苯酚-硫酸法测定花椒叶多糖含量

齐素芬，张华峰*，姚 美，程 芳，王正齐，陈思雨

（陕西师范大学食品工程与营养科学学院/药用资源与天然药物化学教育部重点实验室/西北濒危药材资源开发国家工程实验室，陕西西安 710062）

摘 要：建立了一种灵敏、特异、精确定量分析花椒叶多糖的苯酚-硫酸法，采用该方法测定了陕西大红袍花椒叶中多糖的含量。该方法选择半乳糖作为标准单糖，484 nm为工作波长。通过单因素实验和正交试验优化得到了较佳显色反应条件是加样次序为苯酚-样品-浓硫酸，显色温度为25℃，质量分数为5%的苯酚添加量为0.3 mL，浓硫酸添加量为3.5 mL，显色时间为30 min。系统适应性实验显示该方法的标准曲线方程为y=0.0127x-0.0076（R2=0.997），线性范围为10.00～60.00 μg/mL，LOD和LOQ分别为2.08 μg/mL和6.30 μg/mL，日内、日间精密度分别在0.49%～3.64%，5.17%～6.05%之间，平均回收率为101.19%。样品溶液在显色反应后的2 h内稳定性较好。测定发现陕西大红袍花椒叶中w（多糖）在8.11～8.89 mg/g之间。该方法为花椒叶多糖的定量分析和花椒叶资源的开发利用提供了参考。

关键词：花椒叶；多糖；苯酚-硫酸法；显色反应

芸香科（Rutaceae）花椒属（Zanthoxylum）植物花椒（Zanthoxylum bungeanum）的果皮是重要的传统香料，在我国的种植面积约有21万hm2［1］。国内外学者对花椒果皮中挥发性芳香油、生物碱、香豆素、类黄酮等的开发利用进行了广泛研究［2-3］，但是对花椒叶资源的研究相对较少［1］。花椒叶中含有蛋白质、氨基酸、脂肪、维生素、类黄酮等多种营养素和生物活性物质，在陕西省渭南市等很多地区作为蔬菜食用，但是目前对花椒叶多糖的研究却较鲜见［1］。我们实验室研究发现，花椒叶粗多糖具有抗氧化活性。准确测定花椒叶多糖的含量，系统分析花椒叶多糖的生物活性，对于花椒资源的科学开发和综合利用具有一定的积极意义。植物多糖的定量分析方法包括苯酚-硫酸法、蒽酮-硫酸法和地衣酚-硫酸法等，其中最常用的方法是苯酚-硫酸法［4-6］。该方法的原理是利用多糖在浓硫酸作用下水解成单糖，并迅速脱水生成糠醛衍生物进而和苯酚缩合成有色化合物，以葡萄糖为标准单糖在490 nm波长下进行比色分析。该方法操作简便，快捷灵敏，无须大型仪器，但是其准确性和重现性受实验条件（如显色反应）的影响较大［5-6］。为了给花椒叶多糖的定量分析和花椒叶资源的开发利用提供依据，本研究对苯酚-硫酸法的实验条件进行了优化，然后采用系统适应性实验进行了方法学评价，最终建立了灵敏、特异、精确的花椒叶多糖定量分析方法，并运用该方法测定了陕西大红袍花椒叶中多糖的含量。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

TU-1810型紫外可见分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司；DL-4C型低速大容量离心机，上海安亭科学仪器厂；HH-2型恒温水浴锅，北京科伟永兴仪器有限公司；RE-52型旋转蒸发仪，上海安亭实验仪器有限公司；BS224S型分析天平，北京赛多利斯科学仪器有限公司。

葡萄糖、半乳糖、甘露糖标准品，纯度为99%，购自美国Sigma公司；无水乙醇、95%乙醇、丙酮、浓硫酸、苯酚等，分析纯，国产试剂；蒸馏水，陕西师范大学自制。

1.2 方法

1.2.1 样品采集与处理

1.2.1.1 花椒叶的前处理

花椒叶2014年5～8月份采自陕西省渭南市。花椒叶经挑选（除去茎、叶柄和杂物）后清洗、晾干，然后粉碎、过筛（80～100目）、烘干（50～60℃），置密闭容器中避光保存。

