冷冻保藏是目前长期存贮食物、生物制品等最常用的手段。然而,冻结、冻藏过程中的冰晶形成和重结晶通常会导致细胞不可逆损伤甚至死亡,也会不断损伤食物组织结构从而使产品品质降低[1]。为确保冻藏细胞活性或食物品质,应最大限度减少冷冻环节对细胞或食物组织的损害,而添加抗冻保护剂已成为目前最广泛使用和有效的方法[2-4]。

抗冻肽是一类具有低温保护活性的多肽分子,作为新型抗冻剂近年来受到了越来越多的关注[2-4]。与传统抗冻剂相比,抗冻肽具有营养、健康、安全的特点,同时抗冻肽分子质量小、理化性质稳定,更容易渗透入细胞和组织发挥抗冻作用[4-5]。目前,研究者主要通过对食用明胶、丝胶蛋白、动物皮、鱼内脏、鱼鳞等动物源原料及其他鱼虾类加工副产物进行酶解,再经离心分离,制备各种抗冻肽。这些抗冻肽已在抑制冰晶生长、微生物细胞低温保护等方面显示出良好效果[4-11]。Cao等[8]以猪皮胶原蛋白为原料,从其水解液中筛选到具有高热滞活性、冰晶重结晶抑制能力的抗冻肽;Dang等[10]利用木瓜蛋白酶水解草鱼鳞片,筛选的抗冻肽可将冻藏1周的酵母菌存活率提高至84%以上;Xu等[12]也从大黄花鱼的胰蛋白水解液中获得了1条抗冻肽,其能有效抑制冻融循环后肌原纤维蛋白的变性和结构变化。然而,这些抗冻肽大多来源于组成复杂的动物源蛋白质原料,难以追溯和理解其水解产生过程,而目前还鲜有利用简单蛋白质水解制备抗冻肽的相关研究。

课题组前期研究发现,鲢鱼酶解产物对酵母菌细胞、冷冻鱼糜、冷冻面团等均具有优良的抗冻效果[13-15],而其关键的抗冻组分主要为来源于鲢鱼小清蛋白(PV)的抗冻肽[16-17]。PV是鱼白肉中一种酸性的钙结合肌浆蛋白,含有108～109个氨基酸,功能尚不明确,但可能在调节细胞内钙离子交换中起重要作用[18]。研究显示,南极鱼肌肉中PV的表达量和钙离子亲和力均显著高于温带鱼,说明PV可能与南极鱼在极端低温条件下的冷适应性有关[19-20]。因此,鲢鱼PV可能是潜在抗冻蛋白,但目前鲜有关于其抗冻活性以及利用其制备抗冻肽的研究报道。本研究拟利用纯化的鲢鱼小清蛋白制备、分离抗冻肽,并对抗冻肽的活性、组成进行表征,为制备高活性抗冻肽及研究其构效关系提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

新鲜鲢鱼,长沙天心区高云菜市场,每尾重(1.5±0.2)kg;酵母菌,分离自安琪活性干酵母培养物。

中性蛋白酶(酶活力≥500 000 U/g)、木瓜蛋白酶(酶活力≥800 000 U/g)、胰蛋白酶(酶活力≥250 000 U/g),上海笛柏化学品技术有限公司;复合蛋白酶(酶活力≥1.5 AU/g),诺维信(中国)生物技术有限公司;碱性蛋白酶(酶活力≥200 000 U/g),美谷生物科技(浙江)有限公司;麦芽汁培养基(液体)、马铃薯葡萄糖琼脂培养基(固体),广东环凯微生物科技有限公司;牛血清蛋白(BSA),广州BioFroxx生物科技有限公司;其他试剂均购自国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

Leica DM LP型低温显微镜,德国Leica公司;BONA-GM-011型有机膜分离实验机(配备卷式超滤膜),山东博纳生物科技集团有限公司;DSC Q2000型差示扫描量热仪,美国TA公司;UPLC-MS/MS,美国Thermo Scientific公司。

