DOI:10.3969/j.issn.2095-6002.2018.06.009
中图分类号:TS254.4
刘佳秀, 查振兴, 于文溪, 董雪, 王勋, 妥彦峰
| 【作者机构】 | 大连工业大学食品学院 |
| 【分 类 号】 | TS254.4 |
| 【基 金】 | 大连工业大学大学生创新创业项目(201710152066) |
中国水产品资源丰富,2016年全国水产品总产量已达6 901.25万t[1]。水产品中含有高蛋白,以及能够减少心血管疾病的不饱和脂肪酸,除此之外还含有人体所需重要矿物质以及维生素,因此深受消费者的青睐[2]。然而高含量的小分子含氮化合物,以及适合病原菌和腐败菌生长的中性pH值环境,使水产品成为一种极易腐败的食品,腐败后的水产品质量下降,造成经济损失[3]。
在鱼类运输及销售过程中必须有一定的保鲜手段,我国当下主要使用化学和物理保藏方式,其中化学,如亚硝酸盐,对人体有一定的危害[4-5];物理保鲜中冷冻在解冻后会造成汁液外渗,而高温处理会造成食品感官缺陷[6]。天然、安全的保鲜方式受到消费者欢迎。乳酸菌广泛存在于发酵食品以及人和动物的肠道内,是一种普遍认为安全的微生物[7]。而且乳酸菌具有广泛的抑菌谱,利用乳酸菌防止食品中腐败菌生长具有悠久的历史和优良的保藏效果[5,8]。利用乳酸菌作用生物保鲜剂对鱼肉进行保鲜也受到了广泛的关注[7,9],但缺乏系统性。乳酸菌应用于水产品的保鲜,其对鱼肉中常见有害菌生长的抑制作用、对鱼肉的潜在致腐性是作为筛选鱼肉生物保鲜剂的前提[10]。
文章研究了大连市益生菌功能特性研究重点实验室保藏的海洋鱼类来源乳酸菌对鱼肉中常见有害菌的抑菌特性及其对鱼肉的潜在致腐性,筛选出3株高抑菌性的乳酸菌,并研究了乳酸菌防止有害菌腐败鱼肉的潜在特性。
1.1.1 材料与试剂
黄花鱼,大连市乐购超市;阿拉伯胶(分析纯),上海源叶生物试剂有限公司;硼酸、碳酸钾(分析纯),天津大茂化工厂;LB、MRS培养基,北京奥博星生物技术有限公司。
1.1.2 仪器与设备
S210- K型SEVENCOMPACT pH计,Mettler Toledo仪器有限公司;Multiskan GO型酶标仪,赛默飞世尔科技(中国)有限公司;FS- 1C- 50型冷冻离心机,德国HERMLE Labortechnik GmbH公司。
1.1.3 实验菌株
实验中使用乳酸菌(LABs)以及指示菌如表1。所用乳酸菌均由大连市益生菌功能特性研究重点实验室分离自海洋鱼类,并经过16S rRNA序列分析鉴定。
表1 乳酸菌和指示菌信息以及培养条件
Tab.1 Information and culture conditions of LABs and indicator bacteria
种名编号及来源培养条件乳酸菌Lactobacillus plantarumLactobacillus caseiY12/ 本实验室分离保藏Y37/本实验室分离保藏Y42/本实验室分离保藏Y44/本实验室分离保藏Y3-1/本实验室分离保藏Y4/本实验室分离保藏MRS培养基37℃培养18h,活化2代,待用致病菌Listeria monocytogenesCCTCC AB 209106/本实验室购买保藏Salmonella entericaCCTCC AB 99003/本实验室购买保藏Staphylococcus aureusATCC 25923/本实验室购买保藏Vibrio parahaemolyticusATCC 33847/本实验室购买保藏LB培养基37℃培养18h,活化2代,待用腐败菌Serratia marcescensATCC 14041/本实验室购买保藏Pseudomonas spp.H6/大连工业大学食品学院侯红漫教授课题组分离保藏Aeromonas hydrophilaATCC 51307/本实验室购买保藏LB培养基37℃培养18h,活化2代,待用
