酸碱度对重组鱼腥藻脂肪氧合酶构象与活性的影响

汪晓鸣，朱筱玉，张 充，吕凤霞，别小妹，陆兆新*

（南京农业大学食品科技学院，江苏南京 210095）

摘 要：以重组表达、纯化得到的鱼腥藻脂肪氧合酶为研究对象，通过测定鱼腥藻脂肪氧合酶在不同缓冲体系中分子构象的变化（主要研究二级结构，螺旋、折叠、转角和无序结构单元质量分数），分析了鱼腥藻脂肪氧合酶分子构象变化与不同缓冲体系之间的关系，探求鱼腥藻脂肪氧合酶构象变化与生物酶学特性之间的关系。研究结果表明，该酶的最适反应pH值为9，最稳定pH值为7；发现在不同缓冲体系中，鱼腥藻脂肪氧合酶的相对活性变化和螺旋结构、转角结构、无序结构有密切关系。在pH值为6～9时，酶活性与螺旋结构、转角结构总体呈正相关，但与折叠结构的质量分数变化呈负相关。最稳定的酶的二级结果是折叠结构、无序结构、螺旋结构和转角结构，其质量分数均在20%～30%。

关键词：脂肪氧合酶；酶活性；二级结构；缓冲溶液

编者按：酶技术与发酵技术是被人类最早应用的生物技术。酶技术在食品加工制造、食品添加剂制造、功能因子提取分离等食品工业重要领域的产品开发、生产技术和检测技术发展等方面发挥重要作用。本期选择了酶构象与活性关系、酶催化合成代替化学催化和酶固定化3个重要研究方向的3篇论文，分别研究了以重组表达、纯化得到的鱼腥藻脂肪氧合酶分子构象变化与不同缓冲体系之间的关系，以及构象变化与生物酶学特性之间的关系；采用表面活性剂胶束溶液提高假丝酵母脂肪酶催化合成蔗糖-6-乙酯的催化效率；以壳聚糖-戊二醛共价交联法制备固定化风味蛋白酶及其酶学特性。希望此方面的研究能为相关酶学研究、绿色制备食品添加剂和酶固定化技术等工作提供有益借鉴。（主持人：曹雁平教授）

脂肪氧合酶（lipoxygenase，LOX）（EC1.13.11. 12）属于氧化还原酶，是一种单一多肽链，含非血红素铁的蛋白质，能专一催化具有顺，顺-戊二烯结构的多不饱和脂肪酸，通过分子内加氧，形成具有共轭双键的氢过氧化衍生物。它不仅广泛存在于动、植物细胞中，在藻类、面包酵母、真菌以及氰细菌中均发现有LOX的存在［1-4］。在大豆脂肪氧合酶的初级结构中，能够观察到一个区域，该区域富含组氨酸的残基。通过研究，证明了铁原子中心活性位点包含有两种类型的配体:1个外源配体和5个内源配体，内源配体包括3种组氨酸残基（His 499，His 504，His690），1个Ile839残基以及1个Asn694，外源配体为水分子［5-7］。

蛋白质的构象与其生物功能有密切的相关性，理论研究表明，酶蛋白分子的空间结构即使发生极其细微的变化，也能够极大地影响酶蛋白的生物活性，并且酶蛋白的生物活性功能依赖于结构的运动性［8-9］。酶的二级结构多指肽链有规则的盘旋折叠所形成的构象，主要包括螺旋、折叠、转角和无序结构，这些结构主要依靠—NH—，—C==O形成的氢键使其结构稳定［10］。圆二色（circular dichroism，CD）光谱法是研究稀溶液中蛋白质结构的一种有效方法，它能灵敏地反映出蛋白质构象的变化。圆二色的产生是由光学活性物质对左右圆偏振光的吸光率的变化引起的，一般手性物质的圆二色性与波长有关，对手性物质按照一定的波长扫描即能得到其CD光谱图，从图谱上可以了解其分子及结构上的手性特性。通过肽键连接而成的蛋白质是具有特定结构的生物大分子，其圆二色性主要由活性生色基团及折叠结构两方面圆二色性的总和［11-13］。CD光谱在预测、分析蛋白质结构方面发挥着重要作用。目前，研究LOX酶活与二级结构含量之间相关性的研究较少，关于pH值和温度对脂肪氧合酶构象的影响尚未见报道。有研究表明，螺旋含量下降，折叠含量增加，与酶的钝化有相关性。

