乳蛋白浓缩物(milk protein concentrate，MPC)是一种采用膜分离技术生产的乳蛋白产品，其中酪蛋白和乳清蛋白的比例与原料乳相同[1]，具有优异的溶解性、乳化稳定性和热稳定性以及高蛋白、低乳糖的特点。

在发酵乳方面，MPC通过替代或额外添加的方式应用于牛乳中，可以降低体系乳糖含量，强化蛋白组成，促进发酵乳在生产过程中凝胶结构的形成，改善最终产品的品质。Rehman等[2]发现，使用MPC替代非脂肪干乳制备减脂切达干酪，干酪产量增加一倍，同时由于降低了干酪中乳糖残留量，能有效防止成熟过程中不良发酵的发生，减少肉汤味、苦味等异味的形成；添加MPC能够有效增强干酪的硬度和可切割性，但会降低干酪的融化性[3]；传统的酸奶质地较差且有乳清分离，在酸奶制作中添加MPC，可以作为稳定剂提高酸奶的质地[4]。康志远等[5]发现，适量添加MPC- 70替代牛奶可以明显改善酸奶的感官品质、稳定性以及质构特性；孙颜君[6]的研究显示，使用MPC强化酸奶可以提高黏度和持水性，并在感官上提高酸奶风味；此外，还可以利用MPC标准化原料乳降低乳糖含量来生产低乳糖酸奶[7]。

虽然MPC已经被广泛用于发酵乳生产中，但目前的研究重点都集中在MPC对发酵乳品质的改变上，而关于MPC自身发酵特性的相关研究少见报道。本研究使用MPC-70作为原料，在不同乳糖浓度下进行发酵，研究其发酵曲线、微流变、质构以及风味特性，以期为MPC在不同发酵乳制品中的应用提供技术参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

MPC- 70(蛋白质70%、脂肪1.4%、乳糖16.2%)，宁夏塞尚乳业；乳糖，上海麦克林生化科技有限公司；发酵剂YO- MIX 300 LYO (保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌)，丹麦Danisco公司。

1.2 仪器与设备

MLS- 3781L- PC型高压蒸汽灭菌锅，日本Sanyo公司； DHP- 9032型恒温培养箱，上海一恒仪器科技有限公司； iCinac型乳品发酵监控仪，法国AMS Alliance公司；Rheolaser Master型光学微流变仪，法国Formulaction公司；7890A- 7000型气相色谱- 质谱联用(GC- MS)仪，美国Agilent公司； CR 21GⅢ型高速冷冻离心机，日本Hitachi公司；Brookfield CT3型质构仪，美国Brookfield公司。

1.3 实验方法

1.3.1 基于不同乳糖浓度的MPC发酵样品制备

利用无离子水配制含45.0 g/L MPC- 70的混合液，其中乳糖质量浓度为7.3 g/L。进一步添加乳糖，至混合液中乳糖质量浓度为10.0、15.0、20.0、30.0、50.0 g/L。65 ℃下杀菌30 min，冷却至室温，加入商业发酵剂YO- MIX 300 LYO，42 ℃发酵5 h后冷却，置于4 ℃后熟24 h后进行相关指标的测定。

1.3.2 发酵过程中的pH值测定

采用乳品发酵监控仪对发酵过程中pH值的变化进行监测，每1 min记录一次，持续10 h。

1.3.3 发酵过程中微流变学参数测定

取接菌后的MPC溶液20 mL至微流变仪专用样品池中，将样品池插入微流变仪，运行测试程序。在42 ℃下监测发酵凝胶过程中的宏观黏性因子、弹性因子、固液平衡值以及流动性指数随时间的变化情况。每隔3 min采集一次数据，测定5 h。

1.3.4 发酵样品的持水力测定

各组均称取10 g左右发酵乳样品，分别放于标号的离心管中并称量记录质量，4 000 r/min离心20 min，去上清液，称量并作记录，计算方法见式(1)。

持水力

(1)

