糖尿病是一种常见的内分泌代谢性疾病,其发病机制复杂,可分为外源性因素和内源性因素,目前还无法完全进行阐述。近年来随着社会的发展,糖尿病的发病率逐年上升,其并发症还会导致机体死亡。糖尿病分为1型糖尿病、2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus,T2DM)、特殊类型糖尿病和妊娠期糖尿病。其中T2DM人数占了总患病人数的90%以上[1]。目前,T2DM的病因和发病机理尚不完全清楚,其核心的病理机制是胰岛功能紊乱和胰岛素抵抗[2]。胰岛素抵抗是一种周围组织对于胰岛素敏感性降低,导致患者胰岛素分泌相对不足,长此以往,胰岛功能也会受到破坏,最终导致胰岛素对血糖调控能力缺失,出现高血糖的症状。T2DM的患病原因复杂,目前研究专注于改善胰岛素抵抗的方法。T2DM的现代医学治疗方法主要通过生活方式干预、服用降糖药物、胰岛素注射等方式控制患者的血糖、血脂[3],但是长期药物治疗会使得机体产生耐药性和依赖性,且具有一定的副作用。二甲双胍为治疗T2DM的一线药物,可通过减少肝脏脂肪累积,进一步改善胰岛素抵抗[4-5],但是也存在胃肠道的不良反应。

山药为薯蓣科植物。据《本草纲目》记载,山药益肾气、健脾胃、止泄痢、化痰涎。山药作为一种常见的药食同源食物,其活性成分山药多糖一直是研究的热点。在多种导致机体胰岛素抵抗的因素中,肠道菌群受到了较大的关注。目前,肠道菌群被认为与胰岛素抵抗的发生密切相关,其代谢产物短链脂肪酸(short chain fatty acids,SCFAs)对人体的生理调节有着不可替代的作用。SCFAs与胰岛素抵抗的关系是目前科研的热点[6-7]。关于山药多糖改善糖尿病症状的研究报道较多,但其影响T2DM胰岛素抵抗的机制尚不清晰。本研究观察山药多糖对T2DM小鼠血糖、血脂、胰岛素抵抗、肠菌代谢产物的影响,探讨山药多糖对T2DM小鼠糖脂紊乱、胰岛素抵抗的影响及其可能的机制,以期为山药多糖的功能食品开发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

山药多糖,泰安中荟植物生化有限公司(质量分数60%),采用醇沉法结合胰蛋白酶去蛋白、脱色,提纯出质量分数达到80%的山药多糖。4～5周龄SPF级雄性C57BL/6小鼠60只[体质量14～20 g,许可证号SCXK(川)2020-030],成都达硕实验动物有限公司;高脂饲料(research diets D12492),成都派尚飞克生物科技有限公司;链脲佐菌素(streptozocin,STZ),云南雅云科技有限公司;INS ELISA 试剂盒,云南雅云科技有限公司;盐酸二甲双胍片,石药集团欧意药业有限公司。

1.2 仪器与设备

三诺血糖仪及试纸、AR124CN型电子天平,奥豪斯;HHW21420型电热恒温水浴箱,天津市泰斯仪器有限公司;SpectraMax340PC型酶标仪,美国分子仪器公司。

1.3 实验方法

1.3.1 山药多糖纯化及测定

取山药多糖,采用胰蛋白酶去除多余蛋白,双蒸水过夜透析,加入4倍的体积分数为95%的乙醇进行提纯。将多糖沉淀用蒸馏水复溶后,装入截留分子质量为3 000 Da的超滤管中,在上层多糖溶液中反复加入蒸馏水进行超滤。将超滤管上层溶液进行冷冻干燥后制得纯化后的山药多糖。紫外可见分光光度法测定山药多糖的含量,确定山药多糖的最大吸收波长,在确定的最大吸收波长处测定物质的吸光度,通过标准曲线法得到该吸光度下所对应的物质含量,计算得出山药多糖的质量分数。