Casey等［14］提出重组脂肪氧合酶将成为食品加工领域研究中的前沿。然而，至今为止，还未曾有高效表达脂肪氧合酶的报道。Zhang等［15］通过从鱼腥藻中获得LOX基因，并在B.subtilis中表达，获得了高活性的重组LOX。在面团中加入LOX后巯基减少，增加了谷朊蛋白大分子的含量和促进了谷朊蛋白间二硫键的形成，因而使面团的筋力提高。

本研究以重组表达、纯化得到的鱼腥藻脂肪氧合酶（Anabaena Sp.Lipoxygenase，ana-rLOX）为研究对象，通过测定ana-rLOX在不同缓冲体系中，螺旋、折叠、转角和无序结构等分子构象的变化，分析ana-rLOX分子构象变化与不同缓冲体系之间的关系，探求ana-rLOX构象变化与生物酶学特性的关系，期望从分子构象的变化解释酶学特性。

1 材料与方法

1.1 实验材料

亚油酸（LA）和高纯度-［4-吡啶基-1-氧］-N-叔丁基氮酮，均购自西格玛公司（Sigma Chemical Co.，St.Louis，MA，USA）；ana-rLOX，本实验室重组、发酵、表达和纯化。

1.2 实验仪器

J-810型圆二色光谱仪（CD），日本Jasco公司；2450型分光光度计，日本Shimadzu公司；EMX型电子自旋共振波谱仪，德国Bruker公司；LightCycler® 480系统，瑞士Roche公司。

1.3 实验方法

1.3.1 ana-rLOX酶活的测定

ana-rLOX活力的测定按Axelrod等［16］方法进行，利用分光光度计测定亚油酸在脂肪氧合酶催化下形成的共轭二烯产物，在234 nm波长下吸光值的变化。1个活性单位（U）的酶定义为在25℃条件下每1 min产生1 μmol的共轭双键所需要的酶量。

1.3.2 ana-rLOX酶学性质研究

1）ana-rLOX最适反应pH值的确定。分别用pH值为4，5，6，7，8，9，10（0.05 mol/L PBS缓冲液以及Tris-HCl缓冲液）的缓冲液将酶液稀释10倍，加入底物亚油酸，在25℃条件下，测定ana-rLOX在不同pH值条件下的酶活性，重复3次。

2）ana-rLOX的pH值稳定性分析。将anarLOX液的pH值调至6，7，8，9，10，4℃下放置5 h后，于pH值为9.0、25℃条件下测定ana-rLOX的酶活，重复3次。

1.3.3 CD光谱测定

采用圆二色光谱仪测定样品，质量浓度为0.15 g/L，每次进样量为400 μL，室温25℃，扫描范围为190～250 nm，分辨率为0.1 nm，扫描速度为100 nm/min，响应度为0.5 s，CD灵敏度为0.01×10-3，光谱带宽为1.0 nm，所有CD数据均经过3次扫描，取平均值。

1.3.4 ESR法测定不同缓冲体系中ana-rLOX产生的自由基

取60 μL待测样置于电子自旋共振波谱仪，ESR仪谐振腔，ESR测定条件中心磁场，0.347 6 T；微波功率，5 mW；微波频率，9.7 GHz；调制频率，100 kHz；调制幅度，2.00 G；温度，室温；扫描时间，60 s。