式(1)中：M0为空离心管质量，g；M1为样品质量，g；M2为样品离心除去上清液后的离心管与剩下样品总质量，g。

1.3.5 发酵样品的质构分析

使用质构仪进行质构分析(texture profile analysis, TPA)，选用圆柱形TA10探头，目标值10.0 mm，测试速度0.5 mm/s。测定参数：硬度、黏力、弹性、胶着性。

1.3.6 发酵样品挥发性风味物质测定

SPME法提取挥发性风味物质：萃取前将SPME纤维置于GC-MS进样口老化。取10 g发酵样品和1 μL内标物 2-甲基-3-庚酮于30 mL萃取瓶中，内标物质量浓度为0.816 μg/μL，加盖密封，在40 ℃恒温水浴下平衡30 min后，将SPME萃取纤维通过瓶盖插入样品中的顶空部分，推出纤维，顶空吸附30 min后拔出；快速插入GC-MS进样口解吸5 min，进行GC- MS分析。

GC条件：采用DB-wax(30 m×0.25 mm，0.25 μm)色谱柱进行分析。升温程序：起始柱温40 ℃，保持3 min，以5 ℃·min-1升温到200 ℃，以10 ℃·min-1升至230 ℃，保持3 min，载气为氦气，流速1.2 mL·min-1，不分流进样。

MS条件：电子电离源，电子能量70 eV，传输线温度280 ℃，离子源温度230 ℃，四极杆温度150 ℃，质量扫描范围m/z 40～250 u。

定性分析：化合物通过NIST 14质谱数据库和文献报道的保留指数 RI值来鉴定。

定量分析：使用2-甲基-3庚酮为内标物，采用内标法进行定量分析，求得各挥发性成分的含量。

1.4 数据处理

每个样品至少测定3次，实验数据采用SPSS 17.0软件进行分析，P<0.05表示差异显著；使用Sigma Plot软件绘图；风味物质用NIST14谱库检索，并应用CANOCO 4.5统计分析软件对风味数据进行主成分分析。

2 结果与分析

2.1 基于不同乳糖浓度的MPC发酵过程中pH值的变化

使用乳品发酵监控仪对发酵过程中pH值的变化进行监测，实验结果如图1。由图1可知，6组实验样品的发酵pH曲线变化趋势相同，先下降后趋于平稳，但终止pH值不同。发酵前1 h，由于发酵剂中的乳酸菌进入新环境后有一定的延迟期[8]，各组pH 值下降比较缓慢。经过短暂的延迟期后，各组pH值快速下降至4.80左右，不同乳糖含量对发酵剂的产酸速率无明显影响。发酵5 h时，各组样品pH值陆续降至4.60，但不同乳糖含量的MPC发酵物的产酸速率开始出现差异；发酵10 h时，各组pH值依次为4.59、4.42、4.25、4.19、4.14、4.21。 乳酸菌利用乳糖的过程分为两个阶段，首先分泌乳糖酶将乳糖分解成葡萄糖和半乳糖，然后利用葡萄糖进行糖酵解产酸[9]，因此MPC发酵物的乳糖含量对乳酸菌发酵进入稳定期的时间与pH值有直接影响。乳糖质量浓度为7.3、10.0 g/L的两组样品pH值稳定在较高值，说明在发酵后期，由于这些样品中的乳糖含量过低，不足以让乳酸菌利用大量产酸[10]，因此使用MPC标准化原料乳降低乳糖浓度可以制备弱后酸化的低乳糖酸奶。

2.2 发酵过程中微流变学参数的变化

发酵是酸奶生产的重要阶段，在此过程中，随着pH值的降低，乳液中的微观结构发生改变，最终形成以酪蛋白胶粒为基础的凝胶结构，引起酸奶流变特性的显著变化[11-12]。微流变仪通过监测样品中粒子的运动，可以在不破坏样品的前提下研究样品流变特性[13]，基于不同乳糖浓度的发酵过程中流变学特性随时间的变化如图2至图5。图2至图5中，所有样品的弹性因子(EI)、宏观黏性因子(MVI)、固液平衡值和流动性指数变化趋势相同，但在发酵后期不同样品的流变学特性具体值存在一定差异。

