硒是一种人体必需的微量元素，因其具有清除细胞杂质、抗氧化、参与谷胱甘肽过氧化酶合成等特性而具有抗衰老、抗干细胞坏死、提高免疫力和抗癌变等功效，被誉为“抗癌之王”、“生命的火种”和“长寿元素”[1]。但是，硒元素的生物利用度、有效性、毒性以及代谢规律不仅与其总量有关，更是与其存在形态密切相关[2-3]。硒形态一般分为单质硒、无机硒和有机硒。其中，单质硒几乎无法被人体吸收；来源于金属矿藏副产品的亚硒酸盐和硒酸盐是无机硒常见的两种形式，无法被生物有效的吸收和利用，因而被严格地限制用量[4]。而有机硒通常经生物转化而来，有利于人体吸收利用，具有较强的生物活性且安全无副作用[5]，典型的有机硒包括硒代氨基酸(硒代蛋氨酸、硒代胱氨酸)、硒蛋白、甲基硒化物、硒核酸和硒多糖等。因此，单以硒总含量无法准确评价产品质量，且存在一定的安全隐患[6]，准确的定性定量不同形态的硒元素显得十分重要。尤其对供给特殊人群的特膳食品的质量监管和保障消费者健康安全具有重要意义。

目前，对富硒食品中硒元素的研究大多集中在总量测定[7-9]，对其不同形态的检测技术研究还相对较少。早期的硒形态分析，多通过预处理过程实现硒形态的初步分离，通过测定不同样液中硒元素的总量并结合差量法计算出有机硒、无机硒或部分硒形态的含量[6，10-13]。近年来随着仪器联用技术的快速发展，食品中硒形态的分析方法包括毛细管电泳色谱- 电感耦合等离子体质谱法(capillary electrophoresis-inductively coupled plasma mass spectrometry，CE-ICP-MS)[14]、高效液相色谱- 氢化物发生原子荧光光谱法(high performance liquid chromatography-hydride generation-atomic fluorescence spectrometry，HPLC-HG-AFS)[15]、高效液相色谱- 电感耦合等离子体质谱法(high performance liquid chromatography-inductively coupled plasma mass spectrometry，HPLC-ICP-MS)[16-17]等成为了研究热点。其中，HPLC-HG-AFS具有仪器普及率高、分析成本低等特点，且灵敏度与电感耦合等离子体质谱相当[2]，目前已广泛应用于砷、汞、硒等元素的分析。然而，食品等样品由于基质较为复杂，干扰因素较多，且干扰物质难以去除，因此很难准确测定其中多形态硒含量。

本研究拟通过优化条件参数，建立一种HPLC-HG-AFS测定食品中硒酸根、硒代胱氨酸、甲基硒代半胱氨酸和硒代蛋氨酸的分离检测技术，并以富硒酵母作为样品基质进行方法验证。另外，用本方法对4种市售富硒食品(富硒蛋白粉、富硒大米、富硒香菇和富硒酵母)中的4种硒形态进行了检测，为相关富硒食品的硒形态评价和质量控制提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

硒酸根[Se(VI)]、硒代蛋氨酸(SeMet)，分析纯，中国计量科学研究院；硒代胱氨酸(SeCys2)，分析纯，国家标准物质中心；甲基硒代半胱氨酸(SeMeCys)，分析纯，美国Sigma-Aldrich公司；胰蛋白酶，来源于牛胰腺，活力值1.0×104 U/mg，国家标准物质中心；蛋白酶XIV，来源于灰色链霉菌，活力值 3.5 U/mg，美国Sigma-Aldrich公司；甲醇，色谱纯，美国Thermofisher公司；磷酸氢二铵，分析纯，天津市华东试剂厂；硼氢化钾，分析纯，天津福晨化学试剂有限公司；氢氧化钠，分析纯，北京化工厂；盐酸，优级纯，天津市津科精细化工研究所；三羟甲基氨基甲烷，分析纯，天津市华东试剂厂；三氟乙酸，分析纯，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；甲酸，分析纯，西陇科学股份有限公司；碘化钾，分析纯，西陇科学股份有限公司。

