雪樱子(Amaranthus caudatus L．)为苋科苋属一年生草本植物，学名为尾穗苋，别名老枪谷、仙人谷，其作为药食两用的植物在我国一些地区的地方药物志中已有记载[1]。近年来，因具有消肿止痛、抗肿瘤、抗溃疡[2-4]等功效而常用作保健蔬菜，逐渐被人们认识和青睐。

雪樱子作为一种药食价值较高的植物资源，国外相关学者已经对其营养价值、功能及活性开展了一定的研究。如Nascimento等[5]对阿根廷北部的雪樱子进行了微量元素的分析，Lamothe等[6]研究发现雪樱子膳食纤维富含果胶和木糖，Jo等[7]研究了尾穗苋单宁提取物的自由基清除能力。Kumar等[8]研究了尾穗苋甲醇提取物对扑热息痛致大鼠肝损伤有恢复作用。Plate等[9]研究发现雪樱子有助于血胆固醇过多的兔子降低低密度脂蛋白及总胆固醇，Kabiri等[10]研究发现雪樱子水醇提取物对高胆固醇血症家兔有抗脂肪条纹形成的作用。

相比国外而言，国内对雪樱子功能成分及功效的研究还较少。近年来，植物多糖作为一种功能物质因具有免疫调节、抗氧化、抗衰老、抗肿瘤、降血脂、抗病毒等多种活性功能[11-12]而成为研究热点。但国内关于雪樱子多糖的提取及功效方面的研究尚未见报道。文章以雪樱子为原料，运用水提醇沉法提取粗多糖，对提取和纯化工艺进行了优化，并对粗多糖的体外抗氧化活性进行研究。

1 材料和方法

1.1 材料与试剂

雪樱子，南京继红农业科技发展有限公司；HPD600型、D101型、AB- 8型大孔吸附树脂，上海源叶生物科技有限公司；所用其他试剂均为市售分析纯。

1.2 仪器与设备

Alpha- 1106型可见光分光光度计，上海谱元仪器有限公司；DDL- 5M型低速冷冻离心机，上海卢湘仪离心机仪器有限公司；TG16K- Ⅱ型高速离心机，长沙东旺实验仪器有限公司；EV351型旋转蒸发仪，莱伯泰科有限公司；MX- RL- Pro LCD型旋转混匀仪，大龙兴创(北京)实验仪器有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 雪樱子粗多糖提取工艺优化

1.3.1.1 原料处理

将新鲜雪樱子清洗干净，沸水漂烫30 s后用流水冷却沥干，在60 ℃恒温干燥箱中干燥8 h，随后粉碎，密封保存备用。

1.3.1.2 粗多糖的测定方法及标准曲线建立

参照文献[13-14]，采用苯酚- 硫酸法测定粗多糖，配制不同质量浓度葡萄糖标准溶液绘制标准曲线，吸光度(Y)与质量浓度(X)的线性方程为：Y=15.998X-0.002(R2 =0.998)，质量浓度范围：0.008～0.036 mg/mL。

1.3.1.3 雪樱子粗多糖提取

参照文献[15]并进行适当修改，采用水提醇沉法进行粗多糖的提取。称取一定量准备好的原料加入纯水于一定温度条件下浸提，抽滤取滤液，随后在滤液中加入乙醇进行醇沉静置处理12 h，将静置液离心(4 000 r/min，4 ℃, 10 min)弃去上清液，得到雪樱子粗多糖提取物固体。

1.3.1.4 雪樱子粗多糖得率计算

将粗多糖提取物加纯水定容至25 mL，测定吸光度，参照标准曲线计算粗多糖得率，见式(1)。

ω(粗多糖)=ρ(粗多糖)×V/m(样品)。

(1)

式(1)中，ω(粗多糖)为粗多糖得率，mg/g；ρ(粗多糖)，mg/mL；V，25 mL；m(样品)，g。

1.3.1.5 提取工艺单因素实验设计

分别研究了水提过程中料液比、提取温度、提取时间以及醇沉过程中乙醇浓度对雪樱子粗多糖提取率的影响。以料液比(g/mL)1∶25、水提温度80 ℃、提取时间4 h作为水提工艺参数，比较不同浓度的乙醇对醇沉过程的影响；固定水提温度为80 ℃、提取时间为4 h、分析不同料液比对提取率的影响；固定水提过程料液比(g/mL)为1∶25，提取时间为4 h，分析不同温度对提取率的影响；固定水提过程料液比(g/mL)为1∶25，提取温度为90 ℃，分析不同提取时间对提取率的影响。

