杜仲(Eucommia ulmoides Oliv.)为木兰纲金缕梅亚纲杜仲目杜仲科落叶乔木,又名扯丝皮、丝棉皮、思仙、思仲、木绵、石思仙、丝连皮,为我国名贵药用植物.随着对杜仲在医疗、工业、保健等多个领域研究的不断深入,尤其是具有胶塑二重性的杜仲胶,已经引起了人们的广泛关注[1].除杜仲胶外,杜仲中还含有具有抗菌利胆、止血、增高白血球及抗病毒作用的绿原酸、黄酮类化合物等有效成分,黄酮类化合物中槲皮素具有抗自由基等作用[2].

目前对杜仲资源的利用,主要用于提取杜仲黄酮.因为杜仲胶经济价值不及杜仲黄酮,所以在提取黄酮过程后,杜仲胶就被舍弃.本实验将杜仲皮首先分成两部分,分别用于提取杜仲胶和杜仲黄酮,减少杜仲中有效成分的损失.

超声波是频率高于20 kHz的声波[3],超声辅助提取法是借助于超声过程中产生的强烈空化作用来破坏植物细胞壁,加速细胞内容物脱离植物基体进入溶剂的过程[4].超声产生的机械振荡作用还可加快两相间的传质过程,提高传质速率,增大提取效率[5].超声辅助提取法的另一优点是低温提取,对于某些热不稳定的化合物尤为有效[6].Corrales等[7]比较了超声辅助提取法、静水压法和脉冲电场法对从葡萄中提取花青素的能力.Sanz等[8]利用超声场从大米中提取砷,提取率达到95%,提取时间只需几分钟,比传统提取方法减少数小时.Matthieu等[9]利用超声辅助提取法提取苹果渣中的多酚物质,提取率提高20%.Venkatasubramanian等[10]利用超声技术从甜菜中提取色素,提取率提高8%.Aparna等[11]研究了从杏仁中超声辅助提取杏仁油的工艺,使提取时间缩短为6 h,提取率提高77%.曹雁平等[12-14]、易克传等[15]对利用超声辅助提取法从植物中提取茶多酚、咖啡因、大蒜素、绞股蓝总皂甙等有效物质进行了深入研究,结果表明,超声辅助提取技术可以加快提取速度,提高提取效率.

1 材料与方法

1.1 材料和仪器

杜仲皮,购于河北祁新中药公司,产地四川.

FW-100型高速万能粉碎机,中国中兴伟业公司;ZW-0.05/7-x型无油空气压缩机,中国中浩公司;JXD-02型功率超声器,中国金星公司;RVC 2-18型离心浓缩机,美国CHRIST公司;RF-5301pc型分光光度仪,日本岛津公司;AVANCE III型核磁共振仪,瑞士布鲁克公司.

石油醚(沸程60～90℃)、丙酮,分析纯,购于北京化工厂.

1.2 实验方法

1.2.1 杜仲皮前处理

将5 g杜仲皮原料烘干后,用粉碎机粉碎.粉碎是为了破坏杜仲皮细胞壁和纤维质,使胶丝外露,有利于有机溶解提取.

1.2.2 物料分选

杜仲皮粉分成絮状物和粉状物两部分,直径1 mm以内称为粉状物,大于1 mm为絮状物,分别用于提取杜仲胶和杜仲黄酮.使用通过1 mm孔径筛分(体积不同)和风选筛分(比重不同)两种方法进行区分杜仲皮粉中的絮状物和粉状物.在空气压缩机出风口接一长细管,出风口直径1.2 cm,面积1.13 cm2,,使其出风均匀,物料在出风口处下落直至静止始终受到风力影响,下落高度10 m.参数为物料质量及空气压缩机出风量,考察物料移动距离及分选质量.将絮状物和粉末分开,絮状物用于提取杜仲胶,粉状物用于提取杜仲黄酮.

1.2.3 超声提取工艺流程

由于杜仲胶在高温的石油醚中有很好的溶解性,将处理后的絮状物原料与石油醚混合装入圆底烧瓶置于85℃超声水浴场中提取杜仲胶,以一定的超声条件提取,圆底烧瓶上接冷凝回流装置,避免有机提取溶剂损失.将粉状物原料用体积分数为70%的乙醇在85℃下,提取杜仲黄酮.

1.2.4 杜仲胶的析出与精制

由于低温环境下杜仲胶在石油醚中的溶解度急剧下降,将提取液过滤后,置于-20℃冰箱3 h冷冻析出杜仲胶,滤去溶剂得到粗胶,将粗胶用丙酮洗涤,离心浓缩后过滤得到纯白色精胶.

1.2.5 提取条件的选择

选取频率为28,40,50,135 kHz的超声波,在超声功率0.05,0.15,0.25,0.35,0.45 W/cm2,提取时间1.0,1.5,2.0,2.5,3.0 h,物料质量浓度50.00,62.50,83.33,125.00,250.00 mg/mL的范围内进行研究.

1.2.6 芦丁标准溶液的配制

105℃干燥的芦丁标准品15 mg,加甲醇溶解并定容至100 mL,配置成150 μg/mL的芦丁标准溶液.取0.5,1.0,2.0,3.0,4.0 mL,加入体积分数为30%乙醇至5 mL,加0.3 mL质量分数为5%的NaNO2,5 min后加0.3 mL质量分数为10%的Al(NO3)3,6 min后加2 mL1 mol/L的NaOH,用30%乙醇加至10 mL,510 nm测吸光度绘制曲线,用于杜仲黄酮定量.

2 结果与讨论

2.1 物料分选

对5 g已用粉碎机打碎的杜仲原料进行风选,见表1.通过和1 mm孔径筛分选的结果比较,由表1可知,风速为4.9 m/s时,分选效果已经基本达到目的,和1 mm筛选效果(3 g杜仲皮粉得到2 g絮状物)近似.