1.2.1 乳酸菌抑菌实验
采用平板扩散法测定备选乳酸菌对指示菌生长的抑制作用。乳酸菌处理:将培养至第2代的乳酸菌OD600值调至1.0左右,按照2%接种量进行接种,100 μL菌悬液接种于5 mL MRS液体培养基中,37 ℃培养18 h后,将乳酸菌培养液离心(8 000r/min,10 min,4 ℃)得上清液(CFS),备用。
指示菌处理:将传代3代的致病菌OD600值调节至0.25左右,按照2%接种量,将致病菌接入分装好的20 mL LB固体培养基中,摇匀、备用。
培养基制备:在平板底部铺上15 mL左右的素琼脂(2 g琼脂/100 mL去离子水),晾干;放置牛津杯,每个平板中放置4个;将含有指示菌的LB固体培养基倾注到平板中,晾干1 h;每个孔接入200 μL乳酸菌CFS,37 ℃培养2 d,使用游标卡尺测量抑菌圈大小;所有实验做3次平行。
1.2.2 菌悬液及鱼块的制备方法
乳酸菌菌悬液制备:将4 ℃保藏的乳酸菌经MRS肉汤活化2代,梯度稀释进行菌落计数,根据平板计数结果,使用灭菌生理盐水将活化好的乳酸菌进行稀释,获得不同浓度的乳酸菌菌悬液。
黄花鱼鱼块制备:将从大连市超市购买的黄花鱼去骨,去尾,去除内脏,用无菌蒸馏水进行清洗。将鱼肉切割成10 g左右的生鱼片,将各个样品在其相对应的乳酸菌菌悬液中浸渍30 min,取出沥干3~5 min,放入经过高温灭菌的培养皿,外部使用体积分数75%酒精灭菌保鲜膜覆盖,放入4 ℃的冰箱储存。实验过程中器具事先用75%酒精进行消毒。
1.2.3 灭菌鱼汁的制备方法
根据Leroi等[9]的方法略有修改。取处理好的鱼块,使用打浆机打成泥状;以m(蒸馏水)∶m(鱼泥)=2∶1混匀,将混合物煮沸2 min;使用四层纱布进行过滤,得到滤液;鱼汁滤液在105 ℃下灭菌10 min,在-20 ℃下储存,使用前4 ℃下解冻使用。
1.2.4 pH值测定方法
pH值使用pH计测定。
1.2.5 挥发性盐基氮测定方法
根据GB 5009.228—2016《食品安全国家标准 食品中挥发性盐基氮的测定》[10]中描述的微量扩散法进行挥发性盐基氮(total volatile basic nitrogen, TVBN)测定。
1.2.6 鱼汁感官评价方法
根据Macé等[11]的方法略有修改:在实验室选6名具有食品感官评定专业知识的学生,经过培训后,作为感官评定人员对接种乳酸菌的鱼汁进行感官评定。所有的鱼汁样品保存在灭菌试管中,保证其原有的风味物质。每次评定每种乳酸菌平行实验3组,进行随机标号,随机分配给6名评定人员进行评分,分数10~1分不等。未接入乳酸菌的鱼汁作为空白对照。腐败程度:Ⅰ未腐败(10~9)、Ⅱ略微腐败(8~7)、Ⅲ中度腐败(6~5)、Ⅳ严重腐败(4~1),其中6为不可接受限。
1.2.7 鱼肉感官评价方法
鱼肉感官评价根据黄晓春等[12]略有修改。黄花鱼肉以色泽、气味、组织形态和肌肉弹性为检验项目,分值分别为10~1分制,感官接受程度越高得分越高,以生鱼片5项得分的平均值为鱼肉感官评定结果,其中6分作为感官不可接受限。
1.2.8 数据处理及绘图
使用SPSS 22.0进行数据处理,Origin Pro 8.5进行绘图。
灭菌鱼汁在计数平板上,达到无菌的状态,保证添加的菌种只有L. plantarum Y12和Pseudomonas spp.,排除干扰,防止了其他杂菌的污染。
研究所用乳酸菌对7种鱼肉中常见有害菌生长具有不同程度的抑制作用,结果见表2。其中对致病菌V. parahaemolyticus有明显的抑制效果;对腐败菌A.hydrophila的抑制效果最好,其次为S. marcescens,而对Pseudomonas spp.的抑制作用不如其他2株腐败菌明显。经测定不同乳酸菌MRS发酵液pH值均为3.85左右,因此乳酸菌主要通过有机酸对有害菌生长产生抑制作用。使用SPSS 22.0进行主成分分析(PCA),得分见表2,其中主成分得分最高的为L. plantarum Y12,其次为L. plantarum Y42以及L. plantarum Y3-1。