1.3.2 实验动物饲养及T2DM模型建立

小鼠饲养在云南中医药大学SPF级动物房,平均温度22～24 ℃,光照时间12 h,自由摄食摄水(伦理编号：R-062022024)。小鼠适应性饲养3 d,分为空白组、模型组,模型组给予高脂饲料6周,空白组给予对照饲料6周。第7周称重,小鼠禁食不禁水12 h,取高脂饲料组小鼠按照体质量空腹注射100 mg/kg STZ。1周后小鼠禁食不禁水12 h,断尾取血,测定小鼠空腹血糖浓度(fasting blood glucose,FBG),FBG值大于11.1 mmol/L视为T2DM模型建立成功。

1.3.3 实验动物分组及处理

将T2DM小鼠随机分为模型组、山药多糖(低、中、高剂量)组、二甲双胍组,山药多糖低、中、高剂量组小鼠分别按体质量灌胃100、200、400 mg/kg的山药多糖,二甲双胍组小鼠按体质量灌胃250 mg/kg二甲双胍。空白组和模型组给予等体积的蒸馏水灌胃,灌胃处理6周,观察各组小鼠的饮食饮水及垫料潮湿情况。

1.3.4 小鼠血糖稳态测试

小鼠灌胃6周后,将各组小鼠禁食不禁水12 h,迅速断尾采血,测空腹血糖,记作0 min血糖。按体质量腹腔注射胰岛素(0.05 IU/g体质量),在注射后30、60、90、120 min时,分别检测小鼠血糖值,记录并绘制血糖折线图,计算血糖曲线面积(AUC)。

1.3.5 小鼠样本采集及检测

小鼠灌胃6周后,进行宰杀、取材。取材前测量FBG,摘除小鼠眼球取血,分别收集于EP管,冰上放置2 h,3 000 r/min离心15 min,将上层血清用移液枪收集至新的EP管,-20 ℃冰箱保存,小鼠血清生理生化指标根据试剂盒操作手册进行检测。打开小鼠腹腔,分离肝脏,用镊子小心将肝脏收集于放有甲醛的EP管中备用,进行油红O染色。收集粪便后迅速于液氮中保存,进行短链脂肪酸的检测。

1.4 数据处理

实验结果表示为平均值±标准偏差,采用SPSS 26.0统计软件进行单因素方差分析,P<0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 山药多糖对T2DM小鼠FBG的影响

各组小鼠FBG结果见表1。由表1可知,模型组和空白组小鼠的FBG差异显著(P<0.001)。在山药多糖和二甲双胍干预后,小鼠的FBG都出现了明显下降,与模型组相比,FBG差别具有显著性 (P≤0.001)。实验结果表明,山药多糖可有效降低T2DM小鼠的FBG。

表1 山药多糖对小鼠FBG的影响
Tab.1 Effect of yam polysaccharide on FBG in mice mmol/L

组别FBG空白组4.7±0.3###模型组18.7±1.0∗∗∗高剂量组14.7±0.7###中剂量组15.5±1.2###低剂量组15.2±1.2###二甲双胍组14.5±1.3###

***表示模型组和空白组对比,数据差异具有显著性(P<0.001),### 表示与模型组对比,组间结果差异具有显著性(P<0.001)。

2.2 山药多糖对T2DM小鼠肝脏脂肪堆积的影响

对小鼠的肝组织进行了油红O染色处理,镜下观察结果见图1。由图1可知,空白组小鼠的肝脏几乎无脂滴,模型组小鼠肝脏的脂滴面积最大。在山药多糖或二甲双胍干预后,低、中、高剂量组和二甲双胍组小鼠肝脏的脂滴面积减少。实验结果表明,山药多糖可以改善T2DM小鼠肝脏脂质沉积。

