核桃(Juglans regia L.)属斗科目胡桃科胡桃属植物，享有世界四大坚果之一的美誉[1]。我国是除了美国之外，核桃最大的生产国，在青皮核桃加工脱皮过程中，每年大约有35万t的青皮废料产生，这不仅对环境造成了污染，同时还是一种浪费[2]。国内外学者现已从核桃青皮中提取分离出大量化学物质，其有效化学成分主要有萘醌类、多酚类、多糖、二芳基庚烷类等[3]。多酚在核桃青皮中的含量仅次于黄酮、蒽醌类[4]，具有很强的抑菌、抗氧化、抗肿瘤、抗衰老等功效，其抗癌机理也与其抗氧化性息息相关[5-7]。研究以酚类物质含量为指标，采用三因素三水平正交试验优化核桃青皮酚类物质提取工艺。采用高效液相色谱法(high performance liquid chromatography，HPLC)和质谱法(mass spectrum，MS)研究其酚类物质组成，以期为核桃青皮的开发利用提供一定的参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

核桃，云南省保山市优昊实业有限公司。

福林酚试剂，上海金穗生物科技有限公司；无水碳酸钠、无水乙醇、石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯，均为分析纯，国药集团化学试剂有限公司；标准品表儿茶素、没食子酸、原花青素、表儿茶素没食子酸酯、没食子儿茶素、没食子儿茶素没食子酸酯、表没食子儿茶素没食子酸酯，上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.2 仪器与设备

UV- 1800型可见光分光光度计，上海美诺达仪器有限公司；DK- S24型电热恒温水浴锅，上海精宏实验设备有限公司；FW100型高速万能粉碎机，天津市泰斯特仪器有限公司；ML- 204/02型精密电子天平，梅特勒- 托利多仪器(上海)有限公司；GZX- 9030型数显鼓风干燥箱，上海博迅实业有限公司医疗设备厂；Agilent 1290型高效液相仪、Agilent 1100 LC- MS/TOF高分辨液相质谱联用仪，美国安捷伦科技公司。

1.3 实验方法

1.3.1 核桃青皮酚类物质提取工艺

核桃青皮去杂、清洗、干燥后粉碎，过40目筛。称取2 g核桃青皮粉，加入乙醇- 水混合溶剂，水浴恒温提取，将混合液真空抽滤，收集滤液[8]。

1.3.2 核桃青皮多酚含量测定

1.3.2.1 没食子酸标准曲线的绘制

参照文献[9]，在0、0.25、0.50、0.75、1.00、1.25、1.50 mL的0.1 mg/mL没食子酸标准品溶液中，加入1 mL福林酚试剂和2 mL 质量分数12%Na2CO3溶液，然后加入不同体积的蒸馏水定容至10 mL。摇匀后避光反应1 h，765 nm测定其吸光度，重复3次。得到没食子酸质量浓度(X)与吸光度(Y)的标准回归方程为Y=13.903X+0.059，R2=0.991。

1.3.2.2 酚类物质含量计算

将核桃青皮酚类物质提取物稀释一定倍数，取1 mL待测样品溶液于试管，加入1 mL福林酚试剂，摇匀后滴加2 mL 质量分数12% Na2CO3溶液和1 mL蒸馏水。摇匀后在25 ℃下避光反应1 h，765 nm测定其吸光度，代入标准回归方程得到酚类物质质量浓度ρ，进行3次平行实验，酚类物质含量计算见式(1)：

(1)

式(1)中，w为酚类物质含量，mg/g；ρ为待测样品中酚类物质质量浓度，mg/mL；V为提取液体积，mL；N为稀释倍数；M为核桃青皮质量，g。

1.3.3 核桃青皮酚类物质提取工艺优化

在前期单因素实验基础上，通过正交试验确定核桃青皮中酚类物质的优化提取条件[10]，以酚类物质提取率为指标，每组称取2 g核桃青皮，设定提取时间为120 min，采用L9(33)正交表进行试验，因素水平设计如表1。

1.3.4 核桃青皮酚类物质的分级纯化

采取液- 液萃取方法，将核桃青皮酚类物质粗提物用适量水溶解，经石油醚(体积比1∶3)、二氯甲烷(体积比1∶1)、乙酸乙酯(体积比1∶1)依次各萃取3次后，利用溶液极性不同(极性由大到小依次为水、乙酸乙酯、二氯甲烷、石油醚)，可将多酚粗提物按梯度初步分开。收集水层及乙酸乙酯层，分别制备极性最强的水溶性酚类物质和极性略低的乙酸乙酯层提取物[11-12]。

