便秘是一种常见的功能性胃肠疾病，可导致腹痛、厌食、痔疮和抑郁等疾病，在全球的发病率是14%[1-3]。目前，用于便秘的治疗方法主要包括药物和非药物治疗。药物的治疗效果有限，甚至会产生依赖作用，一旦停止使用，便秘往往会复发，而且会产生一些副作用，如头痛、腹痛、恶心、腹泻和心血管疾病等，会使治疗的周期延长[4]；非药物治疗主要是生活方式的改变，包括体育锻炼，调整饮食等[5]。

研究表明，益生菌可调节肠道菌群，产生大量短链脂肪酸，降低结肠的pH值和传输时间，从而促进肠道蠕动[6]。 服用益生菌已成为治疗便秘的有效方法，但是活菌型益生菌在使用中仍然存在一些问题，如在免疫缺陷患者等弱势人群使用时的不安全性[7],在胃肠道低pH值和蛋白酶丰富的环境中存活率低等[8]。灭活益生菌安全性高，没有菌量限制，可与抗生素合用，其产品易于储存和运输，具有较长的货架期。灭活益生菌在日本、美国、俄罗斯和德国等国家得到广泛研究和应用，我国对于益生菌的研究多限于活菌，在灭活菌及其制品方面的研究还比较少[9-10]。灭活益生菌功能性的研究主要集中于调节免疫[11]、缓解过敏[12]和调节肠道菌群[13]等，其是否具有缓解便秘的作用尚缺乏研究。

副干酪乳杆菌L9分离自健康人肠道，具有调节免疫[14-15],增加小鼠肠道短链脂肪酸[16]和调节人体肠道菌群等益生功能[17]，其灭活菌是否具有缓解便秘的功能尚待研究。本研究拟通过人群实验，评价灭活型常温副干酪乳杆菌L9酸奶对便秘人群症状的改善作用和调节肠道菌群的作用，为含有灭活型乳酸菌产品的开发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 菌种及试验样品

副干酪乳杆菌L9(简称L9)，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号为CGMCC No. 9800；常温酸奶和含灭活副干酪乳杆菌L9的常温酸奶(简称L9常温酸奶)样品(200 g/瓶)，由中国农业大学益生菌研究中心制备。

常温酸奶制备方法：7%白砂糖与93%生牛乳经过95 ℃，300 s杀菌后，添加嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌(1×106 CFU/mL)，43 ℃发酵5 h，80 ℃灭菌1 min，得到常温酸奶实验样品。

L9常温酸奶制备方法：7%白砂糖与93%生牛乳经过95 ℃，300 s杀菌后，添加嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌(1×106 CFU/mL)，并添加L9菌粉(1×108 CFU/g)，43 ℃发酵5 h，80 ℃灭菌1 min，得到L9常温酸奶实验样品。

1.2 受试对象

1.2.1 纳入标准

年龄18～65岁，每周排便3～4次，长期或间歇性便秘、大便不成形，排便次数不规律的受试者。

1.2.2 排除标准

1)主诉不清者，体质虚弱无法进行试验者，孕期及哺乳期、经期妇女。

2)30 d内进行过外科手术引起便秘症状发生者。

3)合并有心血管、肝、肾和造血系统等严重全身疾病患者，便秘困难并伴有疼痛者，或有其他伴随疾病正在治疗者。

4)不能经口进食者或不能按规定服用受试样品者。短期内服用与受试功能有关的物品，影响到结果的判断者。

5)长期服用或实验开始前15 d内服用抗生素类药物者。

1.3 试验设计

计划招募受试者60人，随机分成常温酸奶组和L9常温酸奶组，尽可能考虑到影响结果的主要因素如年龄、性别、日常饮食、便秘原因等，每个年龄段人数尽量保持均衡，以保证组内的可比性。经过7 d排空期后，采集受试者粪便样本，再连续饮用试验样品28 d，每天饮用常温酸奶或L9常温酸奶1瓶，饮用期结束后采集受试者粪便样本。试验期间，受试者每周填写肠道健康调查表，其中包括排便情况、不良反应等。试验期间不改变原来的饮食习惯，正常饮食。