1.3.1.6 提取工艺正交试验设计

根据单因素实验结果确定醇沉过程乙醇的优化浓度，在正交试验中只分析水提过程中料液比(A)、提取温度(B)、提取时间(C)3种因素对雪樱子粗多糖得率的影响，每个因素分为3个水平，建立三因素三水平正交试验，因素水平表见表1。

1.3.2 雪樱子粗多糖纯化工艺优化

1.3.2.1 大孔吸附树脂的筛选

将AB- 8型树脂浸泡在3～5 g/mL氢氧化钠溶液中24 h，用3倍于树脂体积的同质量浓度的氢氧化钠溶液冲洗抽滤，再将树脂用纯净水冲洗至中性，用2～3倍树脂体积的体积分数95%乙醇洗柱，最后用纯水洗去乙醇，备用。

将HPD600型及D101型树脂在高于树脂层10 cm的95%乙醇溶液中浸泡4 h，去除浸泡液，用纯水冲洗树脂直到冲洗液在试管中用水稀释后不会变浑浊以及冲洗液紫外光谱扫描无吸收峰为止。再用水洗涤至无醇味，备用。

将1.3.1.3节得到的雪樱子粗多糖固形物配制成0.1 mg/mL左右的雪樱子多糖水溶液，取该溶液30 mL、处理好的大孔吸附树脂2 g于50 mL离心管中，置于旋转混匀仪上吸附12 h后进行抽滤，将滤液定容测定多糖质量浓度。将抽滤后的树脂置于干燥的50 mL离心管中，加入25%乙醇溶液30 mL，放入旋转混匀仪上解吸12 h, 抽滤后将滤液定容测定多糖质量浓度。计算不同树脂的吸附量、吸附率、解吸率、回收率[16]，筛选出效果最佳的大孔吸附树脂，计算见式(2)～式(5)。

(2)

(3)

(4)

R=AD。

(5)

式(2)～式(5)中：Q，吸附量，mg/g；ρ0，上样液质量浓度，mg/mL；ρ1，吸附液质量浓度，mg/mL；V，多糖样液体积，mL；m，树脂质量，g；A，吸附率，%；D，解吸率，%；ρ2，解吸液质量浓度，mg/mL；R，回收率，%。

1.3.2.2 纯化工艺单因素实验设计

固定上样液pH值4，吸附速率2 BV/h，乙醇洗脱剂体积分数25%，洗脱速率2 BV/h，进行动态吸附和解吸实验，分析上样液质量浓度对纯化效果的影响；固定上样液质量浓度为0.9 mg/mL，吸附速率2 BV/h，乙醇洗脱剂体积分数25%，洗脱速率2 BV/h，进行动态吸附和解吸实验, 分析上样液pH值对纯化效果的影响；固定上样液质量浓度为0.9 mg/mL，上样液pH值4，乙醇洗脱剂体积分数25%，洗脱速率2 BV/h，进行动态吸附和解吸实验, 分析吸附速率对纯化效果的影响；固定上样液质量浓度为0.9 mg/mL，上样液pH值4，吸附速率2 BV/h，洗脱速率2 BV/h，分析洗脱时乙醇浓度对纯化效果的影响；固定上样液质量浓度为0.9 mg/mL，吸附液pH值4，吸附速率2 BV/h，乙醇洗脱剂体积分数25%，分析洗脱速率对纯化效果的影响。

1.3.2.3 纯化工艺正交试验设计

根据单因素分析的结果，确定上样液质量浓度、上样液pH值、乙醇洗脱剂体积分数作为正交试验的3个因素，采用三因素三水平正交试验。因素水平表见表2。

1.3.3 雪樱子粗多糖体外抗氧化活性测定

1.3.3.1 羟自由基清除能力测定

采用Fenton体系·OH清除法，参照文献[17]并适当改动：取0.2 mol/L pH值7.4磷酸盐缓冲溶液1 mL、0.52 mg/mL番红溶液0.2 mL，0.2 mol/L EDTA二钠溶液0.5 mL, 0.2 mol/L FeSO4溶液0.5 mL，不同质量浓度的样品溶液(维生素C或粗多糖溶液)7 mL、超纯水0.8 mL，混匀，然后在40 ℃水浴加热30 min，测定520 nm处吸光度，记为A参比；用体积分数0.3%双氧水溶液代替上述操作中的超纯水，重复操作，测定520 nm处吸光度，记为A样液；用超纯水代替A样液操作中的样品溶液，测定520 nm处吸光值，记为A羟基；用超纯水代替A参比操作中的番红溶液及样品溶液，测定520 nm处吸光值，记为A空白。羟自由基清除率计算见式(6)。

羟自由基清除率

(6)