表1 正交试验因素水平
Tab.1 Factors and levels of orthogonal experiment

水平因素At(提取)/℃B料液比/(g·mL-1)Cφ(乙醇)/%1601∶10402701∶15503801∶2060

1.3.5 核桃青皮酚类物质的组成分析

1.3.5.1 高效液相色谱分析

将表儿茶素、没食子酸、鞣花酸和原花青素等物质的标准品加去离子水溶解，分别配制成质量浓度为1.0 mg/mL的标准品溶液。

将核桃青皮酚类物质粗提物溶液稀释到1.0 mg/mL。同标准品溶液配制方法，配制1.0 mg/mL的乙酸乙酯层样品以及1.0 mg/mL的水层样品[13]。

原花青素标准曲线：根据不同的原花青素峰面积(y)以及对应的质量浓度(x)绘制曲线，得到标准回归方程为y=890.004 8x+7.900 2。

色谱条件：色谱柱DIONEX C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)。流动相A为体积分数0.05%三氟乙酸，流动相B为甲醇。梯度洗脱为0～12 min，87%～75%A，13%～20%B；12～23 min，75%～20%A，25%～80%B；23～26 min，87%A，13%B。流速为0.5 mL/min。检测波长280 nm，柱温35 ℃，进样量20 μL[14-16]。

1.3.5.2 质谱分析

将得到的乙酸乙酯层样品粉末1.0 mg，溶于1 mL的甲醇，通过0.22 pm滤器过滤，得到样液，待进样[17]。

MS条件：色谱柱Lichrosphers C18柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)，质谱进样分流比为1∶1。负离子模式，离子化方式为ESI负离子，扫描范围m/z 50～2 000，干燥气温度350 ℃，干燥气流速15 L/min，喷雾压力40 psi，毛细管电压3 500 V[18]。

1.4 数据处理

数据处理采用Statistica program 10.0 软件；绘图采用Sigmaplot 10.0软件。

2 结果与分析

2.1 正交试验优化结果

提取条件为A3B2C2，即提取时间120 min，提取温度80 ℃，料液比(g/mL)1∶15，乙醇体积分数50%条件下，核桃青皮酚类物质的提取效果较优，提取率为0.99%(见表2)。比较RA、RB、RC可知，提取温度和乙醇体积分数对核桃青皮酚类物质提取率的影响相近，且均大于料液比的影响。

表2 正交试验设计与结果
Tab.2 Results of orthogonal experiment

试验号ABC平均提取率/%11110.4622210.3933310.5342120.5253220.9961320.4173130.4381230.4492330.42K11.301.411.37K21.321.821.92K31.951.351.29K10.430.470.46K20.440.610.64K30.650.450.43R0.220.150.21

2.2 验证实验结果

对正交试验优化得出的提取条件进行验证，称取2 g核桃青皮粉末，按优化工艺进行提取，此时核桃青皮酚类物质得率为0.99%，与预测值接近，且高于任何一次单因素实验。证明正交试验优化法得到的提取工艺科学合理，准确可靠。

2.3 核桃青皮酚类物质高效液相色谱分析结果

对核桃青皮酚类物质粗提物进行高效液相色谱分析(图1)。结果显示，在3.133 min时有一个明显的峰，将其与表儿茶素、没食子酸、鞣花酸和原花青素等标准品的出峰时间对比，确定其为原花青素。由图1可知，该峰面积为543.936，根据1.3.5.1节中原花青素标准曲线可定量分析出原花青素的质量浓度为0.602 3 mg/mL。核桃青皮酚类物质粗提物上样质量浓度为1.0 mg/mL，则粗提物中原花青素含量为602.3 mg/g。

图1 酚类物质粗提物高效液相色谱
Fig.1 HPLC of crude extracts

2.4 核桃青皮酚类物质质谱分析结果

2.4.1 乙酸乙酯层样品质谱分析结果

乙酸乙酯层样品质谱分析结果见表3，核桃青皮多酚粗提物的乙酸乙酯层中有34种化合物。根据高分辨质谱结果，结合相关资料和m/z，推断分子式。结果显示，乙酸乙酯层样品中有原儿茶醛、原儿茶酸、丁香酸、鞣花酸、儿茶素或表儿茶素、皮树脂醇、蓟黄素衍生物及三酰基葡萄糖等物质。

2.4.2 水层样品质谱分析结果

水层样品质谱及化合物分子式分析结果见表4，核桃青皮多酚粗提物的水层中有25种化合物。根据高分辨质谱结果，结合相关资料和m/z推断分子式。结果显示，水层样品中含有没食子酸酰葡萄糖、皮树脂醇以及短叶苏木酚羧酸。

