玉米赤霉烯酮(zearalenone, ZEN)是世界上污染范围最广的一种镰刀菌毒素，具有强烈的雌性激素毒性及致癌性，严重威胁着人和动物的健康[1-3]，其主要污染的粮食作物包括玉米、大麦、小麦、高粱和黑麦等[4-6]。

ZEN的化学名称为6-(10-羟基-6氧基-十一碳烯基)β-雷锁酸内酯。ZEN能引起人畜中毒的原因是其结构与雌性激素雌二醇(estradiol)的结构相似，能竞争结合动物细胞膜上的雌激素受体(estrogen receptor，ER)[7-10]。此生物活性主要是由ZEN的内酯键结构及4位碳原子的羟基引起[11]，因此，破坏这些结构可视为对ZEN的有效脱毒[12]。粉红粘帚霉IFO 7063被发现可催化打开ZEN的内酯键[13]，并且，负责此催化反应的内酯酶基因ZHD101被成功克隆[14]。目前，ZHD101蛋白的三维结构已经解析出，明确了ZHD101与ZEN分子的结合方式[15]，为ZHD101在消减粮食中的ZEN污染提供了重要基础。然而，应用ZHD101水解酶降解粮食中的ZEN毒素，常涉及高温、高盐、强酸等条件，在如此苛刻的工业环境下，ZHD101酶活性极低甚至消失，无法消除粮油食品中的ZEN污染。因此，需要发掘新的ZEN降解微生物以及降解酶，明确此类降解酶的催化机理，提高酶的催化活性及在工业条件下的适应性，为有效消除粮食中的ZEN污染提供基础。本研究旨在开发新的ZEN高效降解酶，并试图理解此类降解酶的催化反应机理，为消减ZEN提供理论依据。

1 实验部分

1.1 实验材料

1.1.1 样品采集

筛选ZEN降解菌的样品是采集于四川省的小麦麸皮，样品采集后置于4℃冰箱中保存、备用；筛选ZEN降解菌用的毒素管为含有10 μg ZEN毒素标准品的2 mL EP管。

1.1.2 试剂及培养基

用于聚合酶链式反应的引物由金唯智生物科技有限公司合成；用于分子克隆的酶购买于Invitrogen公司；ZEN标准品购买于Sigma公司；培养基及其他生化试剂购自中科天锐(北京)科技有限公司。

无机盐培养基(MSM)：MgSO4·7H2O 0.2 g，(NH4)2SO4 0.5 g，CaCl2·2H2O 0.066 g，Na2HPO4·12H2O 6.15 g，KH2PO4 1.52 g，加去离子水定容至1 L，调pH值至6.8。

LB培养基：酵母提取物5 g，胰蛋白胨10 g，NaCl 10 g，加去离子水定容至1 L，于121 ℃灭菌20 min，固体培养基加1.5%的琼脂粉。

马铃薯葡萄糖培养基：称取200 g马铃薯切成小块，加水煮沸20～30 min，用6层纱布过滤，加入葡萄糖，搅拌均匀，稍冷却后再补足水分至1000 mL，分装， 115 ℃灭菌20 min。

1.2 仪器与设备

高速离心机，美国贝克曼公司；e2695型高效液相色谱仪、2475型荧光检测器、xbridge C18型色谱柱，美国Waters公司； 6510型Q-TOF LC/MS，美国Agilent公司；亲和层析柱，中科天锐(北京)科技有限公司；核酸蛋白电泳仪及凝胶成像仪，美国Bio-Rad公司；PCR仪，美国ABI公司；恒温摇床，上海知楚仪器有限公司；紫外可见分光光度计，赛默飞世尔公司。

1.3 实验方法

1.3.1 ZEN降解菌的筛选

称取小米麸皮样品5 g，加到离心管(50 mL)中，加入30 mL无菌水振荡混匀，使样品中的微生物充分悬浮于水中，放于离心管架上静置1 h；在超净工作台中吸取上清液100 μL于ZEN毒素管中，加入400 μL MSM培养基，30 ℃，220 r/min培养15 d后，吸取100 μL菌液于新的ZEN毒素管中，再培养15 d，如此富集培养3次。吸10 μL培养的菌液，涂布MSM平板，30 ℃培养；挑取平板上长出的单菌落于ZEN毒素管中培养15 d，用高效液相色谱(HPLC)检测菌株对ZEN的降解效果。