1.3.5 不同缓冲体系中ana-rLOX的高分辨率熔解分析

在96孔板中，将不同缓冲体系的ana-rLOX与罗氏染料混合，采用LightCycler®480系统进行熔解曲线分析，得到熔解温度Tm。

1.3.6 不同缓冲体系对ana-rLOX构象的影响实验

采用圆二色谱法，分别用pH值为4，5，6，7，8，9，10（0.05 mol/L PBS缓冲液以及Tris-HCl缓冲液）的缓冲液将酶液稀释10倍，加入相对应pH值的底物，在25℃下，测定ana-rLOX在不同pH值条件下的二级结构的变化。

1.3.7 实验设计与数据处理

实验结果使用SAS软件进行方差和显著性分析（p＜0.05）。

2 结果与分析

2.1 ana-rLOX的最适反应pH值及pH值稳定性分析

将酶置于不同pH值的缓冲液体系中，其余条件不变，测定ana-rLOX的活性，结果如图1。由图1可见，当pH值在4～10时，ana-rLOX的酶活力呈先上升后下降的趋势；当pH值大于9以后，酶活力急剧下降，当pH值为10时，酶活力相对于pH值为9时，降至5%；当pH值为7～9时，酶活力迅速升高。当pH值为9时，酶活达到最大值5.59×104U/mL，因此该酶的最适反应pH值为9。

图1 ana-rLOX最适反应pH值
Fig 1 Effect of pH on activity of ana-rLOX

将ana-rLOX置于不同pH值的缓冲体系中，4℃放置5 h后测定剩余酶活力，以未经处理的酶活力为100%，结果如图2。图2结果显示，ana-rLOX在pH值为7～8的范围内比较稳定，剩余的相对酶活均在75%以上；当pH值低于7或大于8时，剩余酶活呈显著降低趋势。当pH值为9时，剩余的相对酶活降至18.77%；当pH值为6时，剩余的相对酶活降至6。说明该酶对pH值小于7的酸或者pH值大于9的强碱比较敏感。虽然酶的最适反应pH值为9，但当酶在pH值为9的缓冲体系中，其状态并不稳定，酶活降至18.77%，说明pH值为9时，ana-rLOX的结构适合酶与底物的反应最大化，但并不适合酶的保存。

图2 ana-rLOX pH值稳定性
Fig.2 Effect of pH on activity stability of ana-rLOX

图3 ana-rLOX在不同缓冲体系中酶促反应的ESR谱
Fig.3 ESR spectra of ana-rLOX treated by different buffer

2.2 不同缓冲体系中ana-rLOX产生的自由基

电子自旋共振（ESR）法是唯一可以直接测定自由基的方法，本实验通过对ana-rLOX在不同缓冲体系中酶促反应的监测，观察酶促反应自由基产生量的差异，为确定ana-rLOX的最适反应pH值提供理论依据。自由基产生量的多少表现在波谱上为信号强弱，即峰高；图3显示了ana-rLOX在不同缓冲体系中酶促反应的ESR谱。当ana-rLOX在pH值7、pH值10的缓冲体系中时，并未检测到明显的自由基信号；采用分光光度法检测酶活时，在pH值7和pH值10的缓冲体系中是有酶活体现的，但是酶活较低。分析原因，可能是由于其酶促反应产生的自由基的量低于ESR检测限，因此没有被体现出来。当ana-rLOX在pH值8缓冲体系中时，能明显检测到自由基信号；当ana-rLOX在pH值9缓冲体系中时，自由基信号非常强；这一趋势与用分光光度法检测的ana-rLOX的酶活变化趋势相一致，因此，anarLOX的最适反应pH值为9。

2.3 不同缓冲体系中ana-rLOX的熔解分析

在一定条件下，蛋白质的稳定性可以用蛋白质熔解的方法来测定，蛋白质的稳定性与蛋白质的熔解温度Tm值相关。改变蛋白质的测试条件，其Tm值将会随之改变，从而反映出蛋白质稳定性的变化；蛋白质的熔解温度Tm值越高说明蛋白质的稳定性越好。图4显示了ana-rLOX在不同缓冲液体系中的熔解曲线和熔解温度，可以观察到随着pH值的升高，ana-rLOX的熔解温度呈先上升后下降的趋势。当pH值为7时，熔解温度最高，为58℃，说明在pH值为7时，ana-rLOX的稳定性最好。这个结果与用分光光度法测得的ana-rLOX的pH值稳定性结果一致。那么，在不同pH值条件下ana-rLOX的结果究竟发生了如何变化，从而影响了酶的活性和稳定性呢？

