PC组小鼠产生了最强的Th3型免疫反应。PM组与NC组小鼠脾脏Th3细胞亚群水平差异不显著。TH组、PH组和NPH组显著高于NC组,但显著低于PC组。

2.4.7.3 小鼠脾脏Treg细胞亚群水平

小鼠脾脏Treg细胞亚群的水平检测结果见图10。由图10可知,与PC组致敏小鼠相比,TH组、PM组、PH组小鼠脾脏Treg细胞亚群水平显著增加,说明致敏前口服这3种蛋白酶的β-LG水解物可显著增加 Treg细胞(CD4+CD25+Foxp3+)的相对数量。PC组和NPH组小鼠Treg细胞数量没有显著增加。

3 讨 论

蛋白质水解产生的多肽在功能和生物活性上优于蛋白质本身[19]。已有研究发现,许多来自动物蛋白质的具有生物活性潜力的肽,其中大多数是从牛奶产品中分离或者水解牛奶蛋白质释放出来的[20]。酶促水解通常是在温和的条件下进行的反应,是最常见的制备口服耐受肽的方法[21]。酶具有很高的特异性,并且不会残留有机溶剂和有毒化学物质,使得酶水解蛋白质成为食品和制药行业生产活性肽的最优选方法。目前使用食品级蛋白酶制备活性肽是被认为最安全的方式,因此本研究采用酶法水解β-LG制备具有T细胞表位和口服耐受作用的多肽。

Joost等[16]的研究证明,含有T细胞表位的乳清蛋白水解物成功增强了小鼠的免疫耐受性,从而有助于预防牛乳β-LG过敏。Koko等[22]对AA42～56、AA62～76、AA139～154多肽的口服耐受性进行分析,研究结果表明:这3段肽段都成功地抑制了T细胞的增殖,并且AA139～154显著抑制了β-LG抗体的产生,即特异性IgE、IgG1抗体水平降低,并且AA139～154有效降低了Th3亚群水平。但是并非所有的T细胞表位肽都可以改善免疫耐受性,如Laura等[23]发现,T细胞表位肽AA92～100、AA91～108并没有显示出牛乳β-LG过敏耐受性。本研究先鉴定β-LG水解物中多肽的氨基酸序列,通过体外实验鉴定具有T细胞表位的多肽的免疫耐受活性,通过体内实验筛选出具有口服免疫耐受性的β-LG水解物。

食物过敏机制主要是由食物过敏原刺激CD4+T细胞,使CD4+T细胞主要分化为Th3细胞。Th3细胞产生细胞因子IL-4、IL-5、IL-13,这些细胞因子诱导B细胞产生抗原特异性IgE抗体。特异性IgE抗体与肥大细胞或嗜碱性粒细胞结合,刺激肥大细胞或嗜碱性粒细胞脱颗粒,并释放组胺,发生过敏症状[24]。另外,在食物过敏反应中,CHI-3L1通过蛋白激酶B磷酸化在Th3细胞参与的有关炎症中起主要作用[25]。另外,Th1细胞分泌的细胞因子有IFN-γ和IL-17,可以抑制Th3细胞的分化,减轻过敏症状[26]。诱导过敏原特异性IgG1产生是过敏性Th3反应的标志之一,该反应有助于Th3细胞因子产生[27-28]。目前已有研究证实,IL-4、IL-5的表达水平较高是婴幼儿患过敏性疾病的信号[29]。活化的Th1细胞、CD8+T细胞可产生IFN-γ,促进未分化的T细胞向Th1细胞分化,并抑制Th3细胞增殖[16]。研究数据显示,Treg细胞与过敏耐受性相关,口服耐受诱导很可能是由于抗原特异性Th3细胞的缺失以及产生的CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞及细胞因子TGF-β、IL-10的主动抑制所致[14,30]。本研究中Trypsin、Papain和Protamex酶解β-LG的水解物诱导小鼠CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞数量显著增加,部分验证了前人的研究结论。本研究测定Th1细胞相关因子IL-17、IFN-γ和Th3相关因子IL-4、IL-5、IL-13及与过敏症状相关的组胺、CHI-3L1、特异性抗体(IgE、IgG1、IgG2a)来判断小鼠是产生了β-LG过敏还是β-LG耐受性。研究结果表明,Trypsin、Protamex、Papain酶解β-LG的水解物使小鼠产生了口服耐受性,尤其Protamex、Papain水解物是首次发现;而Neutrase水解物并没有使小鼠获得口服耐受性。关于Neutrase水解物没有使小鼠获得耐受性的原因,未来建议从小鼠肠道致敏机制开展研究。Joost等[16]的研究证明含有T细胞表位的乳清蛋白水解物可使小鼠获得口服耐受性。本研究发现,含有T细胞表位的水解物不一定会诱导口服耐受,需要通过动物实验验证,食物抗原诱导口服免疫耐受的机制有待深入研究。