1.3.3.2 超氧阴离子自由基清除能力测定

采用邻苯三酚自氧化法，参照文献[18]并适当改动：取4支试管，分别标注为1、2、3、4号。在1、2号管里分别加入超纯水1 mL，50 mmol/L pH值8.2 Tris- HCL缓冲液3 mL，在3号管里加入100 mmol/L HCl 1 mL，在4号管里加入5 mmol/L邻苯三酚1 mL。将4支管放入25 ℃水浴锅里保温10 min，然后将3号管中溶液倒入1号管里，4号管中溶液倒入2号管里，迅速混匀，在325 nm处测5 min内吸光度A0的变化。根据A0绘图得到邻苯三酚自氧化速率K0。按照上述步骤将1、2号管里的超纯水替换成不同质量浓度的样品溶液(维生素C或粗多糖溶液)。放入25 ℃水浴锅里保温10 min后迅速混匀。测5 min内吸光度A1的变化。根据A1绘图得到分光光度值变化速率K1。超氧阴离子自由基清除率计算见式(7)。

超氧阴离子自由基清除率

(7)

1.3.3.3 DPPH自由基清除能力测定

参照文献[19]并适当改动：取3支比色管分别标为管1、管2、管3，管1中加入1 mL 0.2 mmol/L DPPH- 乙醇溶液及3 mL无水乙醇；管2中加入1 mL 0.2 mmol/L DPPH- 乙醇溶液及3 mL样品溶液(维生素C或雪樱子粗多糖溶液)；管3中加入1 mL无水乙醇溶液及3 mL样品溶液(维生素C或雪樱子粗多糖溶液)在暗处静置30 min，用分光光度计在517 nm 处测其吸光度，分别记为A0，AX，AX0。用4 mL无水乙醇作为空白对照。DPPH自由基清除率计算见式(8)。

DPPH自由基清除率

(8)

1.3.4 数据分析

实验采取3次平行，结果表示为平均值±标准偏差，采用IBM SPSS Statistics 22.0 软件进行统计分析，采用Adobe Illustrator 软件绘图。

2 结果与分析

2.1 雪樱子粗多糖提取工艺优化结果

2.1.1 雪樱子粗多糖提取工艺单因素实验结果

乙醇体积分数、料液比、提取时间、提取温度对提取效果的影响见图1。

由图1(a)可以看出，随着乙醇体积分数的增加，粗多糖得率上升，并在80%时达到最大，乙醇体积分数继续增加，粗多糖得率下降；这可能是由于乙醇浓度过高对粗多糖产生了一定的破坏作用。因此确定醇沉过程乙醇体积分数为80%。

由图1(b)可以看出, 粗多糖得率随料液比下降而提高，当液料比(g/mL)达到1∶25时，粗多糖得率达到最大值，继续降低料液比则粗多糖得率降低；这可能是提取过程中增加提取液的比例可以在一定程度上促进物料与提取液充分接触，从而提高提取效率，当溶剂达到一定的量后形成饱和，继续增加提取剂的体积则可能会在加热提取过程中造成多糖损失，同时增加能耗，加大后续多糖溶液浓缩的能耗和回收难度。因此选择料液比(g/mL)为1∶20、1∶25、1∶30作为后续正交试验料液比水平。

由图1(c)可以看出，随着温度的不断升高，粗多糖得率逐渐升高，这可能是温度的升高促进分子运动，加速了多糖的浸出。当温度达到95 ℃时粗多糖得率最高，而且粗多糖得率呈现随着温度上升而继续升高的趋势，考虑到实验温度条件如果继续上升，将会造成提取体系的沸腾继而引发提取剂的大量挥发，并对实验条件提出更高的要求。因此选择80、90、95 ℃作为后续正交试验温度水平。

由图1(d)可以看出，当提取时间不断增加时，粗多糖得率也在逐步增大，当提取时间达到5 h时，粗多糖得率达到最大值，如果再继续增大提取时间则粗多糖得率趋于稳定。即使延长提取时间至24 h，粗多糖得率提高程度也不明显。因此，选择4、5、6 h作为提取时间的因素水平。

2.1.2 雪樱子粗多糖提取工艺正交试验结果

水提过程是影响水提醇沉法粗多糖得率的主要步骤，以单因素实验结果为基础，选择料液比(A)、提取温度(B)、提取时间(C)作为正交试验因素，以粗多糖得率为指标进行数据分析，结果见表3。