图4 ana-rLOX在不同缓冲体系中的熔解温度
Fig.4 Tmof ana-rLOX treated by different buffer

2.4 不同缓冲体系对ana-rLOX构象的影响

2.4.1 不同缓冲体系对ana-rLOX远紫外区CD光谱的影响

图5中给出不同缓冲体系处理的ana-rLOX的CD光谱，从CD光谱曲线中可以观察到195 nm处的正峰以及208，222 nm处的两个负峰，它们由多肽链的酰胺π-π和n-π跃迁所致，属于a-螺旋结构［17］。由图5可知，不同缓冲体系对ana-rLOX的CD光谱的影响程度不同，在不同缓冲体系中的anarLOX的CD光谱曲线，谱峰峰位和峰高均发生了不同程度的变化。

图5 不同缓冲体系中ana-rLOX的CD光谱
Fig.5 CD spectra of ana-rLOX treated by different buffer

不同缓冲体系中的ana-rLOX的CD光谱在195nm处的正峰峰位，在pH值为5和9时此峰位上没有明显正峰，在pH值为6，7，8时，此正峰峰位发生红移，从pH值为6时的195 nm红移至pH值为7、pH值为8的198 nm，红移了3 nm；并且正峰峰高在pH值为7时达到最高，随后下降。

不同缓冲体系中的ana-rLOX的CD光谱在208，222 nm处的负峰峰位有不同程度的蓝移。pH值为5，6时，在208 nm处没有负峰；pH值为8时负峰峰高最大，并随着pH值的增加，峰高减少明显。圆二色光谱变化表明，在不同缓冲体系中的anarLOX的螺旋的质量分数有不同程度的变化，说明了不同pH值条件下，由于离子的作用使ana-rLOX二级结构各单元之间发生转化，从而导致酶的活性和稳定性发生变化。

2.4.2 不同缓冲体系对ana-rLOX二级结构的影响

表1是利用CONTINLL软件计算ana-rLOX在不同缓冲体系中的二级结构的变化情况。由表1可知，ana-rLOX在不同缓冲体系中各二级结构的质量分数变化关系。

表1 不同缓冲体系对ana-rLOX二级结构的影响情况
Tab.1 Contents of secondary structures of ana-rLOX treated by different buffer%

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1）螺旋结构的质量分数的变化。随着pH值的升高，螺旋的含量呈先降低后升高的变化趋势，pH值为7时含量最低。2）折叠结构的质量分数变化。pH值为5，9，10时，折叠结构的质量分数均为0；pH值为8时，折叠结构的质量分数较pH值为7时有明显降低，从25%下降至16%。3）转角结构的质量分数变化。随着pH值的升高，转角结构的质量分数呈先降低后升高的变化趋势，pH值为6，7时，质量分数相同且最低；pH值为9时增幅最大。4）无序结构的质量分数变化。pH值为5时，无序结构的质量分数最高；pH值为6～9时，随着pH值的升高，无序结构的质量分数也随之升高，在pH值为9时的增幅最大。

