DOI:10.3969/j.issn.2095-6002.2019.06.004
中图分类号:TS255.7
王丽玲1,2, 蒲云峰1,2, 李雁琴1, 侯旭杰1,2
| 【作者机构】 | 1塔里木大学生命科学学院; 2南疆特色农产品深加工兵团重点实验室 |
| 【分 类 号】 | TS255.7 |
| 【基 金】 | 国家自然科学基金-新疆联合基金资助项目(U1703105) 南疆重点产业创新发展支撑计划项目(2018DB002) 新疆维吾尔自治区重大科技专项(2016A03008-02) 第一师阿拉尔市科技计划项目(2017GJJ06) |
枣(Ziziphus jujuba Mill.)是鼠李科(Rhamnaceae)枣属(Ziziphus)植物的成熟果实,是枣属植物中栽培面积最广和经济效益最高的一个栽培种[1]。枣树原产于我国黄河中下游地区,是我国古老的特有果树之一,有文字记载的栽培历史至少有3 000多年[2]。由于枣树具有耐盐碱、抗旱、耐低温、适应性强等特征,已广泛分布于亚洲、欧洲、美洲、非洲、大洋洲的国家和地区。目前,我国枣树栽培面积近200万hm2,枣果产量已达824.1万t。红枣不仅富含碳水化合物、氨基酸、有机酸、矿物质及维生素等营养物质[3-4],还含有多糖、cAMP、皂苷、生物碱、黄酮和三萜类等功能成分[5],具有抗氧化、降血压、镇静安神、防治心脑血管疾病、改善记忆力、提高免疫力等功能[6-7],是集药、食、补三大功能为一体的药食兼顾的天然保健食品。
我国最早的中医药著作《神农本草经》中将红枣作为药材收录,并记载其具有延长寿命、补血、促进睡眠等功效[8]。《本草纲目》中记载“大枣味甘,平。主治心腹邪气,安中,养脾,补少气少津,除烦闷等”,并且还记载了一条治疗烦闷不眠的附方:“大枣十四枚,葱白七根,加水三升煮成一升,一次服下”[9]。在2015版《中国药典》中也记载“大枣具有补中益气,养血安神,用于脾虚食少,乏力便溏,妇人脏躁”[10]。此外,《金匮要略》中的“甘麦大枣汤”和《伤寒论》中的“柴胡桂枝汤”的主要成分也是红枣,它们在传统中医中常被用于治疗抑郁、失眠等疾病[11]。虽然这些中医药著作是长期医疗实践的经验总结,说明红枣具有促进睡眠的功能,但红枣促进睡眠的分子机制仍然不清楚,难以用科学的理论去解释红枣的功效。
失眠是最为常见的睡眠障碍类型,虽不属于危重疾病,但会对正常生活和工作产生负面影响,并能加重或诱发心血管疾病。据流行病学调查,我国有45.4%的人曾经历了不同程度失眠[12],并且失眠会随着年龄增长而增加[13]。由于传统中药多用红枣治疗以失眠为主的神经衰弱症,因此挖掘红枣中具有治疗失眠功效的化学成分并鉴定日益受到关注。目前,已有大量文献报道了枣的化学成分及生理功能,早期的研究认为皂苷是枣中具有镇静和促进睡眠的有效成分,而韩国学者Won等[14]研究发现酸枣仁中黄酮和皂苷均具有镇静和促进睡眠的功效,由于酸枣仁中黄酮含量比皂苷高,因此他认为起主要作用的是黄酮。后来,Jiang等[13]比较了枣中黄酮、皂苷和多糖对小鼠的镇静催眠效果,发现皂苷的镇静催眠效果优于黄酮,而多糖没有镇静催眠作用。Cao等[15]研究了酸枣仁皂苷(jujubosides)对小鼠的镇静催眠效果,发现酸枣仁皂苷可能是一种重要的促进睡眠的物质。近期研究报道,Song等[16]以Sprague-Dawley小鼠为研究对象,发现不仅酸枣仁皂苷A(jujuboside A)具有抗焦虑和镇静作用,而且它的代谢物(酸枣仁皂苷B和酸枣仁苷元)也具有相同功效。综合来看,已有研究表明皂苷很可能是红枣中具有镇静作用的有效成分。
Zhao等[17]采用高效液相色谱- 蒸发光散射检测器(high performance liquid chromatography-evaporative light scattering detector,HPLC- ELSD)法分析9种酸枣仁样品中的皂苷,它们的皂苷含量在0.232~0.824 mg/g。在笔者研究团队前期研究中,以骏枣为原料,通过溶剂提取和大孔树脂纯化,获得富含皂苷的组分,其得率为0.019% (即相当于0.19 mg/g)[18]。有研究报道,以剂量为40 mg/kg[13],25 mg/kg和9 mg/kg[16]的红枣皂苷饲喂小鼠,能够获得镇静和促进睡眠功效。如果按红枣含0.8 mg/g皂苷和达到促进睡眠功效的皂苷剂量9 mg/kg计算,一个体重80 kg的人每天至少需要吃0.9 kg红枣才能达到促进睡眠的功效,该消费量远超过人们正常红枣消费量。因此,皂苷可能不是红枣中促进睡眠的主要活性物质。