1.3 实验方法

1.3.1 鲢鱼小清蛋白的提取和纯化

参考邱惠[21]的方法稍加修改。新鲜鲢鱼宰杀后去头、鳞和内脏,剔除鱼皮、鱼骨,用绞肉机绞碎。加入5倍体积的去离子水,匀浆后于室温搅拌提取60 min,3 500 r/min离心20 min,收集上清液, 95 ℃水浴30 min,冷却后5 000 r/min离心20 min,取上清液冻干,得到PV,并保藏于-60 ℃冰箱备用。

1.3.2 鲢鱼小清蛋白肽的制备

1.3.2.1 鲢鱼小清蛋白的酶解工艺优化

PV冻干粉重新溶解配制成30 g/L的溶液,分别加入2 000 U/g(以PV粉干质量计)中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、碱性蛋白酶或20 mg/g 的复合蛋白酶,在各自最适温度及最适pH值条件下酶解60 min。然后置于95 ℃水浴中灭活15 min,冷却至室温,5 000 r/min离心15 min,收集上清液,即得小清蛋白肽(Pv-Ps)。通过测定Pv-Ps对酵母菌的抗冻保护活性,筛选最佳蛋白酶。在此基础上,根据底物浓度、加酶量、酶解时间的单因素实验结果,设计三因素三水平的正交试验,以酶解液对酵母菌的抗冻保护效果为指标,优化制备Pv-Ps的工艺条件。

1.3.2.2 鲢鱼小清蛋白水解度的测定

PV酶解过程中,通过滴加1.0 mol/L NaOH保持体系pH值稳定(±0.05波动),采用pH-Stat法测定酶解产物的水解度[22]。

1.3.2.3 鲢鱼小清蛋白肽对酵母菌的抗冻保护活性测定

参考熊思佳等[13]的方法。制备酵母菌培养液,取100 μL酵母菌液加入预装有900 μL无菌水(空白组)或抗冻肽溶液的EP管中,振荡混匀制成菌悬液,置于-20 ℃进行1～3次冻融循环(-20 ℃冷冻20 h,4 ℃解冻4 h为1个冻融循环)处理,以稀释平板计数法测定其活菌数(CFU)。冻融后与冻融前酵母菌悬液中活菌数的比值即为存活率,存活率越大表示对酵母菌的抗冻保护活性越好。

1.3.3 小清蛋白源抗冻肽的分离筛选

经优化工艺条件制备的PV酶解液,采用截留分子质量分别为1、3 kDa的卷式超滤膜,按分子质量小于1 kDa、1～3 kDa、大于3 kDa进行超滤分级,分别收集3个超滤分级组分(F1、F2、F3),冻干后采用凝胶电泳分析分离效果。以无菌水为空白对照,分析不同组分(PV、Pv-Ps、F1、F2、F3)对酵母存活率的影响,分别记为CK、PV、Pv-Ps、F1、F2、F3组。将抗冻保护效果最佳的小清蛋白源抗冻肽组分记为Pv-AFPs。

1.3.4 小清蛋白源抗冻肽高活性组分的性质表征

1.3.4.1 热滞活性测定

参考Cui等[17]的方法采用差示扫描量热法(DSC)测定热滞活性(THA)。以空坩埚为对照,称取约5 μL 10 mg/mL样品迅速放入DSC样品盘中,密封,以5 ℃/min下降至-15 ℃并保持3 min,再以 1 ℃/min 升至样品处于固-液状态时的温度并保持5 min,此温度记为Th,然后再以1 ℃/min降至 -15 ℃, 记录开始结晶时的温度为T0,以Th-T0表示为THA。

