孔雀石绿(malachite green,MG)又称苯胺绿、碱性绿、维多利亚绿或中国绿,是一种具有三苯甲烷结构的化工染料.因其对养殖鱼类的水霉病、鳃霉病和小瓜虫病的独特作用,在水产养殖业曾广泛应用.但孔雀石绿及其代谢产物隐色孔雀石绿具有高毒性、高残留、高致癌和高致畸、致突变等副作用.我国农业部于2002年5月将孔雀石绿列入《食品动物禁用的兽药及其化合物清单》中,禁止用于所有食品动物.同时还颁布的《无公害食品标准水产品中渔药残留限量》(NY 5070—2002)明确指出孔雀石绿不得检出.但由于孔雀石绿对鱼类水霉病、小瓜病等寄生虫性鱼病独特的防治效果,低廉的价格,况且现在仍无优良的替代药物,为此养殖户仍然在偷偷使用[1].目前测定鱼肉中孔雀石绿及其代谢物的检测方法主要为ELISA检测方法[2]、高效液相色谱法[3-7]、液相色谱-串联质谱法[8-12].本文利用加标空白样品提取液制作标准工作曲线来校正样品的基质效应以及回收率,使用甲醇直接提取鲜鱼肉中残留的孔雀石绿及其代谢物后直接上机检测,研究建立了一种较为快速的测定鲜鱼肉中的孔雀石绿及其代谢物残留量的高效液相色谱-串联质谱法,并取得较好效果.

1　材料与方法

1.1　试剂与仪器

甲醇,色谱纯,TEDIA公司;甲酸,分析纯,国药集团化学试剂有限公司;孔雀石绿标准溶液,100 μg/mL,农业部环境保护科研监测所研制;隐色孔雀石绿标准品,Dr Ehrenstorfer GmbH公司;乙腈,色谱纯,德国默克公司;实验用水为娃哈哈纯净水;50 mL刻度离心管.

UltiMate 3000型高效液相色谱仪,Thermo fisher公司;Thermo fisher TSQQUANTUM型三重四极杆质谱检测器(配电喷雾离子源ESI),Thermo fisher公司;Hypersil Gold型反相液相色谱柱(2.1 mm×100 mm,3μm),Thermo fisher公司;0.22μm有机相针管滤膜,Agela公司;样品粉碎机,九阳股份有限公司.

1.2　液相色谱条件

流动相为乙腈和体积分数为0.1%甲酸的水溶液,梯度洗脱为0～0.5 min,乙腈保持10%;0.5～6.5 min,乙腈由10%升至90%;6.5～9 min,乙腈保持90%;9～9.5 min,乙腈由90%降至10%;9.5～13 min,乙腈保持 10%;流速 0.2 mL/min,柱温25℃;进样量10μL.

1.3　质谱条件

电喷雾离子源,正离子模式;喷雾电压3 500 V;离子源温度为室温;鞘气压力为35 psi(2.07×105Pa);辅助气压力为10 ATM(1.01×106Pa);离子传输毛细管温度为350℃;碰撞气体为氩气,1.5 m torr(0.20 Pa);质谱divert valve状态为0～8 min处于waste状态,8～10 min处于load状态,10～13 min处于waste状态;选择反应扫描(selective reaction monitoring,SRM)模式检测,定量离子及定性离子利用仪器优化选出.碰撞能量采用仪器优化出的数值,质谱分析离子碎片以及优化后的碰撞能量见表1.

表1　孔雀石绿及隐色孔雀石绿的离子碎片及碰撞能量
Tab.1　Product ions and collision energy of malachite green and leucomalachite green

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1.4　溶液配制

1.4.1　流动相的制备

体积分数为0.1%甲酸的水溶液制备方法是吸取0.5 mL甲酸加入到500 mL水中,经0.22μm水相滤膜过滤.