弹性因子、宏观黏性因子作为时间的函数可以直接反映样品的弹性、黏性，弹性因子、宏观黏性因子越大，样品的黏弹性越强[14]。从图2、图3的黏度、弹性变化可以看出，各组样品发酵过程中的黏弹性变化可以分为3个阶段。在发酵前期，结合图1可知，发酵0～160 min，样品pH值由起始值降至5.30左右的过程中，样品处于低黏度、低弹性的液体状态，且无明显变化；而发酵160～200 min时，样品pH值由5.30 降至 5.00，乳蛋白开始凝胶化，黏度、弹性快速增加。Rohart等[15]研究葡萄糖酸-δ-内酯诱导的牛乳凝胶化发现，牛乳pH值在5.20～5.40时，其黏弹性出现类似变化趋势。Ercili-Cura等[16]认为这与酪蛋白胶束在pH值为5.00～5.50时引起的蛋白质聚集有关，当接近酪蛋白的等电点时，它们的溶解度降低，导致在pH值约5.00～5.20时的缔合和随后的聚集，从而引起牛乳性质的变化。之后，样品初步形成较为稳定的凝胶结构，黏性、弹性增长速度减缓，进入高黏弹性阶段，可能与形成的凝胶结构不稳定有关[17]。随着乳糖添加量的增加，各组样品宏观黏性因子降低，并且乳糖含量较低时变化明显(P<0.05)，而弹性因子在部分样品间存在显著性差异(P>0.05)，但整体上变化趋势不明显。

固液平衡值(SLB)直接与样品黏弹性成正比，可以给出样品固液性质随时间的变化过程。当SLB=0时，样品为纯弹性/固体性质；0[18]。由图4的固液平衡值变化可知，样品开始凝胶化后，固液平衡值快速降至0.3～0.4，说明样品从液态向固态迅速转变。之后，样品pH值继续下降，脱水缩合作用不断加强，发生乳清析出，使得样品的固液平衡值上升[19]。图5显示了样品的流动性指数(FI)变化，FI能反映样品中粒子运动的快慢，FI值越大则粒子运动越快，反之则越慢。由图5可知，凝胶前样品流动性指数稳定在较高值，开始凝胶后，流动性指数迅速下降，由液态向固态转变，之后随着脱水缩合作用的进行，样品结构愈加稳定，流动性缓慢降低。乳糖含量为7.3、10.0 g/L的样品流动性指数较低(P<0.05)，可能与发酵结束时样品pH值较高、脱水缩合程度析出的乳清较少有关。

2.3 MPC发酵物的持水力及质构特性分析

表1是不同乳糖含量的MPC发酵物的持水力和质构特性分析结果。持水力是发酵乳品质高低的重要参数指标之一，它对延长发酵乳产品的货架期起着关键性作用。由表可知，随着乳糖添加量的增加，MPC发酵物的持水力逐渐升高，与Meletharayil等[20]关于乳糖添加量对MPC酸凝胶影响的研究结果相同。

TPA质构分析是2次咀嚼实验，可以模拟人类咀嚼食品，广泛用于固体、半固体食品的质构分析中[21]。表1所示质构特性中，弹性可用第一次压缩后样品回弹的高度表示，胶着性反映了使半固态样品破裂成吞咽时的分散状态所需的能量。MPC发酵物的胶着性、弹性随乳糖含量的升高，呈现先增大后减小的趋势，可能与凝胶过程中乳糖和酪蛋白分子之间相互作用有关[22]，而MPC发酵物的硬度、黏力随着乳糖浓度的增加无明显变化(P>0.05)。