图1 小鼠肝脏油红O染色结果
Fig.1 Result of mouse liver oil red O staining

2.3 山药多糖对T2DM小鼠胰岛素耐量的影响

胰岛素抵抗测试中的小鼠血糖变化结果见图2。由图2可知,与空白组相比,模型组、山药多糖组、二甲双胍组小鼠在注射胰岛素后各时间点血糖均出现显著降低,各组小鼠AUC值也出现显著下降(P<0.001)。实验结果表明,山药多糖可降低T2DM小鼠胰岛素耐量。

NC,空白组;DC,模型组;HC,高剂量组;MC,中剂量组;LC,低剂量组;DME,二甲双胍组;***表示模型组和空白组对比,数据差异具有显著性(P<0.001),###表示与模型组对比,数据差异具有显著性(P<0.001)。
图2 ITT中小鼠血糖水平变化
Fig.2 Change of blood glucose level in mice during ITT

2.4 山药多糖对T2DM小鼠胰岛素抵抗的影响

除血糖外,实验小鼠的空腹胰岛素(fasting insulin,FINS)水平也是本研究关注的重点。山药多糖对T2DM小鼠FINS的影响见图3。由图3可知,高、中剂量山药多糖均可显著降低小鼠血清FINS含量(P<0.01)。结合小鼠的空腹血糖,相比模型组,山药多糖及二甲双胍干预均能显著降低小鼠胰岛素抵抗指数(homeostasis model assessment for insulin resistence,HOMA-IR)值(P<0.001)。

NC,空白组;DC,模型组;HC,高剂量组;MC,中剂量组;LC,低剂量组;DME,二甲双胍组。**、***分别表示模型组与空白组相比,数据差异具有显著性(P<0.01)、极显著性(P<0.001)。#、##、###分别表示给药组与模型组相比,数据差异具有显著性(P<0.05)、极显著性(P<0.01,P<0.001)。
图3 山药多糖对小鼠胰岛素抵抗的影响
Fig.3 Effect of yam polysaccharides on insulin resistance in mice

2.5 山药多糖对T2DM小鼠肠道菌群多样性的影响

2.5.1 Alpha多样性分析

T2DM小鼠肠道菌群的 Alpha 多样性相关指标结果见图4。由图4可知,较空白组,T2DM小鼠的肠道菌群总量及多样性均显著降低。经山药多糖处理后,菌群物种总量及多样性均有显著回升,T2DM小鼠及山药多糖组小鼠肠道菌变化具有显著性差异(P<0.05)。

NC,空白组;DC,模型组;HC,高剂量组;MC,中剂量组;LC,低剂量组;DME,二甲双胍组。*表示模型组与空白组相比,数据差异具有显著性(P<0.05),#表示处理组与模型组相比,数据差异具有显著性(P<0.05)。
图4 小鼠肠道菌群Alpha多样性
Fig.4 Alpha diversity of gut microbiota from mice

2.5.2 Beta多样性分析

使用 Weighted Unifrac 距离对小鼠肠道菌群Beta多样性进行分析,结果见图5。由图5可知,各组间距离较大,说明菌群结构差异明显。但空白组与山药多糖低、中、高剂量组之间的距离相对较近。研究结果表明,山药多糖干预后T2DM小鼠的肠道菌群有向空白组恢复的趋势。

A,空白组;B,T2DM模型组;C,高剂量组;D,中剂量组;E,低剂量组;F,二甲双胍组。
图5 小鼠肠道菌群Beta多样性
Fig.5 Beta diversity of gut microbiota from mice

2.6 山药多糖对T2DM小鼠肠道菌门、属水平的影响

对小鼠肠道菌群的 16S rRNA 测序数据进行统计分析,结果见图6。由图6可知,从门水平结果来看,山药多糖可提高拟杆菌门(Bacteroidetes)丰度,降低厚壁菌门(Firmicutes)比例,进而降低Firmicutes与Bacteroidetes的比值。同时,较空白组,T2DM小鼠的变形菌门(Proteobacteria)丰度明显提高。但小鼠灌服山药多糖及二甲双胍后,变形菌门的增殖均得到了有效抑制。

