玉米黄粉又被称为玉米蛋白粉，是湿磨法生产淀粉的副产物。玉米黄粉溶解性差、口感粗糙，色氨酸、赖氨酸等人体必需氨基酸含量不足的缺陷，大大限制了其在食品行业中的应用[1-2]。玉米黄粉蛋白质含量高达65%，且缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸等支链氨基酸(BCAA)与酪氨酸、苯丙氨酸等芳香族氨基酸(AAA)的摩尔数比值(fischer ratio,F值)高达4.8，显著高于大豆(3.91)、小麦(3.29)、高粱(4.6)等豆谷类作物[3]。玉米黄粉通过水解可制备玉米蛋白肽，增强了溶解性，有利于提高其功能性和生物利用度[4-5]。与酸或碱水解相比，蛋白酶水解法具有工艺条件温和，很少或没有不良副反应或产物，终产物经中和后含盐量较少，并可通过选择特定酶和反应因子来控制终产物功能性等优点。玉米黄粉由于其氨基酸组成特点，尤其适合蛋白酶酶解制备高F值寡肽[6](HFRP，即一类由2～9个氨基酸残基组成的、F值大于20的寡肽)。临床医学已证明[7]，高F值制剂可辅助治疗肝脏切除手术的患者，改善病人的营养状况，防止肝性脑病的发生或减缓其症状。

二步酶解是采用不少于2种的酶相继水解底物的方法，可灵活选择不同性质、不同水解位点的酶，实现深度水解，并可定向设计水解产物的分子质量、肽链的分子组成等[8]。采用蛋白酶水解玉米黄粉时，有时产物会有苦味，而采用二步酶解制备高F值寡肽，有利于控制肽链末端的疏水性氨基酸含量，得到低苦味活性肽。

本文以玉米黄粉为原料，采用二步酶解法，选择具有内切酶属性的碱性蛋白酶和具有外切酶属性的复合风味蛋白酶，制备HFRP，并对制备工艺条件进行优化，以期为玉米黄粉资源综合利用提供理论和技术指导，提高其利用率及附加值。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

玉米黄粉，阜丰集团有限公司；碱性蛋白酶(2.4 AU-A/g，CAS:9014-01-1)、中性蛋白酶(0.8 AU/g，CAS:9080-56-2)、复合风味蛋白酶(500 LAPU/g，未经基因改造的米曲霉(Aspergillus oryzae)深层发酵生产的内切蛋白酶和外切肽酶复合物)、复合蛋白酶(1.5 AU/g，枯草芽孢杆菌发酵、浓缩，提取复合而成)，诺维信(中国)生物技术有限公司；木瓜蛋白酶(G8430)，Solarbio公司；活性炭(100目)，上海麦克林生化科技有限公司；葡聚糖凝胶Sephadex-G15，上海宝曼生物科技有限公司；玻璃层析柱(16 mm×40 cm)，广州誉维生物科技仪器有限公司；酪蛋白标准品、L-酪氨酸，中国药品生物制品检定所；其他试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

L- 8900型氨基酸自动分析仪，日本日立公司；UV2450型紫外可见光分光光度计，日本岛津公司；YS- 10型小型高速粉碎机，北京燕山正德机械设备有限公司；HQ45型恒温摇床，中国科学院武汉科学仪器厂；Combi- 514R型高速冷冻离心机，翰尼科学产业；ATN- 300型自动凯氏定氮仪，上海洪纪仪器设备有限公司；AKTApurifier 10型蛋白纯化系统，美国通用公司；FD- 1B- 80型冷冻干燥机，南京普森仪器设备有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 蛋白酶活力测定

蛋白酶活力以蛋白酶活力单位表示，1 g固体酶粉(或1 mL液体酶)，在一定的温度和pH值条件下，1 min水解酪蛋白产生1 μg酪氨酸，即为1个酶活力单位(U/g或U/mL)。按照GB/T 23527—2009[9]中的方法，分别测定碱性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、复合风味蛋白酶、复合蛋白酶的酶活力。碱性蛋白酶的最适pH值为8.0，其余均为7.0；中性蛋白酶的最适温度为45 ℃，其余均为50 ℃。