表2 平板扩散法测定LABs的抑菌能力
Tab.2 Antimicrobial activity of LABs determined by well-diffusion assay
d(抑菌圈)/mm上清液pHV.parahaemolyticusL.monocytogenesS. aureusS. entericaPseudomonasspp.A.hydrophilaS. marcescensPCA得分Y43.80++++++++++++++0.1756Y123.85+++++++++++++++++++1.7115Y373.89+++++++++++++-0.8474Y423.89++++++++++++++++0.8453Y443.89+++++++++++++++-1.1220Y3-13.83+++++++++++++++++0.6117
“+”抑菌圈直径≤15 mm, “++”抑菌圈直径在15~17.5 mm,“+++”抑菌圈直径在17.5~20 mm。
鱼类、贝类等水产品表面有丰富的微生物群落,其中含有危害食品安全的致病菌以及使食品腐败变质的腐败菌,尤其是水产品中特定腐败菌[13]。Arena等[14]研究发现79株不同来源的植物乳杆菌发酵上清液对L.monocytogenes以及S. aureus有很好的抑制作用。季红等[15]对10株L. plantarum的抑菌性能进行研究,其中L. plantarum ST-III所产的类细菌素物质能够抑制S. enterica以及S. aureus,并且在pH值5.0~6.5最为明显。细菌素是乳酸菌产生的一种抑菌大分子,但乳酸菌产生的细菌素类物质通常在低pH值条件下发挥抑菌作用[4,16]。文中6株从海鱼中分离的乳酸菌有广泛的抑菌谱,能够抑制7种鱼肉中常见的有害菌,但对不同菌株的抑制作用有所差异,可能与乳酸菌菌株所产的抑菌物质不同有关系。
将初筛获得抑菌性较好的菌株L. plantarum Y12、Y42、Y3-1,制备浓度为107 CFU/mL的菌悬液,将黄花鱼块浸渍于菌悬液10 min,于4 ℃保藏8 d,测定保藏期间鱼肉pH值及挥发性盐基氮含量的变化,结果如图1、图2。
根据图1和图2,接入乳酸菌的鱼肉pH值较未接乳酸菌的稍低,变化不显著(p>0.05)。在保藏第3天时,ω(TVBN)小于10 mg/100 g,属于一级鲜肉;第6天,未接菌的鱼肉ω(TVBN)高达(18.45±0.24)mg/100 g,接入L. plantarum Y12、Y3-1、Y42的鱼肉ω(TVBN)分别为(12.39±0.10)、(15.07±0.25)、(15.15±0.12)mg/100 g,说明乳酸菌没有腐败鱼肉,反而能够抑制鱼肉腐败变质。在第7天时,接菌和未接菌的鱼肉的ω(TVBN)都超过国家标准(30 mg/100 g)[17],鱼肉已经开始腐败。在第8天时,其中浸渍L. plantarum Y12菌悬液的鱼肉ω(TVBN)为(38.91±0.20)mg/100 g,低于空白组(49.87±0.40) mg/100 g(p<0.05)。在整个保藏期内L. plantarum Y12不腐败鱼肉,并且展现了良好的保鲜能力,因此选择L. plantarum Y12进行后续实验。
图1 乳酸菌处理鱼肉中pH值变化
Fig.1 pH evolution in fresh fish meat juice at 4 ℃
图2 乳酸菌处理鱼块中TVBN值变化
Fig.2 Changes of TVBN in fresh fish meat juice at 4 ℃
