荔枝果肉多糖级分的抗氧化和α-葡萄糖苷酶抑制活性研究

黄 菲，张瑞芬，董丽红，肖 娟，唐小俊，张名位*

（广东省农业科学院蚕业与农产品加工研究所/农业部功能食品重点实验室/广东省农产品加工重点实验室，广东广州 510610）

摘 要：为了探究不同荔枝果肉多糖级分的理化性质、抗氧化能力和α-葡萄糖苷酶抑制活性差异，采用DEAE-52离子交换树脂分离纯化得到2种荔枝果肉多糖级分LPI和LPII，比较两者的中性糖、糖醛酸和蛋白质含量，并采用氧自由基清除能力（ORAC）和细胞抗氧化（CAA）评价其抗氧化活性，采用对-硝基酚-α-D吡喃葡萄糖苷（PNPG）法探究其α-葡萄糖苷酶抑制活性。研究结果表明LPII含有较多的中性糖和蛋白质，较少的糖醛酸，表现出更强的抗氧化和α-葡萄糖苷酶抑制活性，其中LPI和LPII的ORAC和CAA值分别是24.51，30.08 μmol/g和5.36，8.72 μmol/g，其抑制α-葡萄糖苷的IC50值分别是0.33，0.26 mg/mL。荔枝果肉多糖的生物活性与其中性糖和蛋白质含量密切相关。

关键词：荔枝；多糖；抗氧化；α-葡萄糖苷酶

HUANG Fei，ZHANG Ruifen，DONG Lihong，et al.Antioxidant activity and α-glucosidase inhibitory effect of litchi pulp polysaccharide fractions［J］.Journal of Food Science and Technology，2016，34（4）:26-30.

荔枝（Litchi chinensis Sonn.）是热带亚热带地区的特色水果，其果肉营养丰富，滋味甜美，深受消费者喜爱。中医认为“常食荔枝能补脑健身，治疗瘰疬，开胃益脾；干制能补元气，可作为产妇及老弱者的补品”。现代药理学证实多糖是荔枝中的主要活性成分，具有抗氧化［1］、免疫调节［2-4］和降血糖［5］的作用。

课题组前期研究发现荔枝果肉粗多糖具有清除DPPH·、OH·和O2-·等作用［6］；能提高肝脏和血清中总抗氧化能力、谷胱甘肽过氧化物酶和过氧化物歧化酶活力［7］。但是对于纯化后的荔枝果肉多糖级分具有怎样的抗氧化活性尚不清楚。由于传统的抗氧化方法主要是利用DPPH·和ABTS+·等自由基，而这些自由基不是生理上直接相关的自由基，导致检测结果对抗氧化物质真实的生理活性的参照性较小。以偶氮化合物ABAP作为过氧自由基来源的氧自由基清除能力（oxygen radical absorbance capacity，ORAC）检测法因其自由基、检测环境更接近生理状态，检测结果更能反映抗氧化物质真实的生理活性而受到广泛关注。此外，细胞抗氧化（cellular antioxidant activity，CAA）因其采用人体肝癌细胞株HepG2为实验模型，能反应抗氧化物质在细胞内的吸收和代谢情况，检测结果比传统的化学检测方法更有意义，从而被认为是抗氧化剂研究方法中的革命。因此，本研究对荔枝果肉粗多糖进一步分离纯化，采用ORAC和CAA两种方法来评价其抗氧化活性。

此外，张钟等［8］研究发现荔枝果肉粗多糖具有显著的体外抑制α-葡萄糖苷酶活性，且可以体内降低糖尿病小鼠血糖和糖化血红蛋白含量、提高肝糖原合成能力，表现出降血糖作用［5］。以上研究均以粗多糖为原料，对于纯化后的荔枝多糖是否还具有降血糖活性尚不清楚。因此，本研究采用对-硝基酚-α-D吡喃葡萄糖苷（p-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside，PNPG）法分析纯化后的荔枝果肉多糖级分对α-葡萄糖苷酶抑制作用来探究其降血糖活性。

1　材料与方法

1.1　材料与试剂

荔枝品种为“黑叶”，由广东省农业科学院果树研究所提供，于2015年6月采自其实验果园。人肝癌细胞株HepG2细胞购自中山大学实验动物中心，本实验室继代培养。

葡萄糖醛酸、Trolox（6-hydroxy-2，5，7，8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid）、荧光素钠盐、ABAP（2，2'-azobis（2-methylpropionamidine）-dihydrochloride）、DEAE-52纤维素离子交换树脂、α-糖苷酶、DCFH-DA、槲皮素、对-硝基苯-α-D吡喃葡萄糖苷（PNPG）、拜唐苹，美国Sigma公司；DMEM培养基、胎牛血清、HBSS缓冲溶液，美国Gibco公司；间羟基联苯，日本TCI公司；考马斯亮蓝蛋白测定试剂盒，南京建成科技有限公司；其他试剂均为国产分析纯。