1.3.2 初次酶解条件优化

1.3.2.1 初次酶解蛋白酶的筛选

称取一定量的玉米黄粉，料液比(g/mL)1∶5，碱性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、复合风味蛋白酶、复合蛋白酶的添加量均为5 kU/g，在最适pH值和最适温度条件下酶解4 h。随后将玉米黄粉酶解液pH值调为中性，沸水浴15 min终止反应，5 000 r/min离心15 min，采用福林酚法测上清液中蛋白质含量，计算蛋白转化率，见式(1)。将酶解、离心后的固形物烘干后称重计算溶解度，见式(2)。对照组不经任何酶处理，其他步骤相同。

蛋白转化率=ma/mb×100%；

(1)

溶解度=(m1-(m3-m2)/m1)×100%。

(2)

式(1)、式(2)中：mb、ma，分别为酶解前后样品中蛋白质质量，g；m1，酶解前玉米黄粉的质量，g；m2为空白容器质量，g；m3，离心得到未酶解物烘干后的质量与空白容器质量之和，g。

1.3.2.2 初次酶解单因素实验和正交试验设计

按1.3.2.1节筛选出的酶和实验方法，研究不同的酶添加量(8～16 kU/g)、pH值(7.0 ～11.0)、料液比(g/mL)(1∶5～1∶40)、酶解时间(1.0～5.0 h)和酶解温度(30～70 ℃)对蛋白转化率的影响。依据单因素实验结果，选取各因素下最优水平作为正交试验设计依据，进行正交试验。

1.3.3 初次酶解充分性验证实验

向初次酶解液中加入碱性蛋白酶继续酶解5 h，每小时取样灭酶后测定水解度(degree of hydrolysis,DH)。水解度测定方法采用甲醛滴定法，测定步骤如下：吸取5 mL的酶解液于小烧杯中，加水60 mL，利用磁力搅拌器搅拌，用2 mol/L的NaOH将混合液pH值调节至8.2，向容器中加入10 mL体积分数37%甲醛溶液，最后利用上述浓度的NaOH滴定溶液至pH值 9.2，记录消耗NaOH标准溶液的体积(V1，mL)。以相同体积的蒸馏水代替酶解液作为对照，处理方法相同，记录消耗的体积(V2，mL)。以此计算氨基氮含量(ρ)和水解度，见式(3)、式(4)。

ρ=(V1-V2)×c×M/V0。

(3)

式(3)中：ρ，样品中氨基氮含量，mg/mL；c，NaOH标准溶液浓度，mmol/mL；M，氮原子摩尔质量，mg/mmol；V0，样品的体积，mL。

DH=(ρ1-ρ0)/ρtot。

(4)

式(4)中：ρ1，水解液中氨基氮含量，mg/mL；ρ0，玉米蛋白粉混悬液中氨基氮含量，mg/mL；ρtot，酶解液中氮含量，mg/mL。

1.3.4 二次酶解条件优化

1.3.4.1 二次酶解蛋白酶的筛选

取一定量的玉米黄粉初次酶解液，按照木瓜蛋白酶、复合风味蛋白酶的最适pH值和最适温度条件，酶添加量均为1 kU/mL，酶解2.0 h，沸水浴15 min终止反应。利用活性炭吸附，活性炭吸附条件为温度30 ℃、pH值4.0、吸附时间1.5 h、活性炭添加量0.07 g/mL。依据GB/T 5009.124—2016[10]对吸附后的样品进行前处理，利用氨基酸自动分析仪进行氨基酸组成分析和含量测定，按式(5)计算F值。

F值=n(BCAA)/n(AAA)。

(5)

式(5)中：n(BCAA)为支链氨基酸(缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸)摩尔数；n(AAA)为芳香族氨基酸(酪氨酸、苯丙氨酸)摩尔数。

1.3.4.2 二次酶解单因素实验及正交试验设计

按1.3.4.1中筛选的酶和实验方法，研究不同的酶添加量(0.9～8.1 kU/mL)、pH值(2.0 ～10.0)、酶解时间(1.0～5.0 h)和温度(30～70 ℃)对F值的影响。依据单因素实验结果，选取各因素下最优水平作为正交试验设计依据，进行正交试验。

1.3.5 活性肽分子质量测定

选择杆菌肽(分子质量1 422.69 Da)、合成多肽1(分子质量912.835 Da)、合成多肽2(分子质量493.46 Da)、色氨酸(分子质量204.213 Da)作为检测标准物，依据它们在Sephadex G- 15自装柱中保留时间的不同确定活性肽的分子质量范围。标准样品和样品分离条件：上样量100 μL、样品质量浓度10 mg/mL、流速0.3 mL/min，流动相为高纯水，紫外检测波长280 nm。