在Song等[16]研究中发现酸枣仁皂苷B和酸枣仁苷元通过影响γ-氨基丁酸A受体(γ-aminobutyric acid A receptor,GABA(A))的表达与激活,从而产生促进睡眠的功效。我们猜测GABA(A)的天然配体——γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)可能是红枣中促进睡眠的功效成分。
GABA是一种非蛋白氨基酸,它广泛分布于微生物、动物和植物体内[19]。GABA被认为是中枢神经系统(central nervous system,CNS)中重要的抑制性神经递质[20],其作用是降低神经元活性,防止神经细胞过热,从根本上镇静神经,从而达到抗焦虑的效果[21]。此外,GABA还具有降血压、改善记忆、抑制癌细胞增殖、增强免疫、减少失眠等功效[22-25]。近年来,一些研究分析了部分水果中的GABA质量分数,如红毛丹鲜果710 μg/g[19]、草莓鲜果1 560~3 640 μg/g[26]、葡萄鲜果146 μg/g[27]、枇杷鲜果15.6~36.4 μg/g[28]、龙眼干果1 998 μg/g[29]、荔枝鲜果1 700~3 500 μg/g[30]和欧李干果140 μg/g[31]等。
鉴于此,我们采用氨基酸自动分析仪法比较了含GABA的氨基酸标准品和红枣样品的色谱图,见图1,发现在21.32 min处,红枣样品和氨基酸标准品的色谱图中均出现了保留时间相同的峰,表明红枣中含有GABA。此外,从红枣的色谱图可以看出,GABA的色谱峰比大多数游离氨基酸的色谱峰高,这说明红枣中不但含有GABA,而且其含量较高。
图1 红枣样品和氨基酸标准品的色谱
Fig.1 Chromatograms of jujube sample and amino acid standard sample
在随后的工作中,我们采用HPLC法分析了7个品种鲜枣中GABA含量,其干枣质量分数范围为150.31~333.37 μg/g,其中骏枣和骏优2号中GABA含量最高,而冬枣最低[32]。Okada等[25]以20名更年期女性为研究对象,每日给予含26.4 mg GABA的脱脂大米胚芽,发现超过65%患者的失眠、睡眠障碍和抑郁症状得到明显改善。如果参考这一剂量,每天摄取约200 g鲜枣,就可产生促进睡眠的功效。
然而,在《本草纲目》中描述红枣:“大的是枣,小的是棘;大枣即晒干的大枣”[9]。在《中国药典》(2015版)也记载“大枣为鼠李科植物枣树的干燥成熟果实。秋季果实成熟采收,晒干”[10]。这表明入药是指大个干制红枣,而不是鲜枣或干制小红枣。骏枣是新疆主栽的红枣品种之一,主要用于干制及加工,也是典型的大枣品种。因此,我们分析了采摘、干制和贮藏对骏枣中GABA含量的影响,发现2016年11月采摘的鲜枣(水分36.44%)GABA占干枣质量分数达628.74 μg/g,比2016年10月采摘的鲜枣(水分57.92%)GABA高了近1倍[32]。通常情况下,植物组织中GABA非常低,其新鲜组织中GABA的质量分数只有3.12~624 μg/g,但当遭受生物或非生物胁迫后,GABA含量会快速大量增加[32]。有研究报道,蔬菜和水果经低温胁迫处理,能够增加其GABA含量。经5 min的机械或冷刺激,大豆鲜叶中GABA含量增加到1~2 μmol/g,比处理前增加了20~40倍[34];龙眼经预冷处理后,其GABA含量增加了89%[30];温室栽培的菠菜经14 d冷胁迫(4~7 ℃)处理后,其GABA含量显著高于对照组[35]。经查询,2016年10月新疆阿拉尔气温在0~20 ℃范围内波动,即夜间温度常在0 ℃左右,而2016年10月下旬夜间温度常在-5 ℃左右。这说明骏枣采摘前可能因经历了自然冷胁迫,从而促进了骏枣中GABA的积累。
经55 ℃干燥24 h后,获得水分质量分数为20.03%的干制骏枣,导致GABA损失了13.50%;当干制骏枣常温贮藏6个月和12个月后,GABA分别减少了49.18%和77.44%[32]。Wang等[36]在制备GABA强化牛奶时,发现杀菌会导致GABA损失,升高温度会导致GABA损失显著增加,故认为美拉德反应是导致GABA损失的主要原因;此外,干果常温贮藏过程中,也会发生美拉德反应,从而导致游离氨基酸损失[37]。这说明干制和贮藏过程中,可能会因美拉德反应导致骏枣中GABA损失。