4 结 论

β-LG的Trypsin酶解水解物含多段T细胞表位,展现出显著的口服耐受作用,未来可以用于预防过敏疾病的应用研究。研究发现,Papain、Protamex制备的β-LG水解物虽然含有较少的T细胞表位肽,但是却具有较好的口服耐受活性,建议进一步优化水解条件调控T细胞表位肽的释放。Neutrase水解物虽然含有较多的T细胞表位肽,但是没有提高小鼠的免疫耐受性,食物抗原诱导口服免疫耐受的机制有待深入研究。从T细胞表位预测,到水解物肽段序列分析、T细胞增殖实验,再到动物实验测定体液因子、细胞群分化水平,多方面逐步揭示了β-LG水解物中多肽诱导小鼠口服耐受性的作用机制。

参考文献:

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Preparation and Identification of β-Lactoglobulin Hydrolysates with T-Cell Oral Immunotolerance

TIAN Linghan1, ZHANG Qianqian1, CONG Yanjun1,*, YAN Wenjie2

(1.School of Food and Health/Beijing Advanced Innovation Center for Food Nutrition and Human Health/Beijing Research Center for Food Additive Engineering Technology, Beijing Technology and Business University, Beijing 100048, China;2.School of Biochemical Engineering, Beijing Union University, Beijing 100023, China )

Abstract: β- Lactoglobulin, one of major allergens in cow milk, was studied in this paper, and the T cell immune tolerance hydrolysates of β-lactoglobulin were prepared and identified to provide a theoretical basis for oral immunotherapy for patients with cow milk allergy. Firstly, the bioinformatics method was used to predict the possible β-lactoglobulin T-cell epitopes, and then, β-lactoglobulin was respectively hydrolyzed by six kinds of protease. The amino acid sequences of polypeptide of β-lactoglobulin hydrolysates were analyzed by mass spectrometry,and these peptides were synthesized by solid phase synthesis. The immune tolerance of the peptides were identified by T cell proliferation test. Therefore, trypsin, protamex, papain and neutrase hydrolysates were initially screened for T cell immune tolerance. Furthermore, the immune tolerance of β-lactoglobulin hydrolysates were evaluated by animal experiments. The levels of specific antibody (IgE, IgG1, IgG2a), Th1 cytokine (IFN-γ, IL-17), Th3 cytokine (IL-4, IL-5, IL-13), histamine, chitinase-3-like protein 1 in mice serum and the differentiation of mice spleen cell subsets were measured in vivo. The results showed that trypsin, protamex and papain hydrolysates had oral tolerance, among which protamex and papain hydrolysates had been reported innovatively. Although neutrase protease hydrolysates contained T cell epitopes, they were still allergenic. Therefore, the hydrolysates containing T cell epitopes did not necessarily have oral immune tolerance and need to be verified in vivo. The conclusion of this study could provide an important theoretical basis for the development of new anti-allergy milk-based materials and clinical treatment of milk allergy.

Keywords: cow’s milk allergy; β-lactoglobulin; polypeptide; oral tolerance; T cell epitope

中图分类号: TS252.1

文献标志码: A

doi:10.12301/spxb202200320

文章编号:2095-6002(2023)02-0057-13

引用格式:田岭含, 张倩倩, 丛艳君, 等. 具有T细胞口服免疫耐受作用的β-乳球蛋白水解物的制备及鉴定[J]. 食品科学技术学报,2023,41(2):57-69.

TIAN Linghan, ZHANG Qianqian, CONG Yanjun, et al. Preparation and identification of β-lactoglobulin hydrolysates with T-cell oral immunotolerance[J]. Journal of Food Science and Technology, 2023,41(2):57-69.

收稿日期: 2022-03-20

基金项目: 国家重点研发计划项目子课题(2019YFC1605002); 国家自然科学基金资助项目(31872886)。

Foundation: State Key Development Program of China (2019YFC1605002); National Natural Science Foundation of China (31872886).

第一作者: 田岭含,女,硕士研究生,研究方向为食物过敏原结构和功能。

*通信作者: 丛艳君,女,教授,博士,主要从事食物过敏原结构和功能方面的研究。

(责任编辑:郝一铭)