富硒蛋白粉、富硒大米、富硒香菇和富硒酵母均为市售。

1.2 仪器与设备

LC- 3000型原子荧光形态分析仪，北京海光仪器有限公司；Coolinics CTR- 240型恒温水浴锅，日本Hitachi公司；Vortex- Genie 2型涡旋混合器，美国Scientific Industries公司；Millipore- Q型超纯水净化仪，美国Millipore-Q公司；SB25- 12DTD型超声波清洗机，宁波新芝生物科技股份有限公司；Velocity 18R型离心机，澳大利亚Dynamica公司。

1.3 标准曲线的建立

分别准确称取适量硒酸根、硒代胱氨酸、甲基硒代半胱氨酸、硒代蛋氨酸，用水溶解并定容，配制成100 mg/L的标准储备液，4 ℃储存；使用时，用水稀释并定容，配制成系列浓度的混合标准工作液，绘制标准曲线。

1.4 样品预处理

将样品粉碎研磨，混匀；准确称取1.0 g试样于250 mL容量瓶中，加入200 mL Tris缓冲液(0.1 mol/L，pH=10)，漩涡混匀，超声提取30 min；加入0.2 g蛋白酶和0.2 g胰蛋白酶，旋涡混匀，60 ℃水浴下酶解4 h，酶解过程中将容量瓶取出涡旋混匀数次；酶解后水定容，取20 mL酶解液于塑料离心管中，4 000 r/min离心10 min；取1.0 mL上清液，过0.22 μm滤膜，供HPLC-HG-AFS分析，外标法定量。

1.5 仪器分析

1.5.1 高效液相色谱分析条件

Hamilton PRP-X100 (250 mm×4.1 mm×10 μm)色谱柱；流动相为V(20 mmol/L磷酸氢二胺水溶液，pH=6.0)∶V(甲醇)=98∶2，洗脱15 min；进样量为100 μL；柱温为室温。

1.5.2 氢化物发生原子荧光光谱分析条件

氢化物发生器条件。还原剂为20 mmol/L 硼氢化钾水溶液，含w=0.5%氢氧化钾和w=0.1%碘化钾，流速为4.0 mL/min；载液为φ=7%盐酸水溶液，流速为6.0 mL/min。

原子荧光检测器条件。原子化器温度为200 ℃；负高压为320 V；灯电流为100 mA；原子化器高度为8 mm；载气和屏蔽气为氩气；载气流速为500 mL/min；屏蔽气流速为700 mL/min。

2 结果与讨论

2.1 方法检出限分析

将4种硒形态混合标准工作液注入高效液相色谱- 氢化物发生原子荧光光谱，采集谱图见图1，相应的谱图信息和各硒形态的检出限见表1。由图1可知，硒酸根、硒代胱氨酸、甲基硒代半胱氨酸和硒代蛋氨酸在设定条件下峰形对称且充分分离。由表1可知，4种物质均在5～100 ng/mL的浓度范围内线性良好(R2>0.999)，且以3倍信噪比计，硒酸根与甲基硒代半胱氨酸的方法检出限为25 μg/kg，硒代胱氨酸与硒代蛋氨酸的方法检出限为50 μg/kg。

图1 4种硒形态标准品混合物的色谱
Fig.1 Chromatogram of mixed standards of
4 selenium speciations

表1 4种硒形态标准品混合物的方法检出限

Tab.1 Method detection limit of mixed standards of 4 selenium speciations

峰号化合物保留时间/min10ng/mL样品的峰面积方法检出限/(μg·kg-1)1硒酸根Se(VI)3.611859772252硒代胱氨酸SeCys24.52947424503甲基硒代半胱氨酸SeMeCys5.851045115254硒代蛋氨酸SeMet9.49101247750

2.2 预处理方法的优化

常见的预处理方法包括酸解法、缓冲盐提取法和酶解法等[18-19]。本研究需选择一种适用于有机硒和无机硒同时提取的预处理方式。其中，酸解法和缓冲盐提取法对无机硒的提取效果较好，但无法有效提取有机硒，且强酸的强还原能力易导致硒形态发生转变。酶解法的特异性较强，能够将硒代氨基酸从多肽链中分解下来，且反应条件温和，不易发生形态之间的转化[5，18]。因此，本研究以酶解法进行预处理，并对酶解温度进行考察。使用富硒大米在40、50、60、70 ℃分别酶解4 h，4种目标物的提取效率见图2，提取效率为各目标物的检测值(扣除本底)与加标量的百分比。结合4种硒形态化合物的提取效率，选用60 ℃为酶解温度。