基于现有结果和分析,每天吃66 g鲜骏枣(水分36.44%)或61 g干骏枣(水分20.03%),就能获得足够的GABA(26.4 mg),从而达到促进睡眠的功效。在《中国果树志:枣卷》中记载:“骏枣平均果重22.9 g,最大果重36.1 g”[38]。即因此推断每天吃3粒骏枣就可能产生促进睡眠的功效。这与民间广泛流传的一句谚语“一日三枣,长生不老”正好相符。但如果是每次吃常温贮藏了6个月或12个月的干制骏枣,至少需要吃6粒枣或12粒。这也说明减少加工贮藏过程中GABA损失,是维持红枣功效的重要措施之一。因此,GABA作为红枣中一种重要的功能成分,应该也作为一个红枣加工及功能评价的重要指标。
目前,GABA检测方法有氨基酸分析仪法、分光光度法、酶法、毛细管电泳法、薄层扫描法、高效液相色谱法等[39]。其中,分光光度法操作方法简单、检测成本低,但专一性差;氨基酸自动分析仪法样品前处理简单、操作简单,但检测费用高、分析周期长;酶法、毛细管电泳法等方法具有准确度高、专一性强,但操作复杂、检测成本高;邻苯二甲醛(o-phthalaldehyde,OPA)柱前衍生HPLC法具有试剂价格便宜、衍生时间短、衍生条件简单、过量试剂不干扰测定等优点,其应用最为广泛。然而,现有OPA柱前衍生HPLC法分析条件多照搬游离氨基酸的分析条件,这些方法存在流动相组成复杂、流速高、系统压力高、分析周期长等问题。如程威威等[40]分析发芽糙米GABA是以乙腈和25 nmol/L的乙酸钠缓冲液为流动相,流速1 mL/min,有机相初始体积分数10%(乙腈),梯度洗脱,单次分析周期45 min;吴琴燕等[41]分析红茶GABA是以甲醇和10 mmol/L的磷酸盐缓冲液为流动相,流速1 mL/min,有机相初始体积分数10%(甲醇),梯度洗脱,单次分析周期45 min;Chen等[42]分析蘑菇子实体和菌丝中GABA是以甲醇、水和50 nmol/L的乙酸钠缓冲液为流动相,流速1.2 mL/min,有机相初始体积分数17%(甲醇),梯度洗脱,单次分析周期43 min。这些方法与文献中采用OPA柱前衍生HPLC法测定氨基酸的分析条件相似[43],均是参考了氨基酸的分析条件,并不是专门用于GABA的分析。因此,有必要从简化流动相组成、提高初始有机相比例、降低流动相流速等方面开展OPA柱前衍生HPLC法分析GABA含量的条件优化。
在前期取样分析的7种新鲜红枣品种中均检测到GABA,并且红枣可能因自然冷胁迫积累了GABA[32]。如果摄入3粒富含GABA的红枣,就能获得足够的GABA产生促进睡眠的功效,说明GABA可能是红枣中重要的活性成分,下一步应在前期研究的基础上对该功能进行验证。刘孟军等[44]主编的《中国枣种质资源》记录了881个枣种质资源和63个枣优株,而目前仅分析了7个品种的鲜枣及1个品种的采摘、干制和贮藏样品的GABA。因此,今后应扩大品种调查范围,开展采摘、干制和贮藏对红枣GABA形成及变化规律研究,更好地认识红枣中的GABA及红枣的功能价值。
目前,GABA的测定多采用OPA柱前衍生HPLC法,但现有方法多参考氨基酸测定的方法,存在流动相组成复杂、流速高、系统压力高、分析周期长等缺点。因此,开展红枣GABA研究,首先应针对现有HPLC法的不足,通过对流动相组成、流速、有机相初始比例等条件的优化,建立一种简单、快速、准确的GABA检测方法。
[1] 刘孟军.枣产业转型期面临的挑战与对策[J].中国果树,2018(1):1-4.
LIU M J.The challenges and countermeasures of jujube industry during transition period[J].China Fruits,2018(1):1-4.
[2] 刘孟军,王玖瑞,刘平,等.中国枣生产与科研成就及前沿进展[J].园艺学报,2015(9):1683-1698.
LIU M J,WANG J R,LIU P,et al.Historical achievements and frontier advances in the production and research of Chinese jujube(Ziziphus jujuba)in China[J].Acta Horticulturae Sinica,2015(9):1683-1698.