1.3.4.2 冰晶重结晶抑制活性测定

参考Li等[23]的方法测定冰晶重结晶抑制活性。将PV及抗冻肽冻干粉末溶于PBS缓冲液(30 mmol/L NaH2PO4/Na2HPO4、300 mmol/L NaCl、pH=8.0),配制成3 mg/mL PV及抗冻肽溶液,滴加2 μL溶液于载玻片上;将载玻片置于冷冻台上,以90 ℃/min迅速降温至-40 ℃,保持 1 min; 再以90 ℃/min 迅速升温至-7 ℃,保持 40 min, 拍照记录,比较冰晶的大小。

1.3.5 鲢鱼小清蛋白源抗冻肽高活性组分的组成表征

质谱分析参考Cui等[17]的方法,使用UPLC-MS/MS进行测定,样品通过纳升流速的液相系统进行分离。Pv-AFPs经过上样缓冲液溶解,通过自动进样器系统后与C18捕获柱(3 μm,12 nm,100 μm×20 mm)相互结合,然后被洗脱到分析柱(2 μm,12 nm,75 μm×150 mm)开始分离。根据建立的2个流动相(A和B)来确定分析的梯度,其中流动相A(按体积比计)含有3%二甲基亚砜、0.1%甲酸、96.9%超纯水;流动相B含有3%二甲基亚砜、0.1%甲酸、96.9%乙腈。在一级质谱信号定量(DDA)模式分析中,每个扫描周期包括一次全扫描(R=70 K,AGC=3×106,最大IT=20 ms,扫描范围m/z=350～1 800)和随后的15次MS/MS扫描(R=17.5 K,AGC=2×105,最大IT=100 ms)。高能碰撞裂解(HCD)碰撞能量设置为28 eV,四极杆的筛选窗口设置为1.6 Da,重复离子收集的动态拒绝时间设置为35 s。

由Q Exactive Plus运算出来的UPLC-MS/MS数据,经MaxQuant(V1.6.2.10)检索分析,检索采用数据库内置的MaxLFQ算法,并以数据库中Silver_carp的蛋白质组作为参考数据。所有鉴定的肽段序列提交至AFPropred服务器(https:∥webs.iiitd.edu.in/raghava/afpropred/),根据序列及进化特征预测其是否属于抗冻肽。

1.4 数据处理

每组实验至少重复进行3次,结果以平均值±标准偏差表示。采用Origin 2019软件绘制图表,样本均值使用IBM SPSS Statistics 26.0软件进行方差分析,先进行Welch’s ANOVA检验(α=0.05),方差齐者用LSD (least significant difference) 法进行多重比较,方差不齐者用Dunnet-T3事后检验进行分析,不同字母表示样本差异显著(P<0.05)。

2 结果与分析

2.1 鲢鱼小清蛋白的提取和纯化结果分析

PV是鲢鱼肌肉中一种水溶性蛋白,具有很高的热稳定性[18,21],因此可以通过水提后加热除去热不稳定蛋白。图1为PV粗提液加热前后电泳结果,可以发现加热前提取液中蛋白条带较多,而加热后只有一条分子质量为12 kDa左右的显著条带,即为鲢鱼PV[24];这也说明通过煮沸的方法去除了多数杂蛋白,提取液中PV的纯度较高,与Liu等[18]纯化鲢鱼PV的结果相似,但相比邱惠[21]通过热处理纯化金鲳鱼PV的效果更好,可能与原料鱼的种类不同有关。

M为Marker,1为加热前的提取液,2为加热后的提取液。

图1 鲢鱼小清蛋白提取液的电泳结果
Fig.1 SDS-PAGE results of extraction of silver carp parvalbumins