图2 温度对提取率的影响
Fig.2 Effect of different temperature on
extraction efficiency

2.3 高效液相色谱条件的优化

4种物质的充分分离对于物质的定性定量是最为关键的。相关资料表明，反相C18柱适用于有机硒的分离，但对强极性的无机硒几乎无保留。因此选定兼具反相保留和离子交换能力的阴离子交换色谱柱用于无机硒和有机硒的同时分离检测。

图3 三氟乙酸- 磷酸氢二铵水溶液为流动相的
混合标准溶液高效液相色谱
Fig.3 Mixed standard HPLC spectrum of trifluoroacetic acid-diammonium hydrogen phosphate as mobile phase

以20 mmol/L磷酸氢二铵水溶液为流动相时，硒酸根、硒代胱氨酸与甲基硒代半胱氨酸的谱峰部分重叠且峰型较差。流动相条件的不同对于多物质的峰型、分离度等具有显著影响，包括pH值、有机相比例等。结合相关资料并优化pH，流动相pH为6.0时，4种硒化物的峰形明显改善，峰宽较窄且对称性好。以三氟乙酸- 磷酸氢二铵水溶液(pH=6.0)与甲酸- 磷酸氢二铵水溶液(pH=6.0)为流动相分别测试时，两种流动相的分离效果相似，但硒酸根、硒代胱氨酸和甲基硒代半胱氨酸的峰仍未完全分离，见图3。在流动相中加入一定比例甲醇，以V(20 mmol/L磷酸氢二胺水溶液，pH=6.0)∶V(甲醇)=98∶2的混合溶液为流动相时，4种硒形态化合物在15 min内基本实现基线分离(图1)。因此，选择V(20 mmol/L磷酸氢二胺水溶液，pH=6.0)∶V(甲醇)=98∶2的混合溶液为流动相。

2.4 氢化物发生原子荧光光谱条件的优化

在氢化物发生原子荧光光谱中，硼氢化钾既可以与硒反应生成气态的硒化氢，又可以与盐酸反应为原子荧光提供适量的氢气。本研究考察了10、20、30、40 mmol/L的硼氢化钾水溶液对硒元素分析的影响如图4。综合4种硒形态化合物的最优峰面积，选用20 mmol/L硼氢化钾水溶液为还原剂。

2.5 方法学验证

使用优化后的方法预先测得富硒酵母中硒酸根、硒代胱氨酸、硒代蛋氨酸的含量分别为1.90、3.08、13.53 mg/kg，甲基硒代半胱氨酸未检出。以此样品为基质进行标准物质加入实验，加标量分别为硒酸根1.63 μg和2.13 μg，硒代胱氨酸2.63 μg和3.50 μg，甲基硒代半胱氨酸0.3 μg和0.5 μg，硒代蛋氨酸11.5 μg和15.5 μg。样品加标回收率和RSD值，见表2。

图4 不同硼氢化钾浓度对氢化物发生的影响
Fig.4 Influence of different concentration of potassium
borohydride on hydride generation

表2 富硒酵母加标回收率
Tab.2 Standard recovery rate of selenium-rich yeast

样品序号化合物加标量/μg平均质量分数/(mg·kg-1)平均回收率/%RSD/%富硒酵母1硒酸根 Se(VI)1.633.4092.275.81硒代胱氨酸 SeCys22.635.3084.604.13甲基硒代半胱氨酸 SeMeCys0.500.2789.673.24硒代蛋氨酸 SeMet11.5022.8981.376.652硒酸根 Se(VI)2.133.8190.007.22硒代胱氨酸 SeCys23.506.3693.604.01甲基硒代半胱氨酸 SeMeCys1.250.4793.802.80硒代蛋氨酸 SeMet15.5026.4483.275.14

n=5。

结果显示，样品在两个浓度梯度的平均回收率在81.37%～93.80%，RSD为2.80%～7.22%，符合GB/T 27404—2008《实验室质量控制规范 食品理化检测》的要求。说明该方法具有较高的准确度和精密度。