[3] HERNANDEZ F,NOGUERA-ARTIAGA L,BURLO F,et al.Physico-chemical,nutritional,and volatile composition and sensory profile of Spanish jujube (Ziziphus jujuba Mill.)fruits[J].Journal of the Science of Food and Agriculture,2016,96(8):2682-2691.
[4] SONG J,BI J,CHEN Q,et al.Assessment of sugar content,fatty acids,free amino acids,and volatile profiles in jujube fruits at different ripening stages[J].Food Chemistry,2019,270:344-352.
[5] WOJDYLO A,FIGIEL A,LEGUA P,et al.Chemical composition,antioxidant capacity,and sensory quality of dried jujube fruits as affected by cultivar and drying method[J].Food Chemistry,2016,207:170-179.
[6] WANG B,HUANG Q,VENKITASAMY C,et al.Changes in phenolic compounds and their antioxidant capacities in jujube (Ziziphus jujuba Miller)during three edible maturity stages[J].LWT-Food Science and Technology,2016,66:56-62.
[7] GAO Q,WU C,WANG M.The jujube (Ziziphus jujuba Mill.)fruit:a review of current knowledge of fruit composition and health benefits[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry,2013,61(14):3351-3363.
[8] CHEN J,LI Z,MAIWULANJIANG M,et al.Chemical and biological assessment of Ziziphus jujuba fruits from China:different geographical sources and developmental stages[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry,2013,61(30):7315-7324.
[9] 李时珍.本草纲目[M].倪泰一,李智谋,译.南京:江苏人民出版社,2011.
[10] 国家药典委员会.中华人民共和国药典(第1部):2015版[M].北京:中国医药科技出版社,2015.
[11] PANG T H H,IP F C F,IP N Y.Recent development in the search for effective antidepressants using traditional Chinese medicine[J].Central Nervous System Agents in Medicinal Chemistry,2008,8(1):64-71.
[12] 崔界峰,杨薇,谢雁鸣,等.基于真实世界的失眠患者合并疾病及用药情况分析[J].中国中药杂志,2014,39(18):3519-3526.
CUI J F,YANG W,XIE Y M,et al.Real-world analysis of current disease and medicine among patients with insomnia[J].China journal of Chinese materiamedica,2014,39(18):3519-3526.