2.2 鲢鱼小清蛋白源抗冻肽的制备工艺优化分析

抗冻蛋白的抗冻活性往往并非整体起作用,而是取决于其特异多肽链结构域,因此,通过水解可以制备抗冻肽[4-5]。将鲢鱼PV以不同蛋白酶催化水解,其产物对酵母菌的抗冻保护效果如图2。由图2可知,空白(CK)组酵母菌冻融后的存活率为7%,说明本研究中的酵母菌耐冻性较差;加入未酶解的PV后,冻融酵母菌的存活率提高至68%,约是CK组的10倍,表明鲢鱼PV具有较好的抗冻活性,这与课题组研究发现鲢鱼酶解产物中的抗冻组分主要来自PV相符[16]。不同酶水解后鲢鱼PV抗冻活性有所变化,其中木瓜蛋白酶组的冻融酵母菌存活率为54%,较未酶解组下降了14%;而胰蛋白酶组的冻融酵母存活率提高至79%,较酶解前提高了11%,表明通过胰蛋白酶水解鲢鱼PV有望获得高活性的抗冻肽。

不同小写字母表示组间数据差异显著(P<0.05)。

图2 鲢鱼小清蛋白不同蛋白酶水解产物对酵母菌的抗冻保护活性
Fig.2 Cryoprotective effects of silver carp parvalbumin hydrolysates prepared with diverse proteases on yeast

在单因素实验的基础上,通过正交试验进一步优化制备高活性抗冻肽的水解条件,正交试验设计和结果如表1。由表1可知,各因素对Pv-Ps抗冻活性的影响由大到小依次为酶解时间、底物浓度、加酶量。优化条件为底物质量浓度30 g/L、胰蛋白酶用量 3 000 U/g、温度37 ℃、pH值为 7.8、酶解时间 120 min;在此条件下制备的PV酶解产物的水解度约为13%,冻干后即为Pv-Ps,经验证Pv-Ps使冻融酵母菌的存活率进一步提高了17%,为90%以上,表明通过控制酶解过程制备出了活性较好的小清蛋白抗冻肽。

表1 正交试验设计及结果

Tab.1 Design and results of orthogonal experiment

序号Aρ(底物)/(g·L-1)B酶解时间/minC加酶量/(U·g-1)存活率/%12090100063.68±6.42220120200064.10±4.00320150300060.26±6.1143090300074.14±3.92530120100074.79±3.65630150200069.87±7.3974090200072.65±6.06840120300086.97±4.85940150100058.33±5.01K1188.04210.47196.80K2218.80225.86206.62K3217.95188.46221.37R30.7637.4024.57

2.3 鲢鱼小清蛋白源抗冻肽的分离筛选结果分析

利用超滤膜分离Pv-Ps得到3个组分,即F1(Mw<1 kDa)、F2(Mw=1～3 kDa)、F3(Mw>3 kDa)。 小清蛋白源抗冻肽的分离筛选结果见图3。由图3(a)可知,Pv-Ps中含有许多小于10 kDa的条带,表明PV水解为许多小分子质量肽段;F1组分的分子质量小于1.2 kDa,与理论相符;但F2组分的主要条带也小于1.2 kDa,而在1.2～4.6 kDa几乎未有条带,可能是这一分子质量范围的肽段数量较少,也可能是超滤分离的效果未达到要求。另外,F3组分的条带基本与Pv-Ps组类似,可能与超滤系统的分离效率有关,未能将Pv-Ps中的多肽按分子质量大小完全分开。

图(b)、(c)中,不同小写字母表示同循环组间差异显著(P<0.05);不同大写字母表示同组样品不同循环间差异显著(P<0.05)。

图3 鲢鱼小清蛋白源抗冻肽超滤组分的分离筛选结果
Fig.3 Separation and screening results of ultrafiltration fractions of antifreeze peptides from silver carp PV