结果表明，各因素对粗多糖提取效果的影响由大到小依次为提取温度、提取时间、料液比。利用IBM SPSS 方差分析表明提取温度对雪樱子粗多糖得率影响极显著(P<0.01)，提取时间对雪樱子粗多糖得率影响显著(P<0.05)，提取料液比对雪樱子粗多糖得率影响不显著(P>0.05)。正交试验设计得出优化工艺条件为：料液比(g/mL)1∶30、提取温度95 ℃、提取时间6 h。按照上述步骤进行实验，平行3次，所得结果与A1B3C3结果用SPSS 22.0进行差异性分析。结果显示差异不显著(P>0.05)。考虑能源消耗、资源节约以及经济成本等影响因素，最终确定优化工艺条件为A1B3C3，即料液比(g/mL)1∶20，提取温度95 ℃，提取时间6 h，此条件下雪樱子多糖得率为(1.421±0.081) mg/g。

2.2 雪樱子粗多糖纯化工艺优化结果

2.2.1 大孔吸附树脂的确定

AB- 8型非极性树脂的静态吸附率达到40.52%±0.67%，高于HPD600型及D101型，AB- 8型的静态解吸率达到80.94%±0.93%，高于D101型，虽低于HPD600型，但与之差异不显著，AB- 8型回收率高于其他2种树脂(见图2)。因此选择AB- 8型大孔吸附树脂。

2.2.2 雪樱子粗多糖纯化工艺单因素实验结果

雪樱子粗多糖纯化工艺单因素实验结果见图3。由图3(a)可以看出，吸附率随着上样液质量浓度的增大而提高，当上样液质量浓度达到0.89 mg/mL时，吸附率达到66%左右，此时吸附率最大，树脂对多糖的吸附达到饱和状态；若上样液质量浓度继续增加，吸附率反而会降低。这很可能是因为树脂吸附能力有限，且有其他杂质对树脂吸附多糖造成干扰。从图3(b)中可以得出，随着pH值的升高，吸附率增加，当pH值为4时，吸附率最大，而继续升高pH值，吸附率反而降低，这可能是因为多糖结构受到破坏。从图3(c)中可以得出，随着吸附流速的增大，吸附率逐渐降低。这可能是因为，吸附时间越长，大孔树脂和上样液接触的时间越长，吸附效果越好；反之，大孔树脂和上样液接触的时间过短则导致多糖不能被充分吸附，但是若吸附速率过慢，则作业周期长，且树脂再生能力差[16]。因此综合考虑，选择适宜的吸附速率2 BV/h。从图3(d)可以看出，解吸率随着乙醇洗脱剂体积分数的增加而增加；当乙醇洗脱剂体积分数为25%时，解吸率为65%左右，此时解吸率达到最大；后来解吸率随着乙醇洗脱剂体积分数的增加而减少，这可能是因为乙醇体积分数过大，会破坏多糖结构。从图3(e)可以看出，解吸率随着洗脱流速的增加而降低。这可能是因为，流速过快使得乙醇与多糖不能充分接触，不能有效地将多糖从树脂上洗脱下来，流速慢则纯化需要的作业周期长，综合考虑流速选择2 BV/h。

根据上述结果，固定吸附流速、洗脱流速均为2 BV/h，确定以回收率为评价指标，以上样液质量浓度0.67、0.89、1.00 mg/mL，上样液pH值3、4、5，乙醇洗脱剂体积分数15%、25%、35%，作为下一步工艺优化的正交试验水平。

2.2.3 雪樱子粗多糖纯化工艺正交试验结果

实验结果表明：各因素对粗多糖纯化回收率的影响由大到小依次为pH值、乙醇洗脱剂体积分数、上样液质量浓度。利用IBM SPSS 22.0数据分析结果表明，pH值、乙醇洗脱剂浓度对雪樱子粗多糖纯化回收率影响极显著(P<0.01)，上样液质量浓度对雪樱子粗多糖纯化回收率影响显著(P<0.05)。正交试验得出优化工艺条件为：吸附流速、洗脱流速均2 BV/h，上样液质量浓度1.00 mg/mL，上样液pH值5，乙醇洗脱剂体积分数25%，即A3B3C2。此条件下回收率为44.99%±1.23%。

2.3 雪樱子粗多糖体外抗氧化活性测定结果

将得到的雪樱子粗多糖按比例稀释进行体外抗氧化能力检测，并与维生素C的抗氧化能力进行对比，结果如图4。

由图4(a)可知，随着雪樱子多糖质量浓度的增加，其对羟自由基的清除率增大，达到0.16 mg/mL后清除率趋于平稳， 0.02～0.20 mg/mL的雪樱子多糖对羟自由基的清除率在49.58%～92.20%，经过回归分析计算，其IC50为0.019 mg/mL。相比之下，0.2 mg/mL的维生素C对·OH清除率只有22.86%，显然，雪樱子粗多糖对羟自由基的清除能力优于维生素C。