[13] JIANG J G,HUANG X J,CHEN J,et al.Comparison of the sedative and hypnotic effects of flavonoids,saponins,and polysaccharides extracted from Semen Ziziphus jujube[J].Natural Product Research,2007,21(4):310-320.
[14] WON S W,SAM S K,SANG H S,et al.The structure of spinosin(2″-O-β-glucosylswertisin)from Zizuphus vulgaris var.Spinosus[J].Phytochemistry,1979,18(2):353-355.
[15] CAO J,ZHANG Q,CUI S,et al.Hypnotic effect of jujubosides from Semen Ziziphispinosae[J].Journal of Ethnopharmacology,2010,130(1):163-166.
[16] SONG P,ZHANG Y,MA G,et al.Gastrointestinal absorption and metabolic dynamics of jujuboside A,a saponin derived from the seed of Ziziphus jujuba[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry,2017,65(38):8331-8339.
[17] ZHAO J,LI S P,YANG F Q,et al.Simultaneous determination of saponins and fatty acids in Ziziphus jujuba(Suanzaoren)by high performance liquid chromatography-evaporative light scattering detection and pressurized liquid extraction[J].Journal of Chromatography A,2006,1108(2):188-194.
[18] PU Y,DING T,ZHANG N,et al.Identification of bitter compounds from dried fruit of Ziziphus jujuba cv.Junzao[J].2017,20(1):26-35.
[19] MEEPLOY M,DEEWATTHANAWONG R.Determination of γ-aminobutyric acid (GABA)in Rambutan fruit cv.rongrian by HPLC- ELSD and separation of GABA from Rambutan fruit using Dowex 50W- X8 column[J].Journal of Chromatographic Science,2016,54(3):445-452.
[20] MIHALIK B,PALVOLGYI A,BOGAR F,et al.Loop-F of the α-subunit determines the pharmacologic profile of novel competitive inhibitors of GABA A receptors[J].European Journal of Pharmacology,2017,798:129-136.
[21] 江波.GABA(γ-氨基丁酸):1种新型的功能食品因子[J].中国食品学报,2008,8(2):1-4.
JIANG B.Gamma-aminobutyric acid:a novel functional factor for nutraceuticals[J].Journal of Chinese Institute of Food Science and Technology,2008,8(2):1-4.
[22] XU J,HU Q.Changes in γ-aminobutyric acid content and related enzyme activities in Jindou 25 soybean (Glycine max L.)seeds during germination[J].LWT-Food Science and Technology,2014,55(1):341-346.
[23] HONG K,PARK Y,SUH H J.Sleep-promoting effects of a GABA/5- HTP mixture:behavioral changes and neuromodulation in an invertebrate model[J].Life Sciences,2016,150:42-49.
[24] DIANA M,QUILEZ J,RAFECAS M.Gamma-aminobutyric acid as a bioactive compound in foods:a review[J].Journal of Functional Foods,2014,10:407-420.
[25] OKADA T,SUGISHITA T,MURAKAMI T,et al.Effect of the defatted rice germ enriched with GABA for sleeplessness depression,autonomic disorder by oral administration[J].Journal of the Japanese Society for Food Science and Technology,2000,47(8):596-603.
[26] DEEWATTHANAWONG R,NOCK J F,WATKINS C B.γ-Aminobutyric acid (GABA)accumulation in four strawberry cultivars in response to elevated CO2 storage[J].Postharvest Biology and Technology,2010,57(2):92-96.
[27] RAMESH S A,TYERMAN S D,GILLIHAM M,et al.γ-Aminobutyric acid (GABA)signalling in plants[J].Cellular and Molecular Life Sciences,2017,74(9):1577-1603.
[28] CAO S,CAI Y,YANG Z,et al.MeJA induces chilling tolerance in loquat fruit by regulating proline and γ-aminobutyric acid contents[J].Food Chemistry,2012,133(4):1466-1470.
[29] ZHOU M,NDEURUMIO K H,ZHAO L,et al.Impact of precooling and controlled-atmosphere storage on γ-aminobutyric acid (GABA)accumulation in longan (Dimocarpus longan Lour.)fruit[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry,2016,64(33):6443-6450.
