Page 85 - 《食品科学技术学报》2020年第4期

8 0 食品科学技术学报摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 2020 年 7 月

生长特性 [7] ,而在高糖环境下鲁氏酵母菌生长、代 的 OD 值。 取 5 mL 发酵液样品,用 pH 计测定 pH
谢及相关基因表达方面研究较少。 本实验室在前期 值。 采用血球计数法测定鲁氏酵母菌数量 [8] 。
研究中发现,在 D鄄果糖调控下,鲁氏酵母菌发酵液 1郾 3郾 3摇 鲁氏酵母菌发酵液代谢物含量的测定
呈现更好的风味,推测糖调控促进鲁氏酵母菌代谢 取 100 滋L 样本,加入 400 滋L 含有 2鄄氯苯丙氨
合成更多的风味物质;因此,结合转录组分析,本研 酸的提取液(甲醇、乙腈体积比为 1颐 1,2鄄氯苯丙氨
究进一步探索 D鄄果糖对鲁氏酵母菌生理特性的影 酸质量浓度为 2 滋g / mL),涡旋混匀 30 s,超声 5 min
响,揭示其增香的分子机制,以期为鲁氏酵母的发酵 (冰水浴),零下 20 益 静置 1 h。 将样本于 4 益、

产香提供理论参考。 12 000 r/ min 离心 15 min,取 425 滋L 上清液于 EP 管
中,在真空浓缩器中干燥提取物。 向干燥后的代谢
1摇 材料与方法 物中加入 100 滋L 水复溶,涡旋 30 s,冰水浴超声 10
min。 将样本于 4 益,12 000 r/ min 离心 15 min,取出
1郾 1摇 材料与试剂
60 滋L 上清液于 2 mL 进样瓶,每个样本各取 10 滋L
鲁氏酵母菌,购自中国普通微生物菌种保藏中
混合成 QC(quality control)样本,再取 60 滋L 上机检
心,保藏编号为 No. 32899。 NaCl,化学纯,购自天津
测 [9] 。
大茂化学试剂公司;D鄄果糖,化学纯,购自上海源叶
1郾 3郾 4摇 鲁氏酵母菌转录组学测定与分析
生物技术公司;YPD 培养基,购自青岛希望生物技
1郾 3郾 4郾 1摇 RNA 提取
术有限公司;其他试剂均购买于德国 CNW 科技有
将培养好的鲁氏酵母菌悬液于 4 益 条件下,
限公司。
12 000 r/ min离心 3 min,弃上清液后置于离心管(千
1郾 2摇 仪器与设备
分之一浓度的 DEPC 水处理),放入液氮中,待菌体
HZQ-QX 型全温空气恒温振荡器,北京东联哈 凝固后倒入预冷好的研钵中进行研磨。 将菌体研磨
尔仪器制造有限公司;Centrifuge5430R 型高速冷冻 为白色粉末,并转移到 1郾 5 mL Eppendorf 管中。 采
离心机,德国艾尔德股份公司;SW-CJ -2G 型超净 用 Trizol 法进行 RNA 提取,并对总 RNA 的质量初

工作台,苏州净化设备有限公司;FE28-S 型 pH 计,
步鉴定,包括琼脂糖凝胶电泳分析 RNA 降解程度,
瑞士梅特勒-托利多公司;1290 UHPLC 型超高效液 以及是否有污染和 Nanodrop 检测 RNA 的纯度(以
相色谱仪,美国 Agilent 公司;Triple TOF 6600 型(配 [10]
OD
260 / OD 表示) 。
280
有 Analyst TF 1郾 7 软件)高分辨质谱仪,美国 AB Sciex 1郾 3郾 4郾 2摇 鲁氏酵母菌转录组文库的构建
公司。 将提取的 RNA 用带有 Oligo(dT)的磁珠,通过
1郾 3摇 实验方法 A-T 互补配对与 mRNA 的 ployA 尾结合的方式,富
1郾 3郾 1摇 鲁氏酵母菌的培养 集真 核 生 物 mRNA。 加 入 fragmentation buffer, 将
在 250 mL 三角瓶中装入 100 mL YPD 液体培养 mRNA 打断成短片段,以 mRNA 为模板,用六碱基
基,接入 5 mL 的已活化好的菌液,在全温振荡器中 28 随机引物( random hexamers) 合成一链 cDNA;加入
益、180 r/ min 条件下培养27 h。 将培养后的菌液分别 缓冲液 dNTPs 和 DNA polymerase I。 合成二链 cD鄄
取出 5 mL,放在 100 mL YPD(含 5 g YPD, 18 g NaCl) NA,随后利用 AMPure XP beads 纯化双链 cDNA。
液体培养基中,命名为 YPD 对照组;放在 100 mL 纯化的双链 cDNA 再进行末端修复,加 A 尾并连接
YPD + Fru(含 5 g YPD, 18 g NaCl, 12 g D鄄果糖)液体 测序接头,用 AMPure XP beads 进行片段大小选择,
培养基中,命名为 YPD + Fru 实验组 [8] 。 每个处理组 最后进行 PCR 富集得到最终的 cDNA 文库。 测序
进行 3 次生理重复实验,分别培养 0、3、5、7 d。 的平台为上海中科新生命生物科技有限公司,并由
1郾 3郾 2摇 D鄄果糖对鲁氏酵母菌生理特性影响指标的 该公司提供技术服务。
测定 1郾 3郾 4郾 3摇 转录组数据分析
取 10 mL 菌液于 4 800 r/ min 离心 15 min,弃去 将过滤后得到的 Clean reads 通过 HISAT 软件
上清液,再加蒸馏水至 10 mL,再次离心 15 min。 重 进行基因组定位分析,使用 HTSeq 软件对样品进行
复操作 3 次。 将离心后的菌体用 YPD 培养基定容 基因表达水平分析,模型为 union [11] 。 结果文件分
至 10 mL,摇匀后,用 1 cm 比色皿测定在 600 nm 下 别统计了不同表达水平下基因的数量以及单个基因