1.4.2　标准溶液的制备

准确吸取0.5 mL的孔雀石绿标准溶液至50 mL容量瓶中,用甲醇定容,得1μg/mL的孔雀石绿标准溶液.准确称取50 mg的隐色孔雀石绿标准溶液至50 mL容量瓶中,用甲醇定容,得1 000μg/mL的隐色孔雀石绿标准溶液.准确吸取0.1 mL的隐色孔雀石绿标准溶液至100 mL容量瓶中,用甲醇定容,得1μg/mL的隐色孔雀石绿标准溶液.各从1 μg/mL的孔雀石绿及隐色孔雀石绿标准溶液中分别吸取0.025,0.05,0.1,0.2,0.25 mL加入到5个各加入5 g空白鱼肉样品的50 mL带有刻度的离心管中,用甲醇溶液定容至25 mL,充分振荡,得1,2,4,8,10 ng/mL的标准系列工作溶液.每个浓度溶液经0.22μm有机滤膜过滤后,取10μL注入高效液相色谱-串联质谱仪进行分析.

1.4.3　样品前处理

准确称取经样品料理机粉碎的待测鲜鱼肉样品5 g,加入至50 mL刻度离心管中,在样品中加入甲醇定容至25 mL,充分振荡,静置后取上清液经0.22 μm有机相滤膜过滤后,取10μL注入高效液相色谱-串联质谱仪,进行分析.

2　结果与讨论

2.1　样品前处理

在众多的检测水产品中孔雀石绿及隐色孔雀石绿的方法中,样品处理液的制备过程通常是采用一系列净化操作过程,操作较为烦琐并且浪费时间,且在固相萃取时如果操作不慎会使回收率下降且使分析结果重复性变差,由于孔雀石绿及其代谢物易溶于甲醇、乙腈等有机溶剂,且蛋白、脂肪这些样品中主要成分不易溶于甲醇、乙腈,但是乙腈提取液在静置后较为浑浊,需要净化.本文采用甲醇直接浸泡提取鲜鱼肉中孔雀石绿及隐色孔雀石绿,样品处理液用0.22μm的有机滤膜过滤后,就注入高效液相色谱仪-串联质谱联用仪中进行检测.考虑到在电喷雾质谱分析中,复杂基质的样品可能会产生与分析物竞争电荷降低离子化效率的基质效应,本文通过使用空白样品添加标准品来制作标准曲线,以消除样品的基质效应以及校正回收率,经过试验证明,方法准确度较高.

2.2　色谱图

实验得到孔雀石绿及其代谢物标准样品、空白样品、加标空白样品的总离子流(total ion chromatogram,TIC)图分别如图1、图2和图3.加标后鲜鱼肉样品不经过色谱柱分离,而直接在m/z 311～315 u进行全扫描质谱分析见图4.孔雀石绿及其代谢物的出峰时间在8～10 min.在该色谱质谱条件下,实验结果良好.

2.3　标准曲线和检出限

图1　孔雀石绿及隐色孔雀石绿标准样品的TIC
Fig.1　TIC chromatograms of standards of malachite green and leucomalachite green

图2　空白鲜鱼肉样品的TIC
Fig.2　TIC chromatogram of blank fresh fish meat

图3　加标鲜鱼肉样品的TIC
Fig.3　TIC chromatogram of blank fresh fish meat added with malachite green and leucomalachite green

在实验条件下,以峰面积y为纵坐标,质量浓度x(ng·mL-1)为横坐标绘制标准曲线,得线性方程,以基线噪声3倍峰面积对应的质量浓度为检出限(limit of detection,LOD)(S/N=3),以基线噪声10倍峰面积对应的质量浓度为定量限(limit of quantity,LOQ)(S/N=10)[13],回归方程、相关系数及检出限见表2.

图4　311～351 u加标鲜鱼肉样品全扫描质谱
Fig.4　Mass spectrum of sample dilution with standard in SCAN mode during 311～351 u

表2　回归曲线的基本参数
Tab.2　Basic parameters of the regression equation

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2.4　精密度和加标回收实验

取不含孔雀石绿及其代谢物的鲜鱼肉样品进行加标回收实验,向5 g样品中分别添加1μg/mL孔雀石绿及隐色孔雀石绿标准溶液0.025,0.125,0.25 mL,即样品中孔雀石绿及隐色孔雀石绿含量为分别为5,25,50μg/kg.按1.4.3节样品处理方法进行样品处理,重复6次,精密度和回收率计算结果见表3.