1.3.2 ZEN降解菌株的基因组测序

采用第三代纳米孔单分子测序技术(测序平台： Pacific Biosciences RS II)，对降解菌株的全基因序列信息进行测定，通过对测序数据结果的组装与注释，得到了该降解菌株的基因组编码序列信息。以ZHD101序列为模板，与测序得到的基因组编码序列进行序列比对。

1.3.3 ZHD795重组表达质粒的构建

委托上海英潍捷基生物公司对ZHD795基因进行化学全合成。以合成的ZHD795基因为模板，进行PCR体外扩增。利用核酸琼脂糖凝胶电泳回收ZHD795基因，经限制性内切酶双酶切后连入PET30a载体，并转入大肠杆菌感受态细胞，筛选得到阳性重组子。

1.3.4 ZHD795重组蛋白的诱导表达及纯化

扩大培养ZHD795重组子，经IPTG诱导，过夜表达ZHD795蛋白。高速离心收集菌体，加入重悬液后超声破碎，高速离心后去除菌体，上清液利用亲和层析纯化ZHD795蛋白，并用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)进行ZHD795蛋白的表达纯化分析。

1.3.5 ZEN降解酶活性测定

取纯化后的ZHD795蛋白，加入到ZEN毒素管中，放入37 ℃培养箱中，反应3 h后，终止反应，用高效液相色谱检测，根据ZEN色谱峰的变化来判断ZHD795蛋白对ZEN是否具有降解活性；同时，以水代替ZHD795蛋白作为反应对照。经由HPLC检测，对照样品与反应样品的ZEN色谱峰面积之差，即为由ZHD795蛋白催化反应掉的ZEN分子。

1.3.6 ZHD795与ZHD101对ZEN降解活性的比较

将表达纯化的ZHD795与ZHD101降解酶稀释至相同浓度，按照已构建好的酶活反应体系进行催化降解反应；经由HPLC检测，比较2个蛋白酶对ZEN的降解活性高低。

2 结果与分析

2.1 ZEN降解菌株活性分析

从四川省采集的小麦麸皮样品，在以ZEN为碳源的无机盐培养基中富集培养，经HPLC检测，得到一株ZEN降解菌，如图1。

图1 筛选得到的ZEN降解菌株
Fig.1 Screening of microorganism degrading ZEN

2.2 ZEN降解菌株基因组序列分析

通过对降解菌株的全基因组测序，组装得到了38.98 Mb的序列信息，注释得到12 555个编码基因序列；将此基因组序列信息与ZHD101进行比对，得到了同源性为62%的同源蛋白ZHD795。

2.3 ZHD795蛋白酶的表达纯化分析

ZHD795基因通过PCR方法扩增后，运用核酸琼脂糖凝胶电泳进行分离回收，结果如图2。

1泳道是目的基因ZHD；M为DNA Marker。
图2 ZHD795基因琼脂糖凝胶电泳图
Fig.2 Agarose gel electrophoresis of ZHD795 gene

将ZHD795基因转入大肠杆菌BL21进行ZHD795蛋白表达，运用亲和层析法纯化目的蛋白，并用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)进行ZHD795蛋白的表达纯化分析，结果如图3。

1泳道是表达ZHD795蛋白的菌体超声破碎后的样品；2泳道是高速离心后的上清样品；3、4泳道是从Ni-NTA亲和柱上洗脱下来的样品；M是Protein Marker。
图3 ZHD795蛋白聚丙烯酰胺凝胶电泳图
Fig.3 SDS-PAGE of ZHD795 protein

2.4 ZHD795蛋白对ZEN的降解活性分析

取ZHD795蛋白液100 μL，加入到ZEN毒素管中作为反应组，以水代替ZHD795蛋白加入ZEN毒素管作为对照组，在37 ℃培养箱反应6 h后，终止反应。HPLC检测结果如图4。图4中对照组样品在保留时间为8.715 min处有强吸收峰，而反应组样品基本无ZEN目标峰检出。

在保留时间8.715 min处，无吸收峰的是反应组样品，有吸收峰的是对照组样品。
图4 HPLC检测ZHD795对ZEN的降解活性
Fig.4 Detection of degradation activity of ZHD795 to ZEN determined by HPLC

将ZHD795蛋白和ZHD101蛋白均稀释至质量浓度为2.0×10-3 mg/mL，加入ZEN毒素管中反应30 min后终止反应。HPLC检测结果见图5。经吸收峰面积计算，在30 min内，ZHD795对ZEN的降解率为96%，而ZHD101对ZEN的降解率为37%；ZHD795对ZEN的降解酶活为ZHD101的2.5倍。