1.2.1.2 花椒叶多糖的提取

准确称取10 g花椒叶粉末，置250 mL锥形瓶中，加入200 mL蒸馏水，浸泡过夜，然后置80℃水浴中提取4 h，抽滤并收集滤液，滤渣重复浸提2次，合并滤液。将所得滤液蒸发浓缩后加入4倍量体积分数为95%的乙醇，室温下沉淀过夜，在4000r/min下离心10 min得到沉淀。将沉淀移至10 mL离心管中，依次用体积分数为80%的乙醇、95%的乙醇、无水乙醇和丙酮进行漂洗，然后挥干溶剂，在30～40℃烘干至恒重，碾成粉末即得花椒叶多糖样品。比色测定时将多糖样品配制成ρ为0.05 mg/mL的水溶液（多糖溶液）。

1.2.2 方法建立与优化

1.2.2.1 标准单糖和工作波长的确定

按照质量分数为5%苯酚0.3 mL、多糖溶液1.0 mL、浓硫酸2.0 mL的比例加样，混匀后在室温下显色20 min，在250～600 nm波长范围内进行扫描；分别用葡萄糖、半乳糖、甘露糖3种单糖溶液替代多糖溶液，显色后进行扫描。通过比较单糖、多糖的吸收光谱确定标准单糖和工作波长。

1.2.2.2 加样次序的确定

测定不同样品添加顺序（样品-苯酚-浓硫酸、样品-浓硫酸-苯酚、浓硫酸-样品-苯酚、浓硫酸-苯酚-样品、苯酚-样品-浓硫酸、苯酚-浓硫酸-样品）对吸光度的影响，以确定较佳加样次序。加样量为质量分数5%苯酚0.3 mL、多糖溶液1.0 mL、浓硫酸2.0 mL。显色温度为室温，显色时间20 min。

1.2.2.3 显色时间对吸光度的影响

按照质量分数为5%苯酚0.3 mL、多糖溶液1.0 mL、浓硫酸2.0 mL的比例依次加样，混匀后在室温下分别显色5，10，20，25，30 min，测定吸光度。1.2.2.4 浓硫酸添加量对吸光度的影响

按照质量分数为5%苯酚为0.3 mL，多糖溶液为1.0 mL，浓硫酸分别为1.0，1.5，2.0，2.5，3.0，3.5，4.0 mL的比例依次加样。混匀后在室温下显色25 min，测定吸光度。

1.2.2.5 苯酚添加量对吸光度的影响

在质量分数为5%的苯酚分别为0.1，0.2，0.3，0.4，0.5 mL的条件下，依次加入多糖溶液1.0 mL、浓硫酸3.5 mL，室温下显色2 5min，测定吸光度。

1.2.2.6 显色温度对吸光度的影响

按照质量分数为5%苯酚0.2 mL、多糖溶液1.0 mL、浓硫酸3.5 mL的比例依次加样，混匀后分别在10，20，30，40，50℃下显色25 min，测定吸光度。

1.2.2.7 正交试验设计

根据上述单因素实验结果，选择显色时间、浓硫酸添加量、质量分数5%苯酚添加量、显色温度4个变量进行四因素三水平正交试验，确定较优组合条件。每组实验设2个重复。

1.2.3 方法考察与评价

1.2.3.1 标准曲线的绘制

精确配制ρ分别为5.00，10.00，20.00，30.00，40.00，50.00，60.00 μg/mL的半乳糖标准溶液，按照质量分数为5%苯酚0.3 mL、半乳糖标准溶液1.0 mL、浓硫酸3.5 mL的比例加样，混匀后在25℃显色30 min，在484 nm处测定吸光度。每个浓度设5个重复。

1.2.3.2 LOD和LOQ的测定

参照Rolim等［7］的方法测定LOD和LOQ。

1.2.3.3 精密度实验

参照Shabir［8］的方法连续3天重复测定高、低两种浓度花椒叶多糖溶液中多糖的含量，计算日内精密度（n=5）和日间精密度（n=15）。

1.2.3.4 回收率实验

参照Rolim等［7］的方法将一定量的高、低两个浓度水平的半乳糖标准溶液（ρ分别为30.00、50.00 μg/mL）与已知浓度花椒叶多糖溶液混合，显色后测定吸光度和总糖含量，计算加标回收率。

1.2.3.5 稳定性实验

取一定量的花椒叶多糖溶液，在最佳显色反应条件下比色测定吸光度。每隔1 min测定一次，连续测定10次以考察仪器稳定性；每隔10 min测定一次，连续测定2 h以考察溶液稳定性。