表3　样品添加回收和精密度实验
Tab.3　Spiked recovery and precision test

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由表3可知,采用本方法所得数据满足检测要求.

3　结 论

通过实验建立了甲醇直接浸泡提取法测定鲜鱼肉中孔雀石绿及其代谢物含量的高效液相色谱法-串联质谱法,前处理简单,无须固相萃取等一系列净化、浓缩过程.测试结果稳定且准确度较高,样品加标回收率符合标准检测方法要求范围,在灵敏度与精确度方面能与已报道的相关检测方法到达一致水平.该方法节省了检测时间,又节约检测成本,在实际的检测工作中具有一定的参考价值.该方法的灵敏度高,选择性好,不需要特殊的净化,缩短了整个样品的分析时间,适用于鲜鱼肉中的孔雀石绿及其代谢物的快速定性及定量分析.

参考文献：

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[2] 王权,郭德华,李健,等.孔雀石绿间接竞争ELISA检测方法的建立[J].畜牧与兽医,2010,42(2):6-9.

[3] 肖琴,林一,郑琳,等.分子印迹固相萃取——高效液相色谱法检测鱼肉中的孔雀石绿和结晶紫[J].粮油食品科技,2011,19(6):31-34.

[4] 陈永平,张素青,李春青,等.高效液相色谱法测定水产品中孔雀石绿残留量方法的改进[J].动物医学进展,2011,32(11):80-84.

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[6] 张宗祥,陈军.高效液相色谱法测定鱼肌肉中的孔雀石绿残留[J].地质学刊,2010,34(2):206-208.

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[8] 徐彦辉,顾亮,蒋俊树,等.液相色谱串联质谱法测定养殖水体中孔雀石绿及其代谢物[J].化学分析计量,2011,20(2):49-51.

[9] 王丽敏,杜雪莉,赵艳,等.超高效液相色谱-串联质谱快速测定水产品中孔雀石绿、结晶紫及其代谢物残留量[J].南方水产,2010,6(4):32-36.

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[11] 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局.GB/T 19857—2005水产品中孔雀石绿和结晶紫残留量的测定[S].北京:中国标准出版社,2005.

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Quick Determination of Contents of Malachite Green and it's Metabolites in Fresh Fish Meat by HPLC-MS/MS

ZONG Wanli, LU Gang
(Weihai Supervision and Inspection Institute of Product Quality,Weihai 264209,China)

Abstract:A method was established for the determination of contents of malachite green and it's metabolites in fresh fish meat by HPLC-MS/MS.The electrospray positive-ion mode was applied for ionization and the selective ion monitoring mode(SRM)was used for quantification.The quantitative ion pairs of malachite green and leucomalachite green were 329＞313 and 331＞239.The detection limits of malachite green and leucomalachite green were 0.002 2 ng/mL and 0.043 3 ng/mL,and the limits of quantification of green and leucomalachite green were 0.007 3 ng/mL and 0.14 ng/mL.The liner ranges of the samples both were 1-10 ng/mL and RSD were less than 4%(n=6).

Key words:HPLC-MS/MS;fresh fish meat;malachite green;malachite green metabolites

中图分类号：TS207.3

文献标志码：A

doi:10.3969/j.issn.2095-6002.2014.06.014

文章编号：2095-6002(2014)06-0072-05

引用格式：宗万里,鲁刚.HPLC-MS/MS法快速测定鲜鱼肉中孔雀石绿及其代谢物含量.食品科学技术学报,2014,32(6):72-76.

ZONG Wanli,LU Gang.Quick determination of contents of malachite green and it's metabolites in fresh fish meat by HPLC-MS/MS.Journal of Food Science and Technology,2014,32(6):72-76.

收稿日期:2013 07 26

作者简介:宗万里,男,工程师,主要从事食品检测方面的研究.

(责任编辑:李 宁)