[30] WU Z C,YANG Z Y,LI J G,et al.Methyl-inositol,gamma-aminobutyric acid and other health benefit compounds in the aril of litchi[J].International Journal of Food Sciences and Nutrition,2016,67(7):762-772.
[31] 蔡愈杭,王小曼,戴文君.HPLC法测定欧李果实中γ-氨基丁酸的含量[J].食品工业,2014,35(7):156-158.
CAI Y H,WANG X M,DAI W J.HPLC determination of γ-aminobutyric acid content in the fruit of Cerasus humilis[J].Food Industry,2014,35(7):156-158.
[32] PU Y F,SINCLAIR A J,ZHONG J J,et al.Determination of γ-aminobutyric acid (GABA)in jujube fruit (Ziziphus jujuba Mill.)[J].CyTA-Journal of Food,2019,17(1):158-162.
[33] RAMESH S A,TYERMAN S D,XU B,et al.GABA signaling modulates plant growth by directly regulating the activity of plant-specific anion transporters[J].Nature Communications,2015,6(1):1-9.
[34] SHELP B J,BOWN A W,MCLEAN M D.Metabolism and functions of gamma-aminobutyric acid[J].Trends in Plant Science,1999,4(11):446-452.
[35] YOON Y,KUPPUSAMY S,CHO K M,et al.Influence of cold stress on contents of soluble sugars,vitamin C and free amino acids including gamma-aminobutyric acid (GABA)in spinach (Spinaciaoleracea)[J].Food Chemistry,2017,215:185-192.
[36] WANG Y,LIU M,ZHAO L,et al.Influence of processing conditions on reducing γ-aminobutyric acid content during fortified milk production[J].Food Research International,2015,72:215-222.
[37] SANZ M L,DEL CASTILLO M D,CORZO N,et al.Formation of amadori compounds in dehydrated fruits[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry,2001,49(11):5228-5231.
[38] 曲泽州,王永蕙.中国果树志:枣卷[M].北京:中国林业出版社,1993.
QU Z Z,WANG Y H.China fruit tree:jujube[M].Beijing:China Forestry Press,1993.
[39] WU Q Y,MA S Z,ZHANG W W,et al.Accumulating pathways of γ-aminobutyric acid during anaerobic and aerobic sequential incubations in fresh tea leaves[J].Food Chemistry,2018,240:1081-1086.
[40] 程威威,周婷,吴跃,等.高效液相色谱法测定发芽糙米中γ-氨基丁酸含量[J].食品科学,2014,35(12):98-101.
CHENG W W,ZHOU T,WU Y,et al.HPLC analysis of γ-amino butyric acid in germinated brown rice[J].Food Science,2014,35(12):98-101.
[41] 吴琴燕,马圣洲,张文文,等.柱前衍生高效液相色谱法检测红茶中γ-氨基丁酸含量[J].江苏农业学报,2014(6):1534-1536.
WU Q Y,MA S Z,ZHANG W W,et al.Determination of γ-aminobutyric acid in black tea by high performance liquid chromatography with precolumn derivatization[J].Jiangsu Journal of Agriculture Science,2014(6):1534-1536.
[42] CHEN S,HO K,HSIEH Y,et al.Contents of lovastatin,γ-aminobutyric acid and ergothioneine in mushroom fruiting bodies and mycelia[J].LWT-Food Science and Technology,2012,47(2):274-278.
[43] LAMP A,KALTSCHMITT M,LUDTKE O.Improved HPLC-method for estimation and correction of amino acid losses during hydrolysis of unknown samples[J].Analytical Biochemistry,2018,543:140-145.
[44] 刘孟军,汪民.中国枣种质资源[M].北京:中国林业出版社,2009.
LIU M J,WANG M.Germplasm resources of Chinese jujube[M].Beijing:China Forestry Press,2009.
蒲云峰,男,副教授,博士,主要从事农产品加工与贮藏方面的研究;
侯旭杰,男,教授,主要从事农产品深加工技术及天然产物活性方面的研究。
X