由图4(b)可知，随着雪樱子多糖质量浓度逐渐增加，其对超氧阴离子自由基的清除率逐渐增大，达到0.08 mg/mL后清除率趋于稳定，0.01～0.10mg/mL的多糖对超氧阴离子的清除率在48.74%～90.88%，经过回归分析计算，其IC50为0.014 mg/mL。相比之下，雪樱子粗多糖对超氧阴离子自由基的清除能力弱于维生素C。

由图4(c)可知，随着雪樱子多糖质量浓度逐渐增加，其对DPPH自由基的清除率逐渐增大， 达到0.04 mg/mL后清除率趋于稳定， 0.005～0.08 mg/mL的多糖对DPPH· 的清除率在29.58%～80.28%，经过回归分析计算，其IC50为0.013 mg/mL。相比之下，雪樱子粗多糖对DPPH·的清除能力明显优于维生素C。

通过上述比较可知，雪樱子粗多糖具有较好的抗氧化活性，且随着质量浓度增大活性增强，对羟自由基、DPPH自由基的清除能力优于维生素C。

3 结 论

对雪樱子粗多糖的提取工艺进行了优化，得到优化工艺条件为：乙醇体积分数80%、料液比(g/mL)1∶20、提取温度95 ℃、提取时间6 h，此条件下粗多糖得率为(1.421±0.081) mg/g。分析了几种树脂对雪樱子粗多糖的纯化效果，对雪樱子粗多糖纯化工艺进行了优化，雪樱子多糖优化纯化工艺条件为：采用AB- 8型吸附树脂，上样液质量浓度1.00 mg/mL，上样液pH值5，吸附速率2 BV/h，乙醇洗脱剂体积分数25%，洗脱速率2 BV/h，此条件下回收率达到44.99%±1.23%。采用羟自由基清除率、超氧阴离子自由基清除率、DPPH自由基清除率为体外抗氧化活性检测指标，其IC50分别为0.019、0.014、0.013 mg/mL。并将其抗氧化能力与维生素C相比较，证实了雪樱子粗多糖具有良好的自由基清除能力。

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Study on Extraction, Purification and Antioxidant Properties of Crude Polysaccharide from Amaranthus caudatus L.

YAO Hongliang, KONG Congcong, YAN Yuhua

(Food Science Department, Jingling Institute of Technology, Nanjing 210038, China)

Abstract： The crude polysaccharide from Amaranthus caudatus L. was extracted by water extraction and alcohol sedimentation method then purified by AB- 8 resin. The extraction and purification process was optimized by single factor experiment and orthogonal experiment. Then the antioxidant properties in vitro was measured using hydroxyl radical scavenging activity, superoxide radical scavenging activity and DPPH radical scavenging activity compared with vitamin C. The result showed that optimized extraction condition was ethanol concentration 80%, ratio of solid to liquid (g/mL) 1∶20, extraction temperature 95 ℃, extraction time 6 h. While optimized purification condition was adsorbent concentration 1.00 mg/mL, pH value of adsorbent 5, adsorption flow speed 2 BV/h, ethanol concentration 25%, and elution flow speed 2 BV/h. Under these optimized conditions, the yield of crude polysaccharide was (1.421±0.081) mg/g and the recovery ratio of purification was 44.99%±1.23%. Also the antioxidant detection experiment showed that the crude polysaccharide from Amaranthus caudatus L.performed good antioxidant properties in vitro.

Keywords： Amaranthus caudatus L.； crude polysaccharide; extraction; purification; antioxidant properties

中图分类号： TS218; R284.2

文献标志码：A

doi:10.3969/j.issn.2095-6002.2019.02.015

文章编号：2095-6002(2019)02-0102-09

引用格式：姚宏亮，孔聪聪，颜玉华.雪樱子粗多糖提取、纯化工艺及抗氧化活性研究[J]. 食品科学技术学报，2019,37(2):102-110.

YAO Hongliang, KONG Congcong, YAN Yuhua. Study on extraction, purification and antioxidant properties of crude polysaccharide from Amaranthus caudatus L.[J]. Journal of Food Science and Technology, 2019,37(2):102-110.

收稿日期： 2018-11-06

基金项目： 江苏省农业科技自主创新资金项目(CX(17)3035); 金陵科技学院高等教育人才培养创新实验基地建设项目；金陵科技学院校级“创客”虚拟班建设项目(2017ck009； 2017ck008)。

第一作者： 姚宏亮，男，副教授，博士研究生，主要从事食品安全、食品功能性成分及功能产品开发方面的研究。

(责任编辑：张逸群)