近年来有学者发现,在食品腐败的后期,乳酸菌是其中主要的腐败菌,尤其是气调包装后期。判断乳酸菌是否能够应用于食品中,应该考虑其是否对食品有一定的致腐性[7,18],因此在保鲜实验之前,必须探究其是否对鱼肉本身具有致腐性。Wiernasz等[19]在鱼汁中观察了35株乳酸菌的致腐性,发现乳酸菌对鱼肉没有致腐作用。Macé等[20]在鲑鱼中分离出的Lactococcus piscium未造成鲑鱼腐败。乳酸菌存在于鱼肉中,在自身的生长繁殖过程中,产生乳酸等酸性物质,pH值的测定是乳酸菌应用于保鲜中一个指标。很多研究表明,乳酸菌能够有效地延长食品的保质期,但是却造成食品的酸化[21-22]。本实验整个保藏过程中和空白相比,3株乳酸菌没有酸化鱼肉的趋势(p>0.05),也未引起鱼肉腐败。
分别制备4组新鲜的鱼汁,乳酸菌组鱼汁中接种体积分数2%、浓度为107 CFU/mL的L. plantarum Y12菌悬液;Pseudomonas spp.组接种体积分数2%、浓度为105 CFU/mL的Pseudomonas spp.菌悬液;混合培养组分别接种体积分数2%,浓度分别为107、105 CFU/mL的Y12菌悬液以及Pseudomonas spp.菌悬液; 空白组不接入任何微生物。各组鱼汁于8 ℃下保藏6 d,保藏期内鱼汁pH值和TVBN值变化分别见图3、图4。
研究乳酸菌的保鲜性能,灭菌的食品是一种理想的模型。根据图3,未接入微生物的对照组鱼汁由于无菌条件,在保藏的6 d里pH值始终处于6.9左右,且没有变化(p>0.05)。单独接种L. plantarum Y12的鱼汁全程pH值保持6.6左右,较第0天pH值6.9,有显著下降(p<0.05)。腐败菌单独培养的鱼汁pH值和空白相比有显著下降(p<0.05)。乳酸菌和腐败菌混合培养的鱼汁整个保存过程中pH值先下降、再逐步上升,可能由于前期乳酸菌生长产酸pH值降低,后期腐败菌繁殖,鱼肉中的蛋白质降解产生氨类物质,导致pH值上升。结合感官评定(见表3),单独接种L. plantarum Y12的鱼汁pH值降低,但没有造成鱼汁不良感官变化,该结论和Fall等[23]的研究相似。
图3 8 ℃下灭菌鱼汁中pH值随时间的变化
Fig.3 pH evolution in sterilized fish juice at 8 ℃
根据图4,第2天和第3天的混合培养的鱼汁中由于L. plantarum Y12产生有机酸等抑菌物质,ω(TVBN)分别为(10.36±1.00)mg/100 g和(10.79±1.61)mg/100 g;Pseudomonas spp.单独培养鱼汁中,第2天和第3天的ω(TVBN)分别为(15.33±0.00)mg/100 g和(17.03±0.40)mg/100 g,均显著高于混合培养组(p<0.05)。第5天,Pseudomonas spp.组ω(TVBN)为(29.09±0.60)mg/100 g,和国家鲜肉标准30mg/100 g没有显著差异(p>0.05);混合培养组ω(TVBN)为(24.55±1.00)mg/100 g,显著低于国家鲜肉标准30 mg/100 g(p<0.05)。唐文静等[24]在对冷藏海鲈鱼鱼块的保鲜实验中发现乳酸菌能够明显抑制鲈鱼块中腐败菌的生长,降低了TVBN含量,和本文结果相似。根据图3和图4,鱼汁在保藏过程中,和腐败菌单独培养相比,混合培养的pH值降低,TVBN含量增加较慢,可能由于pH值的降低抑制了Pseudomonas spp.的生长繁殖,从而降低了腐败程度。
图4 8 ℃下鱼汁中TVBN值随时间的变化
Fig.4 Changes of TVBN in sterilized fish juice at 8 ℃
