中国是世界上最大的柑橘产地国之一,柑橘年产量约为1500万t[1-3].柑橘皮约占整果重的20%,研究表明柑橘皮中含有丰富的精油、色素、果胶、膳食纤维、黄酮类化合物等生物活性物质[4-8],而目前我国除了将少量柑橘皮用来提取香精油和制成中药外,大部分被遗弃.柑橘皮色素是一类性能较稳定、安全可靠的天然色素,其主要成分是柠檬烯与类胡萝卜素的混合物,还富含维生素E和稀有元素硒[9-10].传统的柑橘皮色素提取主要采用无水乙醇、石油醚进行水浴浸提,这种方法不仅操作繁杂,而且耗费时间,效率低下[11-12].本研究拟采用超声波辅助法提取柑橘皮色素,应用响应面优化法以期得到较佳提取工艺,旨在为柑橘皮的进一步开发利用提供科学依据.

1 材料与方法

1.1 实验材料与仪器

1.1.1 实验材料

柑橘皮制作采用市售成熟柑橘,去掉果肉后,剩鲜橘皮用适量清水冲洗干净,置于烘箱内烘干,避光保存,备用;无水乙醇为分析纯;超纯水.

1.1.2 实验仪器

ES-200A型电子天平,长沙湘平科技发展有限公司;KQ-500GTDV型高频恒温数控超声波清洗器,昆山市超声仪器有限公司;UV-2450型紫外—可见光分光光度计,日本岛津公司;Avanti J-26XP型高效离心机,美国贝克曼库尔特有限公司.

1.2 实验方法

1.2.1 工艺流程

柑橘皮→40℃鼓风干燥→粉碎→过筛→水浴浸提并超声处理→离心→浓缩→真空干燥→色素产品.

1.2.2 色素提取溶剂的选择和柑橘皮粉碎粒度的确定

1)色素提取溶剂的选择.准确称量5份2.000 0 g粉碎的柑橘皮,分别加入蒸馏水、无水乙醇、乙酸乙酯、石油醚、三氯甲烷各40 mL,室温浸提120 min后过滤离心,取上清液稀释同等倍数后,在紫外分光光度计下进行光谱扫描,找到较佳吸收波长,确定最适提取溶剂.

2)柑橘皮粉碎粒度的确定.准确称量20～40目、40～60目、60～80目、80～100目、100～120目柑橘皮粉各2.000 0 g置于100 mL烧杯中,分别加入20 mL无水乙醇溶液,用玻璃棒搅匀,在室温下浸提30 min,过滤离心,比色法测吸光度值,研究不同颗粒大小对提取效果的影响.

1.2.3 超声辅助提取柑橘皮色素单因素实验

1)料液比的确定.取6个100 mL烧杯,每个烧杯加入20 mL无水乙醇,按质量(g)与体积(mL)比为 1∶6、1∶8、1∶10、1∶12、1∶14、1∶16 的料液比,准确称取过80目柑橘皮粉分别加入到6个烧杯中,在温度为30℃,超声功率为200 W条件下,超声波辅助浸提15 min,取出后过滤、离心,用移液管分别量取1 mL上清液稀释同等倍数后,测吸光度值,研究不同料液比对柑橘皮色素提取效果的影响.

2)超声功率对柑橘皮色素提取效果的影响.分别称取过80目柑橘皮粉2.000 0 g于6个烧杯中,按料液比1∶20向烧杯中加入无水乙醇.用玻璃棒搅拌均匀后,置于超声波发生器中,在温度为20℃,超声波功率分别为200,250,300,350,400,450 W下浸提15 min.测量不同功率条件下所得提取液的吸光度值,研究超声波功率对柑橘皮色素提取效果的影响.

3)超声时间对柑橘皮色素提取效果的影响.分别称取过80目柑橘皮粉2.000 0 g于6个烧杯中,按料液比1∶20向烧杯中加入无水乙醇.用玻璃棒搅拌均匀后,置于超声波发生器中,在超声波功率200 W,温度为20℃下分别提取5,10,15,20,25,30 min.测量不同时间条件下所得提取液的吸光度值,研究超声波辅助提取时间对提取效果的影响.

4)温度对柑橘皮色素提取效果的影响.分别称取过80目柑橘皮粉2.000 0 g于6个烧杯中,按料液比1∶20向烧杯中加入无水乙醇.用玻璃棒搅拌均匀后,置于超声波发生器中,在超声波功率为200 W,温度分别为30,40,50,60,70,80℃下浸提15 min.测量不同温度条件下所得提取液的吸光度值,研究超声波辅助提取温度对柑橘皮色素提取效果的影响.

1.3 响应面优化

在单因素实验的基础上,选取A(液料比)、B(超声波功率)、C(提取时间)、D(提取温度)4个因素综合软件Design-Expert 8.05b中的Box-Benhnken试验原理,设计四因素三水平试验,见表1.