1.4 观察及检测指标

1.4.1 观察指标

1)每日排便次数：受试者记录每日排便次数的变化。

2)排便状况：根据排便困难程度(腹痛或肛门烧灼感、下坠感、不适感，有否便频但排便困难而量少等症状)分为Ⅰ～Ⅳ级，统计积分值。

Ⅰ级(0分)：排便正常。

Ⅱ级(1分)：仅有下坠感、不适感。

Ⅲ级(2分)：下坠感、不适感明显，或有便频但排便困难而量少，较少出现腹痛或肛门烧灼感。

Ⅳ级(3分)：经常出现腹痛或肛门烧灼感，影响排便。

3)粪便性状：根据布里斯托(Bristol)粪便性状分类法将粪便性状分为Ⅰ～Ⅲ 级。

Ⅰ级(0分)：像香肠或蛇，平滑而且软；像香肠，但在它的表面有裂痕；软的团块，有明显的边缘(容易排出)。

Ⅱ级(1分)：香肠形状，但有团块；松散的块状，边缘粗糙，像泥浆状的粪便。

Ⅲ级(2分)：分离的硬团，像果核(不易排出)。

1.4.2 检测指标

1.4.2.1 粪便短链脂肪酸含量的检测

粪便短链脂肪酸提取：称取0.1～0.2 g粪便样品于1 mL含有庚酸(浓度为1 mmol/L)的乙醚溶液中，用均质机匀浆1 min，10 000 r/min离心2 min。转移上清液有内插管的进样瓶中进行气相色谱检测。

气相色谱检测：检测器为FID氢火焰离子检测器；色谱柱为60～80目(酸洗、硅烷化)不锈钢柱(25 m×0.320 mm)，涂渍填充10%FFAD和1% H3PO4；升温程序为80 ℃保持1 min，以10 ℃/min升至140 ℃，保持5 min，以25 ℃/min升至240 ℃，保持4 min；载气(N2)压力260 kPa；氮气流速为40 mL/min，氢气流速为30 mL/min，空气流速为400 mL/min；进样量1 μL；检测温度280 ℃。N2000色谱工作站收集信号并检测。使用外标法进行定量。

1.4.2.2 粪便肠道菌群的检测

肠道菌群多样性测序利用Illumina PE300测序平台，对16S rDNA进行高通量测序，测序工作由上海美吉生物医药科技有限公司完成；基于I-Sanger云平台(https:∥www.i-sanger.com/)进行生物信息学及数据统计分析。

1.5 数据处理

利用SPSS 20.0软件对结果进行统计分析。各项指标结果以“平均值±标准差”(mean±SD)表示。组内前后比较采用配对样本t检验，两组间样本的比较采用独立样本t检验，P<0.05视为显著性差异，具有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 受试者基本情况

招募受试者65人，有61人完成试验，受试者年龄、性别、体重等基本情况如表1，两组间无显著差异(P>0.05)，可比性较好。

表1 受试者饮用产品前一般情况

Tab.1 General condition of subjects before test

基本情况常温酸奶组(n=30人)L9常温酸奶组(n=31人)性别男(人数)67女(人数)2424年龄/岁49.10±12.3050.60±10.20年龄分布18-30岁(人数)3230～40岁(人数)5840～50岁(人数)8750～65岁(人数)1414体质量/kg62.60±9.8463.43±11.78

2.2 受试者排便情况

常温酸奶和L9常温酸奶对受试者排便情况的影响如表2。表2显示，饮用前，常温酸奶组与L9常温酸奶组的排便次数、排便状况积分和粪便性状积分没有显著差异，具有可比性。饮用28 d后，常温酸奶组的排便次数显著高于饮用前(P<0.05)，排便状况积分和粪便性状积分与饮用前相比没有显著差异；L9常温酸奶组的排便次数极显著高于饮用前(P<0.01)，粪便性状积分和排便状况积分极显著低于饮用前(P<0.01)；两组间相比，L9常温酸奶组的排便次数显著高于常温酸奶组(P<0.05)，排便状况积分和粪便性状积分极显著低于常温酸奶组(P<0.01)。研究结果表明，常温酸奶可显著增加受试者排便次数，添加灭活副干酪乳杆菌L9后，受试者排便次数、排便状况和粪便性状都有极显著改善，说明L9有利于提高排便次数，减少排便不适，形成软便，改善粪便的质量。