3 结 论

研究采用正交试验优化核桃青皮酚类物质提取工艺，确定核桃青皮酚类物质的优化提取工艺为提取时间120 min，提取温度80 ℃，料液比(g/mL)1∶15，乙醇体积分数50%。高效液相色谱分析显示，核桃青皮中含有原花青素，其含量为602.3 mg/g。将粗提物按极性不同分为乙酸乙酯层和水层。通过高分辨质谱进一步鉴定出乙酸乙酯层含有原儿茶醛、原儿茶酸、丁香酸、鞣花酸、儿茶素或表儿茶素、皮树脂醇、蓟黄素衍生物、三酰基葡萄糖；水层中含有没食子酸酰葡萄糖、皮树脂醇以及短叶苏木酚羧酸。田平平等[19]研究表明核桃青皮中具有强抗氧化活性的7种主要成分为绿原酸、短叶苏木酚羧酸、花靛- 葡萄糖/半乳糖、鞣花酸、槲皮素- 阿拉伯糖、表儿茶素或儿茶素、槲皮素-3-O-葡萄糖苷，其中，鞣花酸、表儿茶素或儿茶素在本研究中也被检出。核桃青皮多酚组成复杂，不同极性多酚的活性也不尽相同，文章研究了核桃青皮中不同极性酚类物质的组成，为今后酚类物质的分级利用，构效关系研究以及开发不同用途核桃青皮系列产品提供了一定的参考。

表3 酚类物质粗提物乙酸乙酯层质荷比分析结果
Tab.3 Analysis of mass to charge ratio of crude extracts in ethyl acetate layer

编号质荷比/uM鉴定结构1109110未知2112113未知3121122未知4137138原儿茶醛5153154原儿茶酸6159160未知7165166未知8177178未知9189190未知10193194未知11197198丁香酸12281282未知13301302鞣花酸14325326儿茶素或表儿茶素15341342未知16355356未知17377378皮树脂醇18393394未知19419420未知20435436未知21463464未知22475476未知23491492未知24507508未知25521522未知26533534未知27549550蓟黄素衍生物28561562未知29573574未知30589590未知31605606未知32621622未知33635636三酰基葡萄糖34733734未知

紫外波长为254、280 nm。

表4 酚类物质粗提物水层荷质比分析结果
Tab.4 Analysis of mass to charge ratio of crude extracts in water layer

编号质荷比/uM鉴定结构19495未知2112113未知3149150未知4154155未知7189190未知9229230未知11283284未知12299300未知13331332没食子酸酰葡萄糖14337338皮树脂醇15353354短叶苏木酚羧酸16381382未知17403404未知18431432未知19453454未知23491492未知24507508未知25557558未知

紫外波长为254、280 nm。

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Composition Analysis of Phenolic Compounds with Different Polarities in Walnut Green Husk

LIU Rui,XIE Chenyang,WU Shuixia,YANG Fang,ZHANG Mei*

(School of Environmental Ecology and Biological Engineering,Wuhan Institute of Technology,Wuhan 430205,China)

Abstract：As a by-product of walnut processing,walnut green husk contains different polar phenolic substances with different compositions.In order to grading utilization of walnut green husk resources,orthogonal test was used to optimize the extraction process of phenols and prepare phenols crude extracts from walnut green husk.On this basis,water,petroleum ether,dichloromethane and ethyl acetate were used to extract phenolic compounds with different polarities,and the ethyl acetate layer and water layer were collected separately.HPLC was used to analyze the composition of the crude extract and high resolution mass spectrometry was used to analyze the composition of the ethyl acetate layer and water layer.The results showed that the ethyl acetate layer sample contained protocatechuic aldehyde,protocatechuic acid,syringic acid,ellagic acid,catechin or epicatechin,skin resin alcohol,quercetin derivative and triacyl glucose.While the water layer samples contained picorealol,gallic acid gluconate,and short-leaved hematoxylin carboxylic acid.In general,phenolic compounds with different polarities in walnut green husk have different compositions,and could be used in grades according to its composition characteristics and widely used in various fields of food or additives.

Keywords：walnut green husk;phenolic compounds;polarity;mass spectrometry;classified utilization

中图分类号：TS201.2；TS255.1

文献标志码：A

doi:10.3969/j.issn.2095-6002.2019.06.012

文章编号：2095-6002(2019)06-0088-06

引用格式：刘瑞，谢辰阳，吴水霞，等.核桃青皮不同极性酚类物质组成分析[J].食品科学技术学报，2019,37(6):88-93.

LIU Rui,XIE Chenyang,WU Shuixia,et al.Composition analysis of phenolic compounds with different polarities in walnut green husk[J].Journal of Food Science and Technology,2019,37(6):88-93.

收稿日期：2018-09-21

基金项目：武汉工程大学校长基金资助项目(2018154)；国家级大学生创新训练项目(201810490015)；湖北省教育厅科学技术研究重点项目(D20171501)。

第一作者：刘 瑞，女，本科生，研究方向为食品科学与工程。

*通信作者：张 美，女，讲师，主要从事天然产物方面的研究。

(责任编辑：张逸群)