2 结果与分析

2.1 标准单糖与工作波长的选择

在250～600 nm波长下扫描花椒叶多糖与葡萄糖、半乳糖、甘露糖3种单糖显色后溶液的光谱曲线见图1，可以发现花椒叶多糖的最大吸收峰对应波长不是490 nm，而是484 nm。3种单糖中，半乳糖与花椒叶多糖的最大吸收波长最为接近，因此选择半乳糖作为标准单糖。由于花椒叶多糖在484 nm处有最大吸收峰，而半乳糖在484 nm处的吸光度也较高，因此选择484 nm作为最佳吸收波长。这样就避免了传统方法以葡萄糖为标准单糖、以490 nm为工作波长而使方法的特异性和灵敏度受到影响的弊端。

2.2 显色反应条件的优化

2.2.1 加样次序

加样次序对吸光度的影响见图2，加样次序对吸光度具有明显影响。先加入质量分数为5%的苯酚，再加入花椒叶多糖溶液，后加入浓硫酸，显色后溶液的吸光度最高。故选择苯酚-样品-浓硫酸为较佳加样次序。

2.2.2 显色时间

在5～25 min范围内，随着显色时间的延长吸光度呈现缓慢增加的趋势，超过25 min时吸光度开始缓慢下降，见图3，因此显色时间应该保持在25 min左右。

2.2.3 浓硫酸添加量

浓硫酸添加量对吸光度的影响见图4，当浓硫酸添加量在1.0～3.5 mL区间时，吸光度随着浓硫酸添加量的增加而增大，当浓硫酸添加量为3.5 mL时吸光度最大，此后吸光度开始减小，这可能是因为浓硫酸在显色过程中的作用既是强酸，又是催化剂，如果添加量过多，则会引起被测物质化学解离状态及其显色配合物组成的改变，从而影响有色配合物的吸收光谱。综上，浓硫酸添加量控制在3.5 mL为宜。

2.2.4 质量分数为5%的苯酚添加量

苯酚添加量对吸光度的影响见图5，苯酚添加量过多、过少都会使吸光度降低，当苯酚添加量为0.2 mL时，吸光度最高，因此，苯酚添加量应当为0.2 mL左右。

2.2.5 显色温度

显色温度对吸光度的影响见图6，当温度为30℃时吸光度最大，高于或低于30℃时吸光度均较小，其原因可能是温度过低显色反应速度较慢，温度过高显色配合物的结构容易遭到破坏，因此显色温度应该维持在30℃左右。

2.2.6 正交试验

测定的正交试验结果和分析见表1和表2。由表1的极差分析和表2的方差分析可知，显色温度（A）、质量分数为5%的苯酚添加量（B）、浓硫酸添加量（C）、显色时间（D）对吸光度均有显著影响（P＜0.01），影响大小依次为C＞B＞D＞A。

由极差分析可知，较优组合条件为A1B3C2D3，即显色温度为25℃、质量分数为5%的苯酚添加量为0.3 mL、浓硫酸添加量为3.5 mL、显色时间为30 min。在9组正交试验中，第9组实验的吸光度最高。理论优化所得较优组合条件（A1B3C2D3）与第9组实验条件（A3B3C2D1）中C、B两个影响较大的因素均处于相同水平，提示较优组合条件是符合逻辑的。由于较优条件（A1B3C2D3）在9组正交试验中没有出现，因此按照该条件进行了验证实验，发现吸光度显著高于9组正交试验的吸光度（P＜0.05），说明理论优化得到的较优组合条件（A1B3C2 D3）是切实可行的。

2.3 系统适应性实验

2.3.1 标准曲线的绘制结果

以半乳糖标准溶液质量浓度（x）为横坐标、吸光度（y）为纵坐标绘制标准曲线，见图7，回归方程为y=0.012 7x-0.007 6，相关系数R2=0.997（图7）。当半乳糖标准溶液质量浓度为5.00 μg/mL时，精密度和准确度较差；标准曲线的数据分析见表3，当标准溶液质量浓度在10.00～60.00 μg/mL时，精密度和准确度较好。因此，标准曲线的线性范围为10.00～60.00 μg/mL。

2.3.2 LOD和LOQ的确定结果

此方法的LOD和LOQ测定数据见表4。由表4可知，LOD和LOQ分别为2.08 μg/mL和6.30 μg/mL。

2.3.3 精密度实验结果

方法的精密度实验数据见表5。由表5可知，当花椒叶多糖溶液中多糖ρ在15.72～31.70 μg/mL范围时，日内精密度在0.49%～3.64%之间，日间精密度在5.17%～6.05%之间，可以满足花椒叶多糖的定量分析要求。