2.3 粪便短链脂肪酸含量变化

短链脂肪酸是肠道微生物发酵碳水化合物生成的主要次级代谢产物，包括乙酸、丙酸、丁酸[18],也是表征肠道菌群影响人体健康和生理机能的重要物质。饮用前后受试者粪便中短链脂肪酸含量的变化情况如图1。图1显示，饮用前，常温酸奶组和L9常温酸奶组的短链脂肪酸含量没有显著差异，具有可比性。饮用后与饮用前相比，常温酸奶组丙酸和总酸的含量显著增加(P<0.05)；L9常温酸奶组乙酸、丙酸、丁酸和总酸的含量极显著增加(P<0.01)。两组间相比，L9常温酸奶组丁酸含量极显著高于常温酸奶组(P<0.01)，丙酸和总酸含量显著高于常温酸奶组(P<0.05)。研究结果表明，常温酸奶和L9常温酸奶可以显著增加粪便中短链脂肪酸的含量，添加灭活副干酪乳杆菌L9可以极显著增加短链脂肪酸的含量，说明灭活副干酪乳杆菌L9有利于短链脂肪酸的生成。短链脂肪酸可刺激肠道神经系统，缩短肠道运输时间，从而缓解便秘[19]。

表2 受试者每周排便情况

Tab.2 Defecation condition of subjects per week

组别常温酸奶组L9常温酸奶组饮用前饮用后饮用前饮用后排便次数3.39±0.503.57±0.50*3.38±0.504.51±0.77**#排便状况积分0.64±0.600.61±0.560.67±0.500.30±0.60**##粪便性状积分0.76±0.710.61±0.550.77±0.760.29±0.53**##

*表示组内饮用后与饮用前相比具有显著差异(P<0.05)；**表示组内饮用后与饮用前相比具有极显著差异(P<0.01)；#表示饮用后两组间具有显著差异(P<0.05)；##表示饮用后两组间具有极显著差异(P<0.01)。

*表示组内饮用后与饮用前相比具有显著差异(P<0.05)；**表示组内饮用后与饮用前相比具有极显著差异(P<0.01)；#表示饮用后两组间具有显著差异(P<0.05)；##表示饮用后两组间具有极显著差异(P<0.01)。
图1 饮用前后短链脂肪酸的变化
Fig.1 Changes of short-chain fatty acids before and after intake of yogurt

2.4 肠道菌群的改变

2.4.1 群落结构组成 PCA分析

由群落结构组成PCA分析可知(如图2)，饮用前两组便秘人群的组间差异ANOSIM分析结果为R=0.007 4，P=0.298(如图2(a))，说明两组人群肠道菌群的整体结构没有差异，组间可比性好。常温酸奶组饮用后(CWd28)与饮用前(CWd0)相比，组间差异ANOSIM分析结果为R=0.197 8，P=0.001(如图2(b))，表明饮用常温酸奶可改变肠道菌群整体结构；L9常温酸奶组饮用后(L9CWd28)与饮用前(L9CWd0)相比，组间差异ANOSIM分析结果为R=0.230 8，P=0.001(如图2(c))，表明饮用L9常温酸奶改变菌群的整体结构；常温酸奶与L9常温酸奶组相比，组间差异ANOSIM分析结果为R=0.035 3，P=0.075(如图2(d))，显示两组间没有显著差异，说明灭活L9对肠道菌群的整体结构无显著影响。以上结果表明，常温酸奶和L9常温酸奶对肠道菌群的整体结构有显著影响，但是灭活L9对肠道菌群的整体结构无显著影响。

每个点代表每个人群样本，PCA分析基于bray_curtis距离算法。
图2 各组小鼠肠道菌群PCA分析
Fig.2 PCA of gut microbiota in each group

2.4.2 物种组间差异显著性检验分析

利用Student’s t检验方法对物种进行两组间差异显著性分析，结果如图3。图3显示，在丰度百分比大于1.0%的物种中，组内比较表明，饮用常温酸奶28 d(CWd28)后，人群粪便中Lachnospiraceae菌显著降低(P<0.01)，该菌与饮食引起的肥胖具有正相关性[20];饮用L9常温酸奶28 d(L9CWd28)后，人群粪便中[Eubacterium]_hallii_group显著增加(P<0.01)，该菌能够代谢膳食纤维，产生短链脂肪酸[21]。组间比较表明，饮用L9常温酸奶比饮用常温酸奶能显著增加肠道中Blautia(P<0.05)、Ruminococcus_2(P<0.05)和 [Eubacterium]_hallii_group(P<0.01)菌的丰度，Blautia为丁酸产生菌[13],Ruminococcus为短链脂肪酸产生菌[22]。综上可知，L9常温酸奶调节肠道菌群的能力优于普通常温酸奶，主要体现在其增加产短链脂肪酸的菌属。