同列小写字母不同表示差异显著(P<0.05)。

2.4 MPC发酵物的风味物质分析

2.4.1 SPME-GC-MS 检测结果

风味是评估发酵乳品质的主要指标之一[23]。采用SPME-GC-MS技术从6组MPC发酵物样品中一共检测出29种挥发性风味物质，实验结果见表2。表2中包括烃类7种，醇类1种，醛类3种，酮类12种，酯类1种，酸类5种。

定性方法中， MS 为质谱定性，RI为保留指数定性；“-”表示未检出；各物质的含量保留两位有效数字。

在发酵乳制品中，烃类物质大多来源于原料乳自身，这些物质阈值较高，对样品整体风味的贡献较小。在7种检出的烃类物质中，甲苯具有水果甜味[24]，王丹等[25]指出，甲苯是嗜热链球菌单菌发酵牛乳的关键挥发性物质之一，而苯乙烯被认为具有香醋味、橘香味[26]。

醛类是一类风味阈值偏低的风味物质，但由于醛类化合物化学性质比较活泼，在一定条件下易被还原成相应的醇，因此这类化合物在发酵乳制品中的含量通常都不高。GC-MS检测出样品中的3种醛类化合物中，壬醛具有青草味和霉腐味，其含量超过某个阈值时会产生令人不愉快的气味[27]；癸醛具有脂肪香气；苯甲醛具有杏仁、焦糖气味，可能与乳粉制作和牛乳杀菌时的美拉德反应有关。

酮类化合物在各组样品风味物质中含量较高，分别为挥发性风味物质总含量的41.06%、42.09%、46.01%、45.92%、48.80%、54.25%，一般认为酮类物质具有清香气味、奶油味和果香味[28]。在GC-MS检测出的15种酮类化合物中，2,3-丁二酮(双乙酰)、3-羟基-2-丁酮(乙偶姻)被认为是影响发酵乳风味的关键因素[29]，并且随着乳糖含量的增加，在MPC发酵乳中的含量增加，验证了发酵乳中双乙酰、乙偶姻主要是由乳酸菌代谢乳糖而产生[30]。在其他酮类物质中，6-甲基-5-庚烯-2-酮具有蘑菇气味，2-壬酮、2-十一酮具有脂肪香，2-十三酮具有水果香、清香。

酸类化合物在各组样品中的含量较高，为25%～40%，但通常认为酸类物质在发酵乳制品中主要表现在滋味上，且阈值较高，对整体风味贡献小。乙酸具有醋酸味，丁酸具有奶油味，己酸具有强烈的腐臭奶酪香气，辛酸略有不舒适的气味，癸酸具有脂肪味。在酸类化合物含量上，随着乳糖含量的增加，MPC发酵物中的酸类挥发性化合物含量降低，可能是因为乳糖影响了风味物质与乳基质之间的相互作用。

2.4.2 风味物质主成分分析

为了明确乳糖浓度对MPC发酵物风味的影响，利用主成分分析法考察了挥发性风味物质与样品间的分布关系，研究结果如图6。

图6中，F1和F2的贡献率分别为50.9%、27.3%，可以很好地解释乳糖浓度对样品风味的影响。从图6可以看出，各组样品在主成分分析图中的分布比较分散，说明乳糖浓度对MPC发酵物风味物质的组成有较大影响。随着乳糖浓度的增加，不同风味物质对MPC发酵物的贡献也随之变化。不添加乳糖时，乙酸(24)对整体风味有较大贡献；而乳糖浓度达到30.0 g/L和50.0 g/L时，对整体风味有重要贡献的风味物质变成了2,3-丁二酮(12)、2,3-戊二酮(13)、2-庚酮(14)以及3-羟基-2-丁酮(16)等物质。在发酵乳中，乙酸主要来源于脂肪酸降解以及乳糖代谢[23]；2,3-丁二酮、3-羟基-2-丁酮、2,3-戊二酮均为乳酸菌代谢乳糖的产物[30]；2-庚酮与饱和脂肪酸的降解有关[31]，是发酵乳制品特征风味的重要组成物质。因此，乳糖浓度主要是通过影响乳糖代谢产物的形成改变MPC发酵物风味物质的组成，随着乳糖浓度的增加，乳糖代谢产物对整体风味的影响也随之增加。