表1 响应面设计因素与水平
Tab.1 Factors and levels of response surface methodology design

因素水平A液料比B C D超声波功率/W提取时间/min提取温度/℃-1 8 250 10 60 0 10 300 15 70 1 12 350 20 80

2 结果与分析

2.1 色素提取溶剂的选择和柑橘皮粉碎粒度的确定结果

2.1.1 色素提取溶剂的选择结果

对不同溶剂提取柑橘皮色素的提取液进行光谱扫描得图1,可看出该色素的最大吸收波长在330 nm左右.蒸馏水、无水乙醇、乙酸乙酯、三氯甲烷的提取效果都不错,但蒸馏水提取液含成分较多,不利于色素的分离分析,而乙酸乙酯和三氯甲烷成本较高,且三氯甲烷有较强毒性,综合考虑,本实验采用无水乙醇作为提取溶剂,光谱扫描测得乙醇提取液的最大吸收波长为328 nm,因此,选择328 nm作为本实验的较佳吸收波长.

图1 不同提取溶剂的光谱扫描结果
Fig.1 Spectrum scanning image of different extraction solvent

2.1.2 柑橘皮粉碎粒度的确定结果

比色法测不同粒度条件下色素提取液的吸光度值得图2,可知柑橘皮的粉碎粒度对色素的提取有一定影响,粉碎粒度过大,色素不能完全从原料中溶解出来;过细,则易结团,阻塞扩散通道,溶液流动阻力增加,导致提取效果下降.因此柑橘皮粉碎成80目时,提取效果较好.

图2 原料粉碎粒度对提取效果的影响
Fig.2 Effect of raw material particle size on extracting yield

2.2 单因素实验结果

2.2.1 料液比与柑橘皮色素提取效果的关系

比色法测不同料液比时色素提取液的吸光度值得图3.由图3可知较佳料液比为1∶10.

图3 料液比对柑橘皮色素提取效果的影响
Fig.3 Effect of different ratios of solid to liquid on extracting yield

2.2.2 超声波功率与柑橘皮色素提取效果的关系

比色法测不同功率条件下色素提取液的吸光度值得图4.由图4可知柑橘皮色素的吸光度随着超声波功率的提高而增加,超声功率在300 W时达到最高,之后功率继续增加,吸光度基本保持在一个平稳状态不再增加,为节约能源,实验选择300 W作为较佳提取功率.

图4 超声波功率对柑橘皮色素提取效果的影响
Fig.4 Effect of ultrasonic output power on extracting yield

2.2.3 超声时间与柑橘皮色素提取效果的关系

比色法测不同超声处理时间条件下色素提取液的吸光度值得图5.由图5可知超声辅助浸提15 min后吸光度达到最大,继续延长提取时间,吸光度基本无变化,为了节省时间,实验选择15 min为色素较佳提取时间.

图5 超声时间对柑橘皮色素提取效果的影响
Fig.5 Effect of ultrasonic extraction time on extracting yield

2.2.4 温度与柑橘皮色素提取效果的关系

比色法测不同温度条件下色素提取液的吸光度值得图6.由图6可知吸光度随着提取温度的升高而增加,当温度达到70℃时,继续升高温度,吸光度不再显著增加,趋于平稳.考虑到过高温度会导致色素分解,本实验选择70℃为色素较佳提取温度.

图6 不同温度对柑橘皮色素提取效果的影响
Fig.6 Effect of different temperatures on extracting yield

2.3 响应面优化的结果与分析

2.3.1 响应面优化设计及结果

应用软件Design-Expert 8.05b中的 Box-Benhnken试验原理,以吸光度为响应值,响应面分析设计及试验结果如表2.

2.3.2 响应面方差分析

响应面二次回归方程方差分析见表3.由表3可以看出,料液比、超声波功率、提取时间、提取温度、料液比二次、超声波功率二次、提取时间二次、提取温度二次达到极显著水平.利用Design-Expert软件对数据进行多元回归拟合,得到柑橘皮色素吸光度(Y)对料液比(A)、超声波功率(B)、提取时间(C)、提取温度(D)的二次多项回归模型:

该方程的相关系数R2=0.984 9.由表3的方差分析可知,失拟差Prob＞F=0.090 2＞0.05,表明失拟差项不显著,方程对实验拟合是合适的;模型Prob＞F值＜0.000 1,说明该回归方差模型是极显著的,模型拟合程度较好,可以用于柑橘皮色素提取工艺的预测和分析.

表2 响应面分析设计与试验结果
Tab.2 Central composite design with the observed responses for absorbance of pigment from citrus peels

试验号 A B C D 吸光度值1 0 0 1 1 0.859 2 -1 0 0 1 0.851 3 0 0 1 -1 0.801 4 0 0 0 0 0.855 5 -1 -1 0 0 0.817 6 0 1 0 -1 0.816 7 0 -1 0 1 0.841 8 1 -1 0 0 0.787 9 1 0 1 0 0.814 10 0 0 0 0 0.86 11 0 0 0 0 0.853 12 1 0 0 1 0.845 13 0 1 1 0 0.857 14 0 0 -1 -1 0.743 15 0 0 -1 1 0.798 16 0 1 -1 0 0.776 17 1 0 0 -1 0.785 18 -1 0 -1 0 0.77 19 0 -1 -1 0 0.746 20 -1 0 0 -1 0.799 21 -1 1 0 0 0.851 22 0 -1 0 -1 0.78 23 0 0 0 0 0.862 24 1 1 0 0 0.811 25 0 0 0 0 0.856 26 0 1 0 1 0.868 27 -1 0 1 0 0.849 28 0 -1 1 0 0.825 29 1 0 -1 0 0.754