1.2　仪器与设备

UV-1800型紫外可见分光光度计，日本岛津有限公司；1100型高效液相色谱仪，美国Agilent公司；Infinite Pro 200型酶标仪，瑞士Tecan公司；冷冻干燥仪，北京德天佑科技发展公司；Eyelan-1100型旋转蒸发器，东京理化器械株式会社；SBS-Z100型数控计滴自动部分收集器，上海青浦泸西仪器厂；HL-2型恒流泵，上海青浦泸西仪器厂。

1.3　方法

1.3.1　荔枝果肉多糖的提取

将热风干燥的荔枝干去壳和核，加无水乙醇后用打浆机粉碎，再用无水乙醇在4℃浸泡12 h后，离心（4 500 r/min，10 min）收集沉淀。将沉淀按料液比1∶20加入蒸馏水后采用95℃热水浸提4 h，趁热过滤，分别收集滤液和滤渣，将滤渣重复浸提一次，过滤后合并2次的滤液。将滤液浓缩为原来体积的1/4后用Sevag法脱去游离蛋白，再向溶液中按照体积比1∶4加入无水乙醇，将溶液于4℃静置12 h后抽滤收集多糖沉淀。将沉淀用无水乙醇洗涤3次，再冷冻干燥得到荔枝粗多糖。

1.3.2　多糖级分的制备

将100 mg粗多糖溶于5 mL去离子水中，4 500 r/min离心10 min后，将上清液加入DEAE-52离子交换层析柱（2.6 cm×50 cm）中。采用0.3 mol/L NaCl和0.3 mol/L NaOH以1 mL/min的流速依次洗脱10 h，5 mL/管收集洗脱液。苯酚-硫酸法检测每管吸光度后，按吸光度强度收集组分，将收集的洗脱液用透析袋透析3 d脱去盐离子，再进一步冷冻干燥得到2个荔枝多糖组分，分别是LPI和LPII。

1.3.3　基本成分分析

中性糖含量测定采用苯酚-硫酸法［9］；糖醛酸含量测定采用Blumenkrantz和Asboe-Hanaen的方法［10］；蛋白质含量测定采用考马斯亮蓝蛋白试剂盒测定。测定重复3次。

1.3.4　紫外光谱分析

配置1 mg/mL的多糖溶液5 mL，离心（4 500 r/min，10 min）后取2 mL上清液，采用紫外-可见分光光度计在200～400 nm波长范围内扫描。

1.3.5　抗氧化活性

1.3.5.1　氧自由基吸收能力测定

参考续洁琨等［11］的方法并稍作修改。先将缓冲液（空白）、不同浓度的Trolox标准品溶液、不同浓度的多糖级分溶液及0.96 μmol/L荧光素工作液加入到96孔板各孔后，37℃孵育10 min。再向未加荧光素的每孔中加入0.96 μmol/L的荧光工作液，37℃孵育20 min后，迅速向各孔加入119 mmol/L ABAP溶液后检测各孔的荧光衰退情况。检测条件:37℃，激发波长485 nm，发射波长538 nm，每4.5 min测一次，测定35次。结果以每克干基中所含相当于Trolox物质的量（μmol/g）表示。每个样品重复3次。

1.3.5.2　细胞抗氧化活性测定

参考Wolfe［12］的方法并稍作修改。向96孔板中加入6×105cell/mL的HepG2细胞悬液100 μL/孔，孵育24 h后弃去培养基，向各孔中分别加入100 μL含有25 μmol/L DCFH-DA的不同浓度槲皮素标准溶液和不同质量浓度的多糖级分溶液液，孵育1 h后，每孔加入100 μL含600 μmol/L ABAP的PBS配制的溶液，后续测定各孔的荧光强度。检测条件:37℃，激发波长485 nm，发射波长520 nm，每5 min测一次，测定12次。结果以每克干基中所含相当于槲皮素的量（μmol/g）表示。每个样品重复3次。

1.3.6　对α-葡萄糖苷酶的抑制作用

参考张钟等［8］的方法稍作修改。将1 mL 0.1 mol/L的pH为6.8的磷酸缓冲液和5 U的α-糖苷酶混匀，制成反应酶液；将多糖级分分别用磷酸缓冲液制成0.05～1 mg/mL的多糖溶液。磷酸缓冲液为空白对照。向96孔板各孔分别加入40 μL多糖溶液后，再向每孔加入20 μL酶液，并在37℃孵育10 min。然后用多道移液器迅速在各孔加入60 μL的20 mmol/L的PNPG溶液，37℃孵育10 min后，每孔加入0.2 mol/L Na2CO3（160 μL）终止反应，在405 nm下检测吸光值。同时设定样品背景对照组、空白对照组和以拜唐苹为抑制剂的阳性对照组，计算酶活抑制率。α-糖苷酶活性抑制率计算见式（1）。