2 结果与分析

2.1 蛋白酶活力测定结果

各商品蛋白酶活力测定结果见表1。

2.2 初次酶解条件优化结果

2.2.1 初次酶解蛋白酶的确定

初次酶解后，玉米黄粉蛋白转换率和溶解度如图1。碱性蛋白酶对玉米黄粉的蛋白转化率和水解程度均高于其他蛋白酶；中性蛋白酶、木瓜蛋白酶和复合蛋白酶的蛋白转化率相近；复合风味蛋白酶的蛋白转化率低于其他蛋白酶，这可能与其外切酶属性相关[11-12]，相同时间内无法断开玉米蛋白内部的肽键，因此效果不佳。二步酶解玉米黄粉制备高F值寡肽时，初次酶解要求发生在特定的位置，使得切下的肽段末端为芳香族氨基酸，碱性蛋白酶是一种内切蛋白酶，主要水解羧基侧芳香族或疏水性氨基酸。所以，综合考虑酶切位点[13]与蛋白转化率方面的数据，优选碱性蛋白酶作为初次酶解玉米黄粉的蛋白酶。

资料表明[2,6,14]，蛋白酶不同，作用位点及使用目的也不同。木瓜蛋白酶属于巯基蛋白酶，长期孵育时具有广泛底物特异性，可水解肽链中L-精氨酸、L-赖氨酸、甘氨酸、L-瓜氨酸等羧基参与形成的肽键，并优先水解肽键N-端具有2个羧基的氨基酸或芳香L-氨基酸的肽键。复合风味蛋白酶含有内切蛋白酶和外切肽酶2种活性，在中性或微酸性(最适pH值7.0、温度50 ℃)条件下，该酶可用于脱除低水解度产物、苦味蛋白水解液的苦味，彻底水解蛋白质，增进和改善水解液的风味。复合蛋白酶的主酶是碱性蛋白酶，在低水解度情况下(最适温度40～60 ℃、最适pH值5.5～7.5)也有脱苦作用。

2.2.2 初次酶解条件的单因素实验结果

以蛋白转化率作为评价指标，对初次酶解条件进行单因素实验，结果见表2。随着酶添加量的增加，蛋白转化率逐渐增大，当碱性蛋白酶添加量为12.0 kU/g时，蛋白转化率达到44.55%，此后蛋白转化率变化趋于平缓；因此选取10.0～12.5 kU/g作为正交试验区间，进行进一步筛选。蛋白转化率随着pH值的增加先增大后减小，当pH值为9.0时，蛋白转化率最高为44.89%；因此选取pH值为8.5～10.0作为正交试验区间。当料液比(g/mL)为1∶5～1∶30时，蛋白转化率随着料液比的减小逐渐增大，当料液比为1∶30时，蛋白转化率达到63.60%，此后蛋白转化率有所下降；因此选取料液比(g/mL)1∶20～1∶35作为正交试验区间。碱性蛋白酶在水解3.0 h后，蛋白转化率最大为87.33%，而4.0 h后变化基本上趋于平稳；因此，选择酶解时间2.5～4.0 h作为正交试验区间。当反应温度为30～40 ℃时，蛋白转化率随着温度的增加逐渐增大，当温度达到40 ℃时，蛋白转化率达到最大为84.88%，此后蛋白转化率逐渐降低；因此选择温度35～50 ℃作为正交试验区间。

2.2.3 初次酶解条件的正交试验结果及酶解充分性验证

以蛋白转化率作为评价指标，将5种条件的单因素实验进行正交分析，寻找各个因素的重要性次序及最佳的搭配，结果见表3。由表3极差R的大小顺序可知，各因素对蛋白转化率的影响主次顺序为C、A、E、D、B，即料液比对酶解液中蛋白质含量的影响最大，其次为酶添加量及作用温度，酶作用时间对反应结果的影响较小，pH值的不同对最终结果影响程度最小。各因素方差分析F值均小于临界值，表明各因素都不是主要影响因素。

因此，当以蛋白转化率作为评价指标时各因素的优化组合为碱性蛋白酶添加量12.5 kU/g、pH值9.0、料液比(g/mL)1∶35、酶解温度50 ℃、酶解时间3.0 h。优化条件下酶解玉米黄粉最终蛋白转化率可达85.61%，较优化前提高了452.93%。