将L.plantarum Y12及Pseudomonas spp.接种于灭菌鱼汁,进行感官评定,结果见表3。在保存过程中,对照组鱼汁在6 d保藏过程中鱼腥味都非常明显,但是随着时间的延长鱼汁的味道变淡;和对照组不同的是,接种Y12的鱼汁会有酸味,结合图3,鱼汁的pH值有一定下降,可能是由于L.plantarum Y12产酸造成这种酸味,这种酸度是被评价人员接受的。接种Pseudomonas spp.的鱼汁在第1天时鱼腥味和对照没有区别,第2天开始鱼腥味仍然明显,但是从第3天开始,鱼汁逐渐产生让人无法接受的臭味,在保藏的最后一天,味道刺鼻已经无法进行感官评定;混合培养的鱼汁在前3 d感官评价分数较高,异味不明显,第4天时候才出现异味,原因可能是后期腐败菌生长,L.plantarum Y12抑制能力逐渐减弱,感官评价分数也随之降低。
表3 灭菌鱼汁在8 ℃条件下保藏6 d的感官评价结果
Tab.3 Sensory evaluation of sterilized fish juice preserved at 8 ℃ for 6 days
t/d评价得分/感官描述对照L. plantarum Y12Pseudomonas spp.混合培养110/未腐败,鱼腥味10/未腐败,鱼腥味9/未腐败,鱼腥味、无明显臭味9/未腐败,鱼腥味210/未腐败,鱼腥味10/未腐败,鱼腥味7/轻度腐败,略臭9/未腐败,轻微鱼腥味310/未腐败,鱼腥味9/未腐败,鱼腥味较重,略微酸,不影响感官7/轻度腐败,较前2d臭味明显8/轻度腐败,略臭49/未腐败,鱼腥味较重9/未腐败,鱼腥味变淡,略微酸,不影响感官5/中度腐败,同第3天,没有明显变化7/轻度腐败,略臭59/未腐败,鱼腥味较重9/未腐败,鱼腥味变淡,略微酸,不影响感官2/重度腐败,刺鼻臭味5/中度腐败,较第4天加重69/未腐败,鱼腥味变淡9/未腐败,鱼腥味变淡,略微酸,不影响感官1/重度腐败,刺鼻臭味,无法进行感官评定3/重度腐败,刺鼻臭味
分别制备4组新鲜的黄花鱼块,其中1组浸渍于生理盐水中,L. plantarum Y12组使用浓度为107 CFU/mL菌悬液浸渍10 min,Pseudomonas spp.组喷涂浓度为105 CFU/mL的Pseudomonas spp.菌悬液,混合培养组使用L. plantarum Y12浸渍后喷涂Pseudomonas spp.菌悬液。各组鱼块在8 ℃下保藏,保藏期内TVBN值的变化如图5。
图5 8 ℃下鱼块中TVBN值随时间的变化
Fig.5 Changes of TVBN in fresh fish meat with different storage time at 8 ℃
在整个保藏过程中,各组鱼块中TVBN含量随着时间的延长逐渐增加(p<0.05)。与Pseudomonas spp.单独接种和混合接种的鱼肉相比,未接菌和L. plantarum Y12接种的鱼肉的TVBN值增加缓慢;第3天时,未接菌对照组以及接种L. plantarum Y12鱼肉中,ω(TVBN)分别为(12.43±0.25) mg/100 g和(12.00±0.74)mg/100 g,没有显著性差异(p>0.05);Pseudomonas spp.和混合培养的鱼肉中ω(TVBN)分别为(22.75 ±2.47)mg/100 g和(17.85±0.49)mg /100 g,都超过国家二级鲜肉标准的TVBN限值,混合培养的鱼肉中TVBN值低于Pseudomonas spp.单独接种鱼肉中TVBN值(p<0.05),说明乳酸菌能够抑制腐败菌的生长,起到延缓鱼肉腐败的作用。第6天,未接菌对照组ω(TVBN)为(34.65±3.21)mg/100 g,显著高于国家标准30 mg/100 g(p<0.05);而接种L. plantarum Y12的鱼块样品ω(TVBN)是(29.00±1.24)mg/100 g,未超过国家标准;混合培养组(37.45±1.48)mg/100 g,Pseudomonas spp.单独培养达(42.7±2.96)mg/100 g显著高于(p<0.05)混合培养组,和灭菌鱼汁的实验结果相似,证明L. plantarum Y12能够有效抑制腐败菌的生长,对黄花鱼块达到一定的保鲜作用。