1.4　统计分析

采用SPSS 19.0统计软件进行单因素方差分析，并以S-N-K检验比较各组间差异，显著性水平为p＜0.05，以不同小写字母表示。结果以均数±标准差表示。

2　结果与分析

2.1　荔枝果肉多糖级分的基本成分分析

荔枝果肉多糖级分LPI和LPII的基本化学成分见表1。LPI和LPII的中性糖、蛋白质和糖醛酸含量均存在显著性差异（p＜0.05）。LPI的中性糖和蛋白质含量低于LPII（p＜0.05），但其糖醛酸含量显著高于LPII（p＜0.01）。

表1　荔枝果肉多糖级分的化学组成
Table 1 Chemical compositions of LPI and LPII

*表示样品间差异达显著性水平（p＜0.05）；**表示样品间差异达极显著水平（p＜0.01）

LPILPII w（中性糖）/%69.36±0.4374.45±1.32组成成分* w（蛋白质）/%2.54±0.256.03±0.62**w（糖醛酸）/%6.86±0.371.23±0.15**

2.2　荔枝果肉多糖级分的紫外光谱特征

LPI和LPII的紫外扫描图谱见图1。由图1可知，LPI在260 nm和280 nm处没有吸收峰出现，说明LPI中不含有或者含有很少量的核酸和蛋白质类物质；LPII在280 nm处有显著凸起的吸收峰，说明LPII含有蛋白质，此结果与考马斯亮兰法检测结果一致。

2.3　荔枝果肉多糖级分的抗氧化活性

2.3.1　ORAC抗氧化能力

ORAC法通过以偶氮类化合物ABAP作为自由基来源，荧光素钠盐作为荧光指示剂，通过记录ABAP和荧光素钠反应使其逐渐转化为非荧光物质时荧光强度的变化过程，来判断抗氧化物质抑制自由基的能力，见图2。由图2可知，LPI和LPII的ORAC值分别是24.51和30.08 μmol/g，LPII的氧自由基吸收能力显著强于LPI（p＜0.05）。

图1　荔枝果肉多糖级分LPI和LPII的紫外扫描图谱
Fig.1 UV spectra of LPI and LPII

2.3.2　CAA抗氧化能力

本身无荧光的DCFH-DA可被细胞酯酶分解形成还原型DCFH，进一步在氧自由基的作用下形成氧化型的荧光物质DCH。CAA法通过测定抗氧化剂结合在细胞膜或进入细胞后，阻止ABAP产生的氧自由基形成DCH。通过与对照物相比，细胞荧光物质的减少量反映化合物的抗氧化能力，见图3。由图3可知，LPI和LPII的CAA值分别是5.36和8.72 μmol/g，LPII的细胞抗氧化能力显著强于LPI（p＜0.05），此结果与ORAC检测方法一致。

图2　荔枝多糖级分LPI和LPII的ORAC值
Fig.2 ORAC values of LPI and LPII

*代表样品之间具有显著性差异（p＜0.05）

图3　荔枝多糖级分LPI和LPII的CAA值
Fig.3 CAA values of LPI and LPII

*代表样品之间具有显著性差异（p＜0.05）

采用两种不同检测方法均发现LPII比LPI具有更好的抗氧化活性，其活性差异与其中性糖、蛋白质和糖醛酸有关。邓媛元等［13］研究发现，不同品种的苦瓜多糖的抗氧化活性发现中性糖含量最高的3个品种的苦瓜多糖的ORAC指数也是最大的；Guo等［14］研究发现Oidiodendron truncatumGW真菌多糖中的蛋白质有利于其抗氧化活性的发挥；Jiang等［15］研究发现不同的青蛤多糖级分中蛋白质含量最高的CSPS-3具有最强的抗氧化活性。本研究中中性糖和蛋白质含量高的LPII比LPI具有更好的抗氧化活性，此结果与他人研究结果一致。