图3 物种组间差异显著性分析
Fig.3 Significantly altered genera analyzed by Student’s t-test

3 结 论

本研究通过人群实验，评价了灭活型副干酪乳杆菌L9常温酸奶通过调节肠道菌群对便秘的缓解作用。测定了短链脂肪酸和肠道菌群，探讨了灭活副干酪乳杆菌L9缓解便秘的原因。结果显示，与饮用普通常温酸奶相比，饮用灭活型副干酪乳杆菌L9常温酸奶后，受试者排便次数显著增加(P<0.05)，排便状况和粪便性状评分极显著降低(P<0.01)；粪便中丁酸含量极显著增加(P<0.01)，丙酸和总酸含量显著增加(P<0.05)；并显著增加产短链脂肪酸的菌属，如Blautia、Ruminococcus_2和[Eubacterium]_hallii_group。研究结果表明，饮用灭活型副干酪乳杆菌L9常温酸奶更有利于提高排便次数，减少排便不适，形成软便，改善粪便的质量，并增加肠道中产短链脂肪酸的菌，因此实现润肠通便的作用。该研究旨在为灭活型副干酪乳杆菌L9在乳酸菌产品中的应用提供科学依据。

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Effect of Non-Viable Lactobacillus paracasei L9 in Normal Temperature Yogurt on Modulating Gut Microbiota and Relieving Constipation

WANG Ran1, LI Guihua2, WANG Pengjie1, LIU Li3, LIU Zhilin4, ZHANG Yan1，*

(1.Department of Nutrition and Health, China Agricultural University, Beijing 100083，China; 2.College of Food Science and Nutritional Engineering,China Agricultural University, Beijing 100083，China; 3.Heibei Technology Advanced Innovation Center for Livestock Food, Langfang 065201，China; 4.Beijing Heyiyuan Biotechnology Company Limited, Beijing 100089，China)

Abstract： In order to evaluate the effect of non-viable Lactobacillus paracasei L9 (L9) in normal temperature yogurt on relaxing constipation and modulating gut microbiota, sixty-one subjects with constipation were recruited and divided into two groups, drinking normal temperature yogurt or yogurt containing non-viable L9 for 28 days, respectively. Constipation-related symptoms, the content of short chain fat acids (SCFAs) and variation of gut microbiota were analyzed. Compared to the group drinking normal temperature yogurt, the results in group drinking yogurt with non-viable L9 were as follows: the defecation frequency was significantly increased (P<0.05), the defecation condition and consistency scores were remarkably reduced (P<0.01), the content of butyric acid was dramatically increased (P<0.01), propionic acid and total acid were significantly increased (P<0.05), and bacterial species producing SCFAs such as Blautia, Ruminococcus_2 and [Eubacterium]_hallii_group were significantly increased. The results indicated that normal temperature yogurt with non-viable L9 could help to relieve constipation and modulate gut microbiota, which might provide a theoretical basis for developing functional foods containing non-viable L9.

Keywords： non-viable; Lactobacillus paracasei L9; normal temperature yogurt; relieving constipation; gut microbiota

doi:10.3969/j.issn.2095-6002.2020.03.012

文章编号：2095-6002(2020)03-0095-07

引用格式：王然，李桂花，王鹏杰，等. 灭活型副干酪乳杆菌L9常温酸奶调节肠道菌群缓解便秘作用研究[J]. 食品科学技术学报，2020,38(3):95-101.

WANG Ran, LI Guihua, WANG Pengjie, et al. Effect of non-viable Lactobacillus paracasei L9 in normal temperature yogurt on modulating gut microbiota and relieving constipation[J]. Journal of Food Science and Technology, 2020,38(3):95-101.

中图分类号： TS252.1

文献标志码：A

收稿日期： 2020-04-21

基金项目： 国家自然科学基金资助项目(31901625)。

第一作者： 王 然，女，博士后，主要从事益生菌与肠道健康方面的研究。

*通信作者： 张 炎，男，高级实验师，主要从事乳品加工方面的研究。

(责任编辑：叶红波)