感官评定是判断鱼体是否腐败的一个重要的指标,达到感官拒绝的水产品不会被消费者所接受[25]。新鲜黄花鱼肉保藏6 d的感官评价结果如表4。第2天,4组鱼肉的感官上没有较大的变化。从第4天开始,4组鱼肉在感官上发生变化,其中Pseudomonas spp.单独培养的鱼肉已经达到了感官拒绝点,鱼肉具有氨臭味,失去鱼肉本身的弹性;混合培养组,略微有一点氨臭味,不如对照以及单独接种L. plantarum Y12的黄花鱼肉感官评价结果高。第6天,4组鱼肉都达到感官拒绝点,不能被人感官接受,其中从形态以及鱼肉弹性看,单独接种L. plantarum Y12的黄花鱼肉及混合培养黄花鱼肉要好于Pseudomonas spp.单独培养的鱼肉。对照组鱼肉中天然存在的微生物是造成对照组鱼肉腐败变质的原因,从而使对照组鱼肉在保藏第6天TVBN含量超过国家标准,而单独接种L. plantarum Y12的黄花鱼肉中L. plantarum Y12抑制了天然存在的微生物生长,从而起到保鲜的作用。
乳酸菌在应用于食品保鲜时,需要考虑其致腐性以及在实际条件下的保鲜效果。L. plantarum Y12对Pseudomonas spp.具有抑制作用,并且在保藏过程中会降低鱼汁和鱼肉的pH值。Fall等[23]研究发现L. piscium能够降低热带去皮虾保藏过程中pH值,抑制热带去皮虾热死环丝菌的生长,混合培养的虾感官评分始终高于腐败菌单独培养,但是这种pH值的降低效果并没有影响人对虾的感官评价,这个结果也和本研究的感官评价结果一致。Saraoui等[3]用菌株Lactococcus piscium处理水煮去皮热带虾可以有效降低去皮虾在一定保藏时间内TVBN含量并保持虾的良好感官状态。L. plantarum Y12和Pseudomonas spp.共培养时,TVBN含量明显下降,说明抑制作用显著。乳酸菌和乳酸菌的代谢产物作为生物保鲜中一种重要的天然保鲜剂,能够明显提高食品的质量。
表4 新鲜鱼肉在8 ℃条件下保藏6 d的感官评价结果
Tab.4 Sensory evaluation of fresh fish meat preserved at 8 ℃ for 6 days
t/d评价得分/感官描述对照L. plantarum Y12Pseudomonas spp.混合培养29/正常色泽,固有香气,富有弹性,纹理清晰9/正常色泽,固有香气,富有弹性,纹理清晰8.5/正常稍暗,固有香气,富有弹性,纹理清晰9/正常色泽,固有香气,富有弹性,纹理清晰47/色泽稍暗淡,略带异味,较有弹性,纹理较清晰7.5/色泽稍暗淡,略带异味,较有弹性,纹理较清晰6/色泽暗淡,氨臭味,弹性较差,鱼肉松散7/色泽较暗淡,略有氨臭味,弹性较差,纹理不清晰64/色泽暗淡,强烈氨臭味,按压后弹性差,较松散4.5/色泽暗淡,有氨臭味,按压后弹性差,较松散 2/色泽暗淡,强烈氨臭味,按压后无弹性,松散3.5/色泽暗淡,强烈氨臭味,按压后无弹性,松散
文中海洋鱼类来源的L. plantarum Y12能够抑制有害菌生长,在保藏过程中也不会使鱼肉或鱼汁腐败,在一定保藏条件下可以延缓有害微生物引起的鱼肉腐败。L. plantarum Y12应用于黄花鱼肉保鲜的剂量以及保鲜的温度范围还有待进一步研究。
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刘佳秀,女,硕士研究生,研究方向为益生菌与蛋白质功能特性;
*妥彦峰,男,副教授,博士,主要从事益生菌功能特性方面的研究,通信作者。
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