检测3个组分对冻融酵母菌存活率的影响,结果如图3(b)。冻融1次后,未添加抗冻保护剂(CK)组酵母存活率仅为8%,而添加未酶解PV组的酵母菌存活率为56%,印证了PV是一种潜在的抗冻蛋白;相比而言,Pv-Ps组的酵母菌存活率为70%,其3个组分F1、F2、F3组的酵母菌存活率分别为74%、78%、72%,与Pv-Ps组相当。然而,当酵母菌冻融3次后,CK组的存活率仅为1%,PV组也降至23%,而Pv-Ps、F1、F2、F3组的存活率分别为52%、51%、40%和36%,均高于PV组,表明小清蛋白源抗冻肽对酵母菌的抗冻保护效果优于PV本身,同时F1在3个组分中的抗冻活性更好。然而,与分离前的Pv-Ps相比,超滤得到的3个组分对酵母菌的抗冻保护活性均未见增加,其中F2、F3的活性反而显著下降(P<0.05),这可能是由于某些特定分子质量的肽段具有协同保护作用[25],这与课题组前期研究鲢鱼酶解产物中不同抗冻组分的抗冻保护活性结果一致[17]。进一步分析3个组分对酵母菌冻融后生长能力的影响,结果如图3(c)。冻融1次后, PV、Pv-Ps、F1、F2、F3组酵母菌培养后的OD600均显著高于CK组;尤其是冻融3次后,CK组的OD600由冻融前的20.6降至0.9左右,这也与其1%的存活率一致,而F1组的OD600仍为11.8,与Pv-Ps组(11.7)相近,显著高于PV组(6.3)、F2(10.9)组、F3(8.8)组,这也与图3(b)中存活率的结果一致。因此,尽管F1组分对酵母菌的抗冻保护效果与Pv-Ps相比并未有实质性提高,但其组分相对简单,利于后续的表征和高效抗冻肽的筛选,因而选择F1组分进行后续的实验,并将其命名为Pv-AFPs。

2.4 鲢鱼小清蛋白源抗冻肽高活性组分的性质表征

抗冻肽的重要特征是具有热滞活性和冰晶重结晶抑制能力,从而发挥低温保活性[4-5]。Pv-AFPs的抗冻特性分析见图4。由图4(a)可知,与BSA相比,Pv-AFPs在热谱中表现出明显的延迟放热峰,其热滞活性为1.20 ℃。具有热滞活性的物质能够有效抑制冰晶的生长,热滞活性越大,效果越明显。Cao等[8]指出,当抗冻肽在低含量下的热滞活性为0.6～6.0 ℃时可被认为是高活性抗冻肽。因此,Pv-AFPs属于高活性抗冻肽。Dang等[10]利用凝胶过滤色谱从优化酶解条件制备的鱼鳞抗冻肽中分离出2个组分,其中活性较好的F2组分热滞活性最高可达2.7 ℃(质量浓度为20 mg/mL)。课题组前期也从鲢鱼酶解产物中筛选到1条新的小清蛋白源抗冻肽,化学合成该肽测得其热滞活性为0.87 ℃(质量浓度为10 mg/mL)[17],与本研究结果基本吻合。

图4 Pv-AFPs的抗冻性质分析
Fig.4 Cryoprotective properties of Pv-AFPs

抗冻肽可以吸附在冰晶表面通过Kelvin效应抑制冰晶生长,阻止冰晶聚集,控制冰晶的大小和形状,使形成的冰晶细小均匀,降低冰晶对细胞或食物组织造成的机械损伤[4,26]。图4(b)为Pv-AFPs抑制冰晶重结晶的实验结果。可见,随着在-6 ℃下保持时间的增加,2组溶液中的冰晶数量均有所减少,冰晶尺寸明显增大,表明发生了冰晶重结晶现象。-6 ℃保持10、40 min时,含有Pv-AFPs的溶液中冰晶形态均较为圆润,大小相对均匀,且尺寸明显小于CK组;其中,CK组10 min时的冰晶平均面积约为997 μm2,是Pv-AFPs组冰晶平均面积(约为222 μm2) 的4倍多;继续低温保持40 min,CK组冰晶平均面积增加至1 622 μm2,而Pv-AFPs组冰晶平均面积只有766 μm2,仍然小于CK组10 min时的冰晶尺寸。这些结果表明,Pv-AFPs具有良好的冰晶重结晶抑制能力,可能是由于其与冰晶之间存在特异的吸附-抑制作用[5, 26],从而抑制了冰晶的长大。