初次酶解充分性验证实验显示，在1.0～5.0 h酶解过程中，酶解液中多肽水解度维持在29.6%～29.7%，水解度无显著性变化，表明碱性蛋白酶已将玉米蛋白充分酶切，推测芳香族氨基酸末端大部分得到暴露，因此拟以初次酶解液为底物进行二次酶解，以期断开芳香族氨基酸，使其游离、脱苦。

2.3 二次酶解条件优化结果

2.3.1 二次酶解蛋白酶的确定

二次酶解用酶的筛选原则是使用外切蛋白酶或者是具有外切酶活性的蛋白酶类，将位于肽端的AAA残基切下，使初次酶解暴露出的AAA游离于酶解液中，最终在活性炭吸附作用下降低游离AAA含量，达到提高F值的目的。根据蛋白酶的属性(内切酶或外切酶)和相关文献[15]，选择复合风味蛋白酶、复合蛋白酶、木瓜蛋白酶作为二次酶解备选酶(如图2)。从图2可以看出，复合风味蛋白酶优于复合蛋白酶、木瓜蛋白酶，表现出良好的外切酶活性，经活性炭吸附游离氨基酸后，F值约为木瓜蛋白酶的2倍，因此选择复合风味蛋白酶作为二次酶解用酶。

2.3.2 二次酶解条件的单因素实验结果

以F值作为评价指标，对二次酶解条件进行单因素实验(见表4)。当复合风味蛋白酶添加量为0.9～2.7 kU/mL时，随着酶添加量的增加，F值逐渐增大，当酶添加量为2.7 kU/mL时，F值为17.86，此后F值逐渐下降；因此选取2.25～3.15 kU/mL作为正交试验区间，进行进一步筛选。当pH值为8.0时，F值最大为16.96；因此在正交试验时选取7.0～9.0作为试验区间。复合风味蛋白酶在水解2.0 h后，F值达最大为18.16，因此，选择1.5～2.5 h作为正交试验区间。当反应温度在30～50 ℃时，F值随着温度的增加逐渐增大，当温度达到50 ℃时，F值达到最大为20.27，此后F值逐渐降低；因此选择45～55 ℃作为正交试验区间。

F(0.05)=3.29。

2.3.3 二次酶解条件的正交试验结果

根据二次酶解单因素实验结果，设计正交试验，结果见表5。方差分析显示各因素对F值大小影响均不显著，但从极差分析结果可以发现，酶解时间对结果的影响较大，其次是酶添加量。分析原因可能是复合风味蛋白酶具有外切酶活性，时间和酶添加量的增加可导致其不断将肽链两端的氨基酸进行切断，直接影响F值。结合极差分析结果可知，各因素对F值影响的大小顺序依次为C、A、B、D。二次酶解正交试验后选择的优化组合为复合风味蛋白酶添加量2.7 kU/mL、酶解时间2.5 h、pH值7.0、酶解温度45 ℃。

2.4 二步蛋白酶酶解液经活性炭吸附后氨基酸组成变化

分析二步蛋白酶酶解液经活性炭吸附后的氨基酸组成，并分别统计BCAA和AAA的含量，见图3、表6。图3、表6显示，经二步酶解、活性炭吸附，样品F值为28.30(多肽得率为35.0%)，玉米黄粉酶解前F值为3.50左右，提高了4.9倍。该数值高于孔芳[16]报道的酶法水解牛乳酪蛋白制备的寡肽混合物的F值(21.06)；低于Pedroche等[17]用固定化酶水解牛酪蛋白，并经胰乳蛋白酶和羧肽酶A处理后的产物的F值(30.6)；也低于漆倩涯[18]利用超声辅助酶法水解杏鲍菇制备的寡肽液的F值(34.78)。

2.5 二步蛋白酶酶解液经活性炭吸附后多肽分子质量分布

酶解液中主要多肽的分子质量范围为204.213～1 422.69 Da，如图4。按照氨基酸平均分子质量为128 Da计算，酶解液中的多肽大概由2～11个氨基酸组成。HFRP的定义需要满足以下2点要求：寡肽由2～9个氨基酸组成，分子质量范围256～1 152 Da。二步蛋白酶酶解液经活性炭吸附后，短肽氨基酸组成和分子质量基本满足HFRP的要求，并且分子质量位于493.46～912.84 Da的短肽含量占总含量的85%以上。