表1 物料分选结果
Tab.1 Results of material sorting

风量/(L·h-1)风速/(m·s-1)絮状物移动距离/cm粉状物移动距离/cm絮状物分选质量/g 1 500 3.7 0 10 4.6 1 750 4.3 0 12 4.0 2 000 4.9 2 13 3.2 2 250 5.5 5 15 3.1 2 500 6.1 10 20 3.0

2.2 不同形态物料杜仲胶和杜仲黄酮含量的比较

将絮状物和粉状物的粒度以1 mm为界,直接提取黄酮,絮状物中可提取ω(黄酮)=1%.先提取杜仲胶再提取黄酮,絮状物可提取 ω(黄酮)=2.5%.直接提取黄酮,粉末中可提取ω(黄酮)=1.45%.先提取杜仲胶再提取黄酮,粉末可提取黄酮4%.直接提取杜仲胶,絮状物中可提取ω(杜仲胶)=9%.先提取黄酮再提取杜仲胶,絮状物可提取ω(杜仲胶)=1%.直接提取杜仲胶,粉状物中可提取ω(杜仲胶)=2.5%.先提取黄酮再提取杜仲胶,粉末可提取ω(杜仲胶)=0.5%.

通过对絮状物料和粉末状物料分别在85℃下,物料质量浓度50.00 mg/mL,用石油醚浸提2 h提取杜仲胶和85℃下,与物料质量浓度50.00 mg/mL,用体积分数为70%乙醇溶液浸提2 h提取杜仲黄酮的结果比较发现,将杜仲粉碎后,粉状物中杜仲胶的含量远小于絮状物中杜仲胶含量.并且,对物料先提取胶再提黄酮,更有利于杜仲胶和杜仲黄酮的利用.

2.3 超声条件影响分析

2.3.1 超声频率对提取效果的影响

用石油醚85℃提取2 h,物料质量浓度50.00 mg/mL,3 g杜仲絮状物,将超声功率设定为0.25 W/cm2,研究超声频率分别为28,40,50,135 kHz下的提取效果,与非超声提取效果进行比较,结果如图1.由图1可知40 kHz的超声频率对杜仲胶的提取效果较好,相对于非超声,提取量提高234%.

图1 超声频率对杜仲胶提取效果的影响
Fig.1 Effects of ultrasonic frequencies on yield of gutta-percha

2.3.2 超声功率对提取效果的影响

用石油醚85℃提取2 h,物料质量浓度50.00 mg/mL,3 g杜仲絮状物,将超声频率设定为40 kHz,研究功率分别为0.05,0.15,0.25,0.35,0.45 W/cm2下的提取效果,结果如图2.图2表明杜仲胶的提取量随超声功率的提高而增长.

图2 超声功率对杜仲胶提取效果的影响
Fig.2 Effects of ultrasonic powers on yield of gutta-percha

2.3.3 时间对提取效果的影响

用石油醚在85℃下提取,物料质量浓度50.00 mg/mL,3 g杜仲絮状物,将超声频率设定为40 kHz,超声功率设定为0.25 W/cm2,研究超声时间分别为1.0,1.5,2.0,2.5,3.0 h下的提取效果,结果如图3.图3表明杜仲胶的提取量随提取时间的提高而增长.

图3 时间对杜仲胶提取效果的影响
Fig.3 Effects of different extraction time on yield of gutta-percha

2.3.4 物料质量浓度对提取效果的影响

用石油醚在85℃下提取2 h,将超声频率设定为40 kHz,超声功率设定为0.25 W/cm2,3 g杜仲絮状物,研究物料质量浓度分别为50.00,62.50,83.33,125.00,250.00 mg/mL条件下的提取效果,结果如图4.图4表明杜仲胶的提取量随物料质量浓度的提高而减小.

图4 物料质量浓度对杜仲胶提取效果的影响
Fig.4 Effects of different mass concentration on yield of gutta-percha

2.4 杜仲胶的定性

2.4.1 韦氏法

用韦氏法[16]定性产物,将所得提取物0.1 g剪成细小颗粒,将其放入坩埚里,滴加少量的CCl4,待其发生溶胀后,加入4～6滴溴水,再在样品表面加入2 g苯酚将其覆盖.为加快其反应,将坩埚放置于沸水浴上,以蒸汽辅助加热5 min,使CCl4挥发.观察产物颜色,若为紫色、褐色或蓝色,则证明产物为杜仲胶.这种定性方法的优点是灵敏度高.本实验中所提取的产物呈褐色.

2.4.2 提取物的核磁谱图

将微量提取物溶解于氘代苯,进行1H-NMR分析,如图5.将图5进行解析并与标准样品谱图[17]对比,确定结构为杜仲胶.

图5 杜仲胶核磁共振谱图对比
Fig.5 NMR spectra comparison of gutta-percha

3 结 论

研究表明,40 kHz的超声波辅助提取效果较好,相对于非超声,提取物质量提高234%,3 g杜仲絮状物,超声功率0.45 W/cm2下物料质量浓度50.0 mg/mL提取3 h,提取量可达0.49 g,并且提取量随功率、提取时间和液料比的增加而提高.由于杜仲胶性质稳定,在鉴别方面一直存在困难,本实验通过灵敏度高的韦氏法和精确度高的1H-NMR对产物进行了鉴别,对本实验结果的准确度加以保证.

本研究为杜仲资源的综合利用提供了新的思路,在提取黄酮的过程中,杜仲胶损失少,利用物料预处理分选的方式,使杜仲胶和杜仲黄酮达到分别提取的效果,并且在提取过程中加以超声辅助,加快提取速度,提高提取效率.

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