总体来看，ana-rLOX二级结构的质量分数变化主要体现在折叠结构的转化，螺旋结构、转角结构与无序结构的质量分数随之发生变化。

2.4.3 缓冲体系对ana-rLOX相对活性和二级结构的影响

图6表示了ana-rLOX的相对活性和各二级结构的质量分数随pH值的变化情况。在pH值为6～9时，ana-rLOX的相对活性变化和螺旋结构、转角结构变化总体呈正相关，与折叠的质量分数变化呈负相关。最稳定的酶的二级结构是折叠结构、无序结构、螺旋结构和转角结构，其质量分数均在20%～30%。螺旋和折叠是维系蛋白空间结构的骨架，其结构中存在大量氢键，因此使其二级结构具有一定的稳定性；转角和无序结构中氢键只有很弱的作用，使各个残基间有更大的自由度，表现出极大的柔性。当蛋白处于不同的缓冲体系中时，蛋白分子的电荷分布发生改变，同时生物介质中的非极性分子发生位移极化，使极性分子发生取向极化。在不同的缓冲体系中，蛋白二级结构各组分的质量分数发生转化，是由于酶蛋白分子内部电荷分布的变化，使原有维系其螺旋和折叠结构稳定性的氢键取向发生改变［18-20］。

图6 不同pH值对ana-rLOX二级结构和酶活的影响
Fig.6 Effects of different pH values on second structure and activity of ana-rLOX

目前，研究酶活和二级结构含量之间相关性的研究较少，关于pH值对脂肪氧合酶构象的影响尚未见报道。有研究表明，螺旋含量下降，折叠含量增加，与酶的钝化有相关性，本研究结果也证实了这一点，即螺旋含量与酶活性成正相关，酶的稳定性与4种结构的平衡有关。

3 结 论

本研究首次对ana-rLOX的二级结构和pH值稳定性的关系进行了研究。通过分光光度法、ESR法和蛋白熔解确定该酶的最适反应pH值为9，最稳定pH值为7；通过圆二色谱法对ana-rLOX在不同缓冲体系的二级构象进行分析，发现在不同缓冲体系中，ana-rLOX的相对活性变化和螺旋结构，转角结构和无序结构有密切的关系。在pH值为6～9时，酶活性与螺旋结构、转角结构总体呈正相关，但与折叠结构的质量分数变化呈负相关。折叠的减少使酶活增加，但酶稳定性变差。最稳定的酶的二级结构是折叠结构、无序结构、螺旋结构和转角结构，其质量分数均在20%～30%。

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Effect of Different pH on Activity and Conformation of Ana-rLOX

WANG Xiaoming，ZHU Xiaoyu，ZHANG Chong，LÜ Fengxia，BIE Xiaomei，LU Zhaoxin*
（College of Food Science and Technology，Nanjing Agricultural University，Nanjing 210095，China）

Abstract:The conformations of Anabaena Sp.lipoxygenase（ana-rLOX），such as secondary structure，helical structure，turn structure，and disordered structure were studied in different pH buffers.The correlation between the activity and conformation of ana-rLOX was studied.The results showed that the optimal pH and the most stable pH of ana-rLOX were 9 and 7.The enzyme activity was correlated with the content of helical structure，turn structure，and disordered structure.The enzyme activity positively correlated with the helical structure and turn structure while the enzyme activity negatively correlated with the disordered structure under the pH value between 6 and 9.The enzyme was most stable when the contents of helix，sheet，turn，and random structures were 20%-30%.

Key words:lipoxygenase；enzyme activity；secondary structure；buffer solution

（责任编辑:叶红波）

中图分类号：TS201.3；TS202.3

文献标志码：A

doi:10.3969/j.issn.2095-6002.2015.04.004

文章编号：2095-6002（2015）04-0016-06

引用格式：汪晓鸣，朱筱玉，张充，等.酸碱度对重组鱼腥藻脂肪氧合酶构象与活性的影响［J］.食品科学技术学报，2015，33（4）:16-21.

WANG Xiaoming，ZHU Xiaoyu，ZHANG Chong，et al.Effect of different pH on activity and conformation of ana-rLOX［J］.Journal of Food Science and Technology，2015，33（4）:16-21.

收稿日期:2015-04-22

基金项目:国家自然科学基金资助项目（31470095）。

作者简介:汪晓鸣，女，助理研究员，博士，主要从事食品生物技术方面的研究；

*陆兆新，男，教授，博士，主要从事食品微生物与生物技术方面的研究。

通信作者。