2.5 鲢鱼小清蛋白源抗冻肽高活性组分的组成表征

对Pv-AFPs进行UPLC-MS/MS分析,总共鉴定出417条PV源多肽,分别来源于鲢鱼PV的3种异构体蛋白(B6UV98_HYPMO、B6UV97_HYPMO、R9R015_HYPMO)。Pv-AFPs肽段的分子质量分布如图5。其中分子质量在1～2 kDa的肽段有231条,占总数的55%;分子质量在0.5～1 kDa的肽为129条,占总数的31%;分子质量在2～3 kDa 和大于3 kDa的肽段分别为48条和5条,共约占总数的13%;仅鉴定出4条五肽(分子质量小于0.5 kDa),且丰度约为全部肽的0.01%,表明其可能对Pv-AFPs抗冻活性的贡献较小。Chen等[4]认为良好的抗冻肽一般分子质量小于3 kDa;Wang等[27]的研究也表明,分子质量在0.6～2.7 kDa的抗冻肽更容易吸附至冰晶表面,从而抑制冰晶生长。Pv-AFPs中分子质量0.5～2 kDa的肽占比86%,与陈旭等[5]和Wang等[27]的结论基本吻合。然而, Pv-AFPs的中肽的分子质量理论上应小于1 kDa,但实际上仅有32%的肽小于1 kDa,这也说明超滤未能将抗冻肽按分子质量有效分离,可能是因为超滤液的量较大,也可能与超滤系统的分离效率有关。

图5 Pv-AFPs中肽的分子质量分布
Fig.5 Molecular weight distribution of peptides in Pv-AFPs

表2列出了Pv-AFPs中质谱鉴定出的丰度相对较高的8条肽,其丰度占全部肽的43.78%以上,序列长度分别在6～20个氨基酸。其中,最小的肽为1条6肽(IGVDEF),分子质量为678.32 Da;肽AGDSDGDGKIGVDEFAALVK的质谱信号在所有鉴定的肽中最强,为丰度最高的肽,含有20个氨基酸,分子质量为2 033.99 Da。在这8条肽中,除肽IGVDEFAALVK外,其余肽均为预测的抗冻肽,与Pv-AFPs良好的抗冻活性相符,但其实际的低温保护活性还需通过化学合成后进一步实验进行验证。

表2 Pv-AFPs中相对丰度最高的8条肽

Tab.2 Eight peptides with highest relative abundance in Pv-AFPs

序列RT/min-10lgPMw/Dam/z(z)面积/1010抗冻肽鉴定AGDSDGDGKIGVDEFAALVK23.88111.052033.991018.00(2)7.39是ALTDAETKIFLK19.9987.341348.76675.39(2)3.70是SGFIEEDELK19.3082.531165.55583.78(2)3.50是IGVDEF23.0046.47678.32679.33(1)2.57是AFAIIDQDK29.3882.481019.531020.54(1)1.87是IGVDEFAALVK25.4585.391160.641161.65(1)1.58否LSAKSPDDIKK11.7649.521200.67401.23(3)1.47是VGLSAKSPDDIKK12.2585.221356.76679.39(2)1.01是

-10lgP,该肽段对应图谱鉴定的可信度;RT,保留时间;Mw,分子质量;m/z,质荷比;Area,肽段的峰面积。

3 结 论

本研究利用纯化的鲢鱼PV酶解制备高活性的抗冻肽,优化酶解条件为30 g/L PV溶液中加入3 000 U/g胰蛋白酶,温度37 ℃、pH值为 7.8条件下酶解120 min,此条件下制备的抗冻肽可使冻融酵母菌的存活率提高至90%以上。Pv-Ps超滤后分子质量1 kDa以下的组分对酵母菌的抗冻保护效果较佳,热滞活性为1.20 ℃,具有明显的冰晶重结晶抑制能力。经UPLC-MS/MS分析鉴定出417条小清蛋白源多肽,86%以上分子质量在0.5～2.0 kDa;其中丰度相对最高的8条肽中有7条为理论的抗冻肽,与其良好的抗冻活性相符。研究旨在为高活性抗冻肽的制备、筛选及其在食品或生物领域中的应用提供新思路。