3 结 论

本研究利用保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌复合发酵剂，探讨了不同乳糖浓度条件下乳蛋白浓缩物的发酵特性。随着乳糖质量浓度的升高(7.3～50.0 g/L)，MPC发酵物的发酵终点pH值呈下降趋势(pH值范围4.14～4.59)；同时，MPC发酵物的宏观黏性因子减小，固液平衡值、流动性指数增大，持水力逐渐升高，胶着性和弹性呈现出先增大后减小的趋势，而硬度和黏力不受影响。MPC发酵物中的挥发性化合物主要是酮类和酸类物质，其中酸类化合物含量随乳糖添加量的增加而减少，而2,3-丁二酮、3-羟基-2-丁酮等乳糖代谢物的含量则随之增加。本研究旨在为进一步了解MPC的发酵特性及其在发酵乳制品中的应用奠定基础。

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Fermentation Characteristics of Milk Protein Concentrate under Different Lactose Concentrations

LUO Tianqi1, YANG Zhijie1, ZHANG Min1, WANG Shijie2, ZHU Hong2, YANG Zhennai1,*

(1.Beijing Advanced Innovation Center for Food Nutrition and Human Health/Beijing Engineering and Technology Research Center of Food Additives, Beijing Technology and Business University, Beijing 100048, China; 2.Shijiazhuang Junlebao Dairy Co Ltd, Shijiazhuang 050221, China)

Abstract： The fermentation characteristics of milk protein concentrate (MPC) with different concentration of lactose was studied after fermentation using Lactobacillus bulgaricus and Streptococcus thermophilus. The results showed that lactose concentration affected the time of fermentation entering stable phase and pH value. With the increase of lactose concentration, the final pH value of MPC fermentation was decreased (4.14-4.59). The microrheological parameters indicated that the solid-liquid balance and fluidity index of MPC fermentation product were increased with the increase of lactose concentration, while the macroscopic viscosity index was decreased. The texture characteristics showed that the water retention rate of MPC fermented product increased with the increase of lactose concentration, and the gumminess and elasticity increased first and then decreased, while hardness and viscosity were not affected. The results of GC-MS showed that the acid compounds and ketone compounds were the main volatile substances in the MPC fermentation product. The content of acid compounds were decreased, while the content of lactose metabolites such as 2,3-butanedione and 3-hydroxy-2-butanone were increased accompanied by the lactose increased. The results of this study provided basic data for further study of the fermentation characteristics of MPC and broadened the application of MPC in different fermented dairy products.

Keywords： milk protein concentrate; lactose; fermentation; microrheological; texture; flavor

doi:10.3969/j.issn.2095-6002.2020.03.010

文章编号：2095-6002(2020)03-0077-09

引用格式：罗天淇，杨智杰，张敏，等. 基于不同乳糖浓度的乳蛋白浓缩物发酵特性研究[J]. 食品科学技术学报，2020,38(3):77-85.

LUO Tianqi, YANG Zhijie, ZHANG Min, et al. Fermentation characteristics of Milk protein concentrate under different lactose concentrations [J]. Journal of Food Science and Technology, 2020,38(3):77-85.

中图分类号： TS252.1

文献标志码：A

收稿日期： 2019-06-03

基金项目： “十三五”国家重点研发计划项目子课题(2018YFC1604302- 2)；北京工商大学横向课题 (2018082)。

第一作者： 罗天淇，男，硕士研究生，研究方向为乳品生物技术。

*通信作者： 杨贞耐，男，教授，博士，主要从事乳品科学及加工技术方面的研究。

(责任编辑：叶红波)