2.3.4 回收率实验结果

不同浓度水平的加标回收率在96.48%～ 105.90%之间（数据未显示），平均回收率为101.19%，符合定量分析相关要求［8］。

2.3.5 稳定性实验结果

仪器稳定性实验数据见表6和表7。由表6和表7可知，仪器稳定性较高（RSD=0.80%），样品溶液在显色反应后的2h内也基本稳定（RSD= 1.03%），说明该方法可用于花椒叶多糖的精密、便捷检测。

2.4 验证测定

为了验证本研究建立的苯酚-硫酸法的实用性，应用该方法测定了陕西大红袍花椒的顶端叶、中层叶和底部叶中多糖的含量，发现花椒叶中w（多糖）在8.11～8.89 mg/g之间，不同植株之间没有显著差异（P＞0.05）。

3 结 语

本研究通过单因素实验和正交试验优化了显色时间、浓硫酸添加量、质量分数为5%的苯酚添加量、显色温度等实验条件，采用系统适应性实验考察了新方法的LOD、LOQ、精密度和回收率等，建立了一种灵敏、特异、精确测定花椒叶多糖含量的新方法，并测定了陕西大红袍花椒叶的多糖含量，为花椒叶多糖的精确定量和花椒叶资源的深度开发提供了依据。

参考文献：

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Development and Application of Phenol-sulfuric acid Method for Determination of Polysaccharides in Zanthoxylum Bungeanum Leaves

QI Sufen，ZHANG Huafeng*，YAO Mei，CHENG Fang，WANG Zhengqi，CHEN Siyu
（College of Food Engineering and Nutritional Science/Key Laboratory of Ministry of Education for Medicinal Resources and Natural Pharmaceutical Chemistry/National Engineering Laboratory for Resources Development of Endangered Crude Drugs in Northwest China，Shaanxi Normal University，Xi'an 710062，China）

Abstract:A sensitive，specific，accurate and precise phenol-sulfuric acid method was established for quantitative assay of polysaccharides in Zanthoxylum bungeanum leaves.And polysaccharides in leaves of Dahongpao，a cultivar of Z.bungeanum in Shaanxi province，were successfully determinated by the proposed phenol-sulfuric acid method.Galactose was used as standard monosaccharide and 484nm was chosen as working wavelength.The optimum conditions for chromogenic reaction were obtained by single factor experiments and orthogonal test:addition sequence，phenol-sample-concentrated sulfuric acid；temperature of chromogenic reaction，25℃；amount of 5%phenol，0.3 mL；amount of concentrated sulfuric acid，3.5 mL；and duration of chromogenic reaction，30 min.System suitability test indicated that regression equation of standard curve was y=0.012 7x-0.007 6（R2=0.997）and range with satisfactory accuracy and precision was 10.00-60.00 μg/mL.LOD and LOQ were 2.08 μg/mL and 6.30 μg/mL，respectively.Intra-and inter-day precision varied from 0.49%to 3.64%and from 5.17%to 6.05%，respectively.And mean recovery was 101.19%.The colored sample solution was stable within 2 h.The content of polysaccharides in Dahongpao leaves in Shaanxi province，was in the range of 8.11-8.89 mg/g. The developed colorimetric method provides a basis for quantification of polysaccharides from Z.bungeanum leaves and exploitation of leaf resources.

Key words:Zanthoxylum bungeanum leaves；polysaccharides；phenol-sulfuric acid method；chromogenic reaction

（责任编辑:李 宁）

中图分类号：TS207.3

文献标志码：A

doi:10.3969/j.issn.2095-6002.2015.04.008

文章编号：2095-6002（2015）04-0040-07

引用格式：齐素芬，张华峰，姚美，等.苯酚-硫酸法测定花椒叶多糖含量［J］.食品科学技术学报，2015，33（4）:40-46.

QI Sufen，ZHANG Huafeng，YAO Mei，et al.Development and application of phenol-sulfuric acid method for determination of polysaccharides in Zanthoxylum bungeanum leaves［J］.Journal of Food Science and Technology，2015，33（4）:40-46.

收稿日期:2014-07-14

基金项目:中央高校基本科研业务费专项资金项目（GK201302048）；陕西省大学生创新创业训练计划项目（cx13063）。

作者简介:齐素芬，女，学士，研究方向为药食两用植物资源开发与利用；

*张华峰，男，副教授，博士，主要从事食品营养与安全方面的研究。

通信作者。