2.4　荔枝果肉多糖级分对α-葡萄糖苷酶的抑制作用

α-葡萄糖苷酶是碳水化合物消化吸收的关键酶，它可以从低聚糖类物质的非还原末端切开α-1，4糖苷键释放出葡萄糖，被认为是控制II型糖尿病患者餐后血糖升高的治疗靶点。在本研究中，LPI和LPII对α-葡萄糖苷酶的抑制作用存在剂量依赖关系，相同浓度下LPII的抑制作用显著强于LPI（p＜0.05）。在0.05～1 mg/mL，LPI、LPII和拜唐苹的抑制率分别是13.00%～77.69%，13.76%～81.89%和31.95%～92.03%。LPI、LPII和拜唐苹抑制α-葡萄糖苷酶的IC50值分别是0.327，0.256，0.109 mg/mL。结果表明LPII对α-葡萄糖苷酶的抑制作用强于LPI，但是两者均低于拜唐苹，见图4。

图4　荔枝多糖级分LPI和LPII的α-葡萄糖苷酶抑制率
Fig.4 α-Glucosidase inhibitory activities of LPI and LPII

不同小写字母代表样品之间具有显著性差异（p＜0.05）

多糖对α-葡萄糖苷酶的抑制活性与其基本组成密切相关。Wang等［16］研究发现茶树叶多糖对α-葡萄糖苷酶的抑制活性随其中性糖含量的增加而增强；Hsu等［17］研究发现云芝菌丝体多糖的α-葡萄糖苷酶抑制活性与其蛋白质含量呈正相关［16］。本研究中LPII因其含有更多的中性糖和蛋白质，表现出更好的α-葡萄糖苷酶抑制活性，与文献［16-17］的研究结果一致。此外，对于多糖表现出不同的α-葡萄糖苷酶抑制活性，有研究表明多糖的单糖组成和糖苷链的差异导致其与α-葡萄糖苷酶的活性中心反应程度不同，从而表现出不同的活性。荔枝果肉多糖与α-葡萄糖苷酶抑制活性的构效关系还有待进一步研究。

3　结 论

通过分析荔枝果肉多糖不同级分的基本组成、ORAC和CAA抗氧化能力及其对α-葡萄糖苷酶抑制活性，发现LPII因含有更多的中性糖和蛋白质，具有更好的抗氧化活性和α-葡萄糖苷酶抑制活性。研究结果在一定程度上丰富了荔枝果肉多糖的生物活性，为其构效研究提供了基础。

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Antioxidant Activity and α-Glucosidase Inhibitory Effect of Litchi Pulp Polysaccharide Fractions

HUANG Fei，ZHANG Ruifen，DONG Lihong，XIAO Juan，TANG Xiaojun，ZHANG Mingwei*
（Sericultural and Agri-Food Research Institute，Guangdong Academy of Agricultural Sciences/Key Laboratory of Functional Foods，Ministry of Agriculture/Guangdong Key Laboratory of Agricultural Products Processing，Guangzhou 510610，China）

Abstract：In order to explore the differences of litchi pulp polysaccharide fractions，the content and composition，as well as antioxidant capacities and α-glucosidase inhibitory activities of varied litchi pulp polysaccharide fractions were studied.A DEAE-52 anion-exchange column was used to obtain two different litchi pulp polysaccharide fractions，denoted as LPI and LPII.The contents of neutral sugar，uronic acid，and protein were analyzed.In addition，their antioxidant activities were evaluated by oxygen radical absorbance capacity（ORAC）and cellular antioxidant activity（CAA）.The p-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside method was used to measure the α-glucosidase inhibitory activity.The results showed that LPII contained more neutral sugar and protein than LPI，but less uronic acid.LPII exhibited higher antioxidant activity in ORAC value（30.08 μmol/g）and CAA value（8.72 μmol/g）that those of LPI（24.51 μmol/g and 5.36 μmol/g）.In addition，the IC50values of α-glucosidase inhibition were 0.33 and 0.26 mg/mL for LPI and LPII.The results demonstrated that bioactivities of litchi pulp polysaccharide fractions were related to its neutral sugar and protein contents.

Key words：litchi；polysaccharides；antioxidant activity；α-glucosidase

中图分类号：TS255.2；TS201.2

文献标志码：A

doi：10.3969/j.issn.2095-6002.2016.04.005

文章编号：2095-6002（2016）04-0026-05引用格式：黄菲，张瑞芬，董丽红，等.荔枝果肉多糖级分的抗氧化和α-葡萄糖苷酶抑制活性研究［J］.食品科学技术学报，2016，34（4）:26-30.

（责任编辑:檀彩莲）

收稿日期：20160704

基金项目：国家自然科学基金-广东联合基金重点项目（U1301211）；广东省自然科学基金资助项目（2016A030310321）；广东省科技计划项目（2016B070701012）。

作者简介：黄 菲，女，助理研究员，博士，主要从事植物多糖的结构与生物活性研究；

*张名位，男，研究员，博士，主要从事植物活性成分和功能性食品研究。通信作者。