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Preparation, Isolation and Characterization of Antifreeze Peptides Derived from Silver Carp Parvalbumin

LI Yi, DAI Xinjia, FU Yuting, YUAN Chengzhi, YU Jian, WANG Faxiang*

(School of Food Science and Bioengineering, Changsha University of Science and Technology/Hunan Provincial Engineering Technology Research Center of Aquatic Food Resources Processing, Changsha 410114, China)

Abstract：Antifreeze peptides (AFPs) represent an emerging class of antifreeze agents, offering significant advantages over traditional cryoprotectants and natural antifreeze proteins. To develop a high-activity AFPs derived from silver carp parvalbumin (PV),and explore their potential application in the preservation of frozen foods, PV was purified from fish muscle, and high-activity AFP fractions were obtained through controlled enzymatic hydrolysis and ultrafiltration, with the cryoprotective efficacy of the resulting products on yeast serving as the screening index. The generated optimal fraction was further characterized by UPLC-MS/MS analysis. The results showed that PV from silver carp muscle could be purified effectively by heat treatment. The hydrolysate exhibited optimal antifreeze activity under the conditions of a mass concentration of 30 g/L PV, 3 000 U/g trypsin, and a hydrolysis time of 120 min. Under this condition, the prepared AFPs increased the survival rate of freeze-thawed yeast cells to over 90%. Ultrafiltration separation yielded a high-activity fraction F1 (molecular weight of less than 1 kDa), which had a thermal hysteresis activity of 1.20 ℃ and significant ice recrystallization inhibition activity. Yeast treated with the F1 fraction exhibited a survival rate of 51% after three freeze-thaw cycles, and concurrently the OD600 showed a moderate decline from 20.6 (fresh) to 11.8. In contrast, the untreated control yeast demonstrated significantly lower survival rate (1%) and OD600 (0.9). UPLC-MS/MS analysis identified 417 PV-derived peptides in F1, with 86% of them exhibiting molecular weights ranging from 0.5 to 2.0 kDa. Seven of the eight most abundant peptides were predicted to be AFPs, aligning with the good antifreeze activity of F1. The research aimed to innovate a method for preparing highly active antifreeze peptides using pure silver carp PV, laying a foundation for further research on the structure-activity relationship of its highly active AFPs.

Keywords：freshwater fish; Hypophthalmichthys molitrix; parvalbumin; antifreeze peptide; yeast; mass spectrometry

doi：10.12301/spxb202400795

文章编号：2095-6002(2025)05-0056-09

引用格式：李奕, 戴新佳, 符禹婷, 等. 鲢鱼小清蛋白源抗冻肽的制备、分离和表征[J]. 食品科学技术学报,2025,43(5):56-64.

LI Yi, DAI Xinjia, FU Yuting, et al. Preparation, isolation and characterization of antifreeze peptides derived from silver carp parvalbumin[J]. Journal of Food Science and Technology, 2025,43(5):56-64.

中图分类号：TS201.2; Q513

文献标志码：A

收稿日期：2024-12-17

基金项目：国家自然科学基金面上项目(32372371、32072251); 湖南省重点研发计划项目(2022NK2038)。

Foundation：General Program of National Natural Science Foundation of China (32372371, 32072251); Key Research and Development Program of Hunan Province (2022NK2038).

第一作者：李 奕,女,硕士研究生,研究方向为农产品加工及贮藏。

共同第一作者：戴新佳,男,本科生,研究方向为农产品加工及贮藏。

*通信作者：王发祥,男,教授,博士,主要从事农产品加工及贮藏技术方面的研究。

(责任编辑：张逸群)