2.3.3 提取工艺的响应面分析与优化

通过Design-Expert 8.05b软件,根据回归方程分析得响应面图7至图12.由图7可知,在提取时间为15 min,提取温度为70℃条件下,料液比对吸光度值的影响较为明显,超声波功率次之,吸光度值随着料液比的升高先升高再降低,这可能是因为在料液比为1∶10时,色素基本被提取出来,继续增加提取剂的比重只是稀释了色素的浓度,从而降低了吸光度值.图8显示在超声波功率为300 W,提取温度为70℃时,提取时间对吸光度值的影响明显,提取时间增加,色素提取液的吸光度值不断增加,当增加到一定值以后便趋于平稳,这可能是因为在此条件下色素已最大限度被提取,继续延长提取时间,也不能对提取效果产生较为明显的影响.图9显示在超声波功率为300 W,提取时间为15 min时,吸光度值随着温度的升高而增加,由于高温既能提高色素的提取率,同时也会分解色素,所以当温度达到一定值后,吸光度值增加不再明显.综合图7至图12可得出,超声波辅助提取柑橘皮色素,提取时间对提取效果的影响较为显著,温度、超声功率、料液比的影响较小.

表3 二次回归方程方差分析结果
Tab.3 Analysis of variance quadratic regression equation

方差来源 平方和 自由度 均方 F值 Prob＞F 65.05 ＜0.000 1 A-料液比 1.657×10-3 1 1.657×10-336.94 ＜0.000 1 B-超声波功率2.791×10-3 1 2.791×10-362.23 ＜0.000 1 C-提取时间 0.015 1 0.015 324.65＜0.000 1 D-提取温度 9.520×10-3 1 9.520×10-3212.28＜0.000 1 AB 2.500×10-5 1 2.500×10-50.56 0.467 7 AC 9.025×10-5 1 9.025×10-52.01 0.177 9 AD 1.600×10-5 1 1.600×10-50.36 0.559 9 BC 1.000×10-6 1 1.000×10-60.022 0.883 4 BD 2.025×10-5 1 2.025×10-50.45 0.512 6 CD 2.250×10-6 1 2.250×10-60.050 0.826 0 A2 3.168×10-3 1 3.168×10-370.64 ＜0.000 1 B2 1.842×10-3 1 1.842×10-341.06 ＜0.000 1 C2 0.010 1 0.010 228.24＜0.000 1 D2 1.553×10-3 1 1.553×10-334.64 ＜0.000 1残差 6.279×10-4 14 4.485×10-5失拟差 5.731×10-4 10 5.731×10-54.18 0.090 2净误差 5.480×10-5 4 1.370×10-5总离差模型 0.41 14 2.917×10-3 0.041 28 -1

2.3.4 较佳工艺条件的确定及验证实验

通过Design-Expert 8.05b软件求解方程,得到优化的工艺条件为料液比 1∶9.4,超声波功率321.19 W,提取时间17.34 min,提取温度78.71℃.考虑实际操作的方便性及可行性,将优化的工艺确定为料液比1∶9,超声波功率300 W,提取时间17 min,提取温度79℃.为检验其可靠性,该条件下进行3次平行实验,测得柑橘皮色素的吸光度值为0.874,与理论值基本吻合,说明响应面分析法得到的优化的柑橘皮色素提取工艺真实可靠,具有一定的实用价值.

图7 超声波功率和料液比对吸光度的影响
Fig.7 Effect of ultrasonic power and solid-liquid ratio on absorbance

图8 提取时间和料液比对吸光度的影响
Fig.8 Effect of extraction time and solid-liquid ratio on absorbance

图9 提取温度和料液比对吸光度的影响
Fig.9 Effect of temperature and solid-liquid ratio on absorbance

图10 提取时间和超声波功率对吸光度的影响
Fig.10 Effect of extraction time and ultrasonic power on absorbance

图11 提取温度和超声波功率对吸光度的影响
Fig.11 Effect of temperature and ultrasonic power on absorbance

图12 提取温度和提取时间对吸光度的影响
Fig.12 Effect of temperature and extraction time on absorbance

3 结 论

在单因素实验基础上,采用响应面法优化柑橘皮色素超声波辅助提取工艺,得到较佳条件为:提取溶剂为乙醇,柑橘皮粉碎粒度为80目,料液比为1∶9(g/mL),超声波功率为300 W,提取时间为17 min,提取温度为79℃,此条件下柑橘皮色素提取效果最好.色素经离心去渣、浓缩、真空干燥后可得到固体成品.

超声波辅助提取技术与传统的浸提法相比大大缩短了提取时间,且操作简便,效率更高.应用响应面优化超声波辅助提取工艺,可对各因素进行全面、系统的研究,得到优化的工艺参数,可为充分利用资源提供科学依据.

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