图5 ZHD795与ZHD101对ZEN降解活性比较
Fig.5 Comparation of degradation activity of ZEN by ZHD795 and ZHD101

3 结 论

ZEN降解酶ZHD101能催化打开ZEN分子的内酯键，降解产物无毒性，是具有应用前景的ZEN降解酶。如何提高ZEN降解酶的催化活性及在工业条件下的适应性，是需要解决的问题。

本研究通过大量的筛选工作，在小麦麸皮样品中筛选得到一株能高效降解ZEN毒素的微生物菌株；通过第三代纳米孔单分子测序技术进行该菌株的全基因组测序，得到了该菌株的全基因组序列信息；通过与ZEN降解酶ZHD101进行序列比对，得到了一个同源性为62%的基因ZHD795，通过构建ZHD795基因原核表达体系，重组表达纯化得到ZHD795蛋白。构建ZHD795蛋白对ZEN的降解活性检测体系，检测结果表明ZHD795蛋白可降解ZEN毒素分子。通过ZHD795与ZHD101对ZEN的降解活性比较，明确了ZHD795对ZEN的降解酶活为ZHD101的2.5倍，从而得到了一个高效的ZEN降解酶。

ZHD101属于α/β水解酶家族，其活性中心包含α/β水解酶典型的催化三联体——酸- 碱- 亲核三联体，即Ser102- His242- Glu126，此催化三联体残基在一级序列中离得很远，但在三维结构中它们折叠到一起，发挥催化活性。通过一级序列比对发现，ZHD795也存在此催化三联体，下一步工作要解析ZHD795蛋白酶的三维结构，解析其催化反应机理，并与ZHD101进行结构比对，揭示造成2个降解酶对ZEN分子降解活性存在高低差异的原因，明确此类降解酶与ZEN的结合方式和催化特点，进一步通过分子改造提高此类降解酶对ZEN的催化活性及工业条件的适应性，为消减粮食及其副产物中的ZEN污染提供切实可行的技术支撑。

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Cloning of ZEN-Degrading Enzyme ZHD795 and Study on Degradation Activity

CHAI Chengliang, CHANG Xiaojiao, WANG Nanxi, SUN Jing, SUN Changpo*

(Academy of National Food and Strategic Reserves Administration, Beijing 100037, China)

Abstract： Zearalenone (ZEN) is a kind of fungal toxin produced mainly produced by Fusarium, which can easily contaminate food crops. Using the specificity of biological enzyme to destroy the molecular structure of ZEN is an effective method to eliminate ZEN pollution. Through screening, we found a microbial strain that can efficiently degrade ZEN, and the whole genome sequence information of the strain was obtained by the genome sequencing. The sequence alignment of ZEN-degrading enzyme ZHD101 was then performed, and the homologous sequence ZHD795 was obtained. To determine its ZEN-degrading activity, the gene fragment was synthesized chemically and cloned into the E.coli expression system, and the protein was then purified using affinity chromatography. The degradation activity was tested and the HPLC results showed that ZHD795 could degrade ZEN molecule efficiently. At the same time, the level of ZEN degradation activity of ZHD795 and ZHD101 was compared. Under the same conditions, the degradation activity of ZHD795 to ZEN was 2.5 times than that of ZHD101. This research showed that a highly active ZEN degradation enzyme with good application prospect was obtained.

Keywords： ZEN； protein expression and purification； degradation enzyme activity； ZHD101； ZHD795

中图分类号： TS201.3

文献标志码：A

doi:10.3969/j.issn.2095-6002.2018.06.005

文章编号：2095-6002(2018)06-0028-05

引用格式：柴成梁， 常晓娇， 王楠希，等. 玉米赤霉烯酮降解酶ZHD795编码基因克隆及降解活性研究[J]. 食品科学技术学报，2018,36(6):28-32.

CHAI Chengliang, CHANG Xiaojiao, WANG Nanxi, et al. Cloning of ZEN-degrading enzyme ZHD795 and study on degradation activity[J]. Journal of Food Science and Technology, 2018,36(6):28-32.

收稿日期： 2018-10-20

基金项目： 国家NSFC-河南联合基金资助项目(U1604234)。

作者简介：

柴成梁，男，助理研究员，博士，主要从事粮油食品中有害物的防控研究；

*孙长坡，男，研究员，博士，主要从事粮油食品中有害物的防控研究，通信作者。

(责任编辑：叶红波)