3 结 论

以玉米黄粉为原料，研究并优化了二步酶解制备HFRP的工艺条件。通过筛选得到碱性蛋白酶作为初次酶解用酶，利用其特定酶切位点的特性，促使芳香族氨基酸暴露于肽链末端，经过优化确定初次酶解条件为碱性蛋白酶添加量12.5 kU/g(以玉米黄粉质量为基准)、pH值9.0、料液比(g/mL)1∶35，50 ℃反应3.0 h，其蛋白转化率为85.61%。再以初次酶解液为原料，选择具有外切酶活性的复合风味蛋白酶作为二次酶解用酶，通过外切酶断开暴露于肽端的AAA，以利于后期活性炭除掉芳香族氨基酸脱苦，优化确定二次酶解条件为酶添加量2.7 kU/mL(以玉米黄粉初次酶解液体积为基准)、pH值7.0，45 ℃酶解2.5 h。经过上述二步酶解，再经活性炭吸附，样品寡肽得率35%，F值达到28.30，是酶解前的4.9倍，研究结果以期为玉米黄粉资源的综合利用提供一定参考。

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Optimization on Preparation of High Fischer Ratio Oligopeptides by Two-Step Enzymolysis from Corn Yellow Powder

YANG Huaqing1,HOU Wei1,ZHAO Lei1,*，WANG Chengtao1,*,LU Song2

(1.Beijing Advanced Innovation Center for Food Nutrition and Human Health/Beijing Engineering and Technology Research Center of Food Additives,Beijing Technology and Business University,Beijing 100048,China;2.Neimenggu Fufeng Biotechnologies Co Ltd,Huhhot 010030,China)

Abstract：The effects of two-step enzymolysis of corn yellow powder on the preparation of high fischer ratio (F value)oligopeptides were studied.The results showed that the protease type,enzyme addition amount,solid-liquid ratio,pH,enzymatic temperature and reaction time had certain influences on the protein conversion rate and F value of active peptides.The primary enzymolysis conditions obtained by the single factor and orthogonal test optimization were as follows:alkaline protease amount 12.5 kU/g (based on corn yellow powder mass),pH 9.0,solid-liquid ratio 1∶35 g/mL,enzymatic temperature 50 ℃,and reaction time 3.0 h.The protein conversion rate reached 85.61%.Using first-step enzymatic solution as raw material,the conditions of secondary enzymolysis optimized by the single factor and orthogonal test were obtained as follows:complex flavor protease amount 2.7 kU/mL (based on volume of the first-step enzymatic solution),pH 7.0,enzymatic temperature 45 ℃,and reaction time 2.5 h.After two-step enzymolysis of corn yellow powder,the F value of the samples adsorbed by activated carbon reached 28.30,and the oligopeptide yield was 35%.The molecular weight of oligopeptides were between 493.46-912.84 Da and high fischer ratio oligopeptides made up more than 85%.It provides theoretical and technical guidance for the comprehensive utilization of corn yellow powder resources.

Keywords：corn yellow powder;two-step enzymolysis;high fischer ratio oligopeptide;alkaline protease;complex flavor protease

中图分类号：TS209；TQ936

文献标志码：A

doi:10.3969/j.issn.2095-6002.2019.06.014

文章编号：2095-6002(2019)06-0100-08

引用格式：杨华青，侯威，赵磊，等.玉米黄粉二步酶解制备高F值寡肽的工艺优化[J].食品科学技术学报，2019,37(6):100-107.

YANG Huaqing,HOU Wei,ZHAO Lei，et al.Optimization on preparation of high fischer ratio oligopeptides by two-step enzymolysis from corn yellow powder[J].Journal of Food Science and Technology,2019,37(6):100-107.

收稿日期：2019-01-28

基金项目：国家重点研发计划项目(2016YFD0400802)；北京市属高校高水平教师队伍建设支持计划项目(CIT&TCD201704042；IDHT20180506)；北京市科技创新服务能力建设- 科技成果转化提升计划项目(PXM2018- 014213- 000033)；2019年基本科研经费资助项目(PXM2019- 014213- 000007)；人才培养质量建设- 一流专业建设资助项目(PXM2019- 014213- 000010)。

第一作者：杨华青，女，硕士研究生，研究方向为食品生物技术。

*通信作者：

赵 磊，女，副教授，博士，主要从事功能食品开发方面的研究；

王成涛，男，教授，博士，博士生导师，主要从事食品生物技术方面的研究。

(责任编辑：张逸群)