2.6 4种市售食品样品的分析检测

本研究对市售的富硒蛋白粉、富硒大米、富硒香菇和富硒酵母样品进行了分析，分析结果见图5和表3。其中，甲基硒代半胱氨酸在4种样品中均未检出；硒酸根在4种样品均检出且富硒大米中仅检出硒酸根；富硒香菇和富硒酵母相比而言含有的硒元素形态更多。以上说明，此次研究使用的富硒大米不适合人体用来补充硒元素，而此次研究使用的富硒酵母和富硒香菇则可作为人体补充硒元素的良好来源。

图5 4种市售富硒食品的色谱
Fig.5 Chromatograms of 4 commercially available Se-enriched foods

3 结 论

本研究建立了一种食品中多形态硒的高效液相色谱- 氢化物发生原子荧光光谱法，适用于富硒蛋白粉、富硒大米、富硒香菇和富硒酵母中硒酸根、硒代胱氨酸、甲基硒代半胱氨酸和硒代蛋氨酸的检测。本方法具有灵敏度高、适应性广、设备便宜、价格低廉等优点，解决了食品基质较为复杂而产生的干扰问题，4种硒形态化合物在5～100 μg/kg线性良好(R2>0.999)，方法检出限可达到25～50 μg/kg，且具有较高的准确性和精密度，为食品中相关产品的硒形态评价和质量控制提供了方法和依据。

表3 实验样品硒含量
Tab.3 Selenium content of experimental samples mg/kg

样品硒酸根硒代胱氨酸甲基硒代半胱氨酸硒代蛋氨酸富硒蛋白粉4.152.55——富硒大米1.90———富硒香菇4.111.59—3.50富硒酵母1.903.08—13.53

“—”为未检出。

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Determination of Content of Polymorphic Selenium in Foods by HPLC-HG-AFS

FANG Yan1,2，WANG Bei1，GAO Junhai1,2 ，ZHANG Yali1

( 1.Pony Testing International Group Co Ltd, Beijing 100095, China；2.Pony Testing International Group Beijing Science and Technology Research Institute, Beijing 100095, China)

Abstract：A high performance liquid chromatography-hydride generation-atomic fluorescence spectrometry (HPLC-HG-AFS) for determination of selenium speciations (Se(VI), SeCys2, SeMeCys and SeMet) in Se-enriched foods (Se-enriched protein powder, Se-enriched rice, Se-enriched shiitake mushrooms and Se-enriched yeast, etc.) was developed in this study. Samples were extracted with Tris buffer and hydrolyzed by protease and trypsin, followed by separating on Hamilton PRP-X100 anion exchange column with a mobile phase consisting with V (20 mmol/L diamine hydrogen phosphate aqueous solution，pH=6.0)∶V (methanol)=98∶2. Four speciations of selenium were completely separated as achieving the linearity larger than 0.999, the method detection limit reached 25-50 μg/kg, and the average recovery rate was 81.37%-93.80% (RSD 2.80%-7.22%). This method was used to detect 4 kinds of selenium morphological compounds in 4 kinds of commercially available selenium-rich foods (Se-enriched protein powder, Se-enriched rice, Se-enriched shiitake mushrooms and Se-enriched yeast). The advantages of this method were simple pretreatment procedure, rapid determination, high accuracy and sensitivity, which provided a method and basis for the evaluation and quality control of selenium in food.

Keywords：Se; organic selenium; selenoprotein; methyl selenide; HPLC-HG-AFS

doi:10.3969/j.issn.2095-6002.2020.06.009

文章编号：2095-6002(2020)06-0069-07

引用格式：房艳，王贝，高俊海，等. 高效液相色谱- 氢化物发生原子荧光光谱法测定食品中多形态硒含量[J]. 食品科学技术学报，2020,38(6):69-75.

FANG Yan，WANG Bei，GAO Junhai，et al. Determination of content of polymorphic selenium in foods by HPLC-HG-AFS[J]. Journal of Food Science and Technology, 2020,38(6):69-75.

收稿日期：2019-07-26

基金项目：北京市工程实验室创新能力建设项目(京发改(审)[2017]184号)。

第一作者：房 艳，女，高级工程师，博士，主要从事食品、环境、药品分析方面的研究。

中图分类号：TS207.7

文献标志码：A

(责任编辑：李 宁)