NC,空白组;DC,模型组;HC,高剂量组;MC,中剂量组;LC,低剂量组;DME,二甲双胍组。
图6 山药多糖对小鼠肠道菌群门水平影响
Fig.6 Effect of yam polysaccharides on phylum level of gut microbiota in mice

小鼠肠道菌属水平检测结果见图7。由图7可知,山药多糖可增加大多数菌属的丰度,尤其是乳杆菌属(Lactobacillus)、阿克曼氏菌属(Akkermansia),同时,对部分菌属可产生显著下调的作用,如肠杆菌属(Enterobacter)、脱硫弧菌属(Desulfovibrio)等。

NC,空白组;DC,模型组;HC,高剂量组;MC,中剂量组;LC,低剂量组;DME,二甲双胍组。
图7 山药多糖对小鼠肠道菌群属水平影响
Fig.7 Effect of yam polysaccharides on genus level of gut microbiota in mice

2.7 山药多糖对T2DM小鼠SCFAs的影响

对小鼠肠道SCFAs 含量进行检测,结果见图8。由图8可知,对比空白组,模型组小鼠肠道的乙酸、丙酸、丁酸都显著减少(P<0.01)。山药多糖处理后,小鼠肠道内SCFAs 含量均有升高,丙酸(P<0.001)、丁酸(P<0.05)的升高趋势最为显著。

NC,空白组;DC,模型组;HC,高剂量组;MC,中剂量组;LC,低剂量组;DME,二甲双胍组。*表示与空白组相比,数据差异显著(P<0.005),***表示与空白组相比,数据差异极显著(P<0.001)。#表示与模型组相比,数据差异具有显著性(P<0.05),###表示与模型组相比,数据差异具有显著性(P<0.001)。
图8 山药多糖对小鼠粪便SCFAs含量影响
Fig.8 Effect of yam pdysaccharides on content of SCFAs in mice faecal

2.8 小鼠HOMA-IR与粪便SCFAs含量相关性分析

通过对小鼠HOMA-IR及粪便SCFAs指标进行Spearman相关分析后发现,HOMA-IR与粪便SCFAs含量具有相关性,具体数值见表2。由表2可知,小鼠HOMA-IR与乙酸、丙酸、丁酸的含量具有显著相关性(P<0.05)。研究结果表明,山药多糖缓解小鼠胰岛素抵抗与增加粪便SCFAs含量相关。

表2 小鼠HOMA-IR与粪便SCFAs的相关性
Tab.2 Correlation of HOMA-IR of mice and faecal SCFAs

变量1变量2r值P值HOMA-IR乙酸0.5010.034HOMA-IR丙酸0.7930.001HOMA-IR丁酸0.6020.008

3 讨 论

目前T2DM在我国的发病率居高不下,和癌症、心脑血管疾病成为三大威胁人类身体健康的疾病。T2DM患者发生糖尿病多种并发症之后,生命健康受到了极大的威胁。山药为常见的“药食同源”食材,具有健脾益胃补肾的作用,其有效成分山药多糖具有降血糖、降血脂、改善胰岛素抵抗的作用[8-10]。目前关于山药多糖的研究较多,但对于山药多糖改善小鼠菌群代谢和胰岛素抵抗相关性的研究较少。Canfora等[11]的研究认为,经过人体对其摄入的营养成分如蛋白质和糖类代谢产生了SCFAs,可以对缓解胰岛素抵抗的发生发展产生积极的作用。从脂肪组织来看,SCFAs,尤其是乙酸,可以抑制脂肪的分解,减少血清中游离的脂肪酸含量,从而改善脂肪代谢[12-13]。SCFAs生物活性作用均有助于脂肪组织胰岛素抵抗的改善。除了脂肪组织,SCFAs还对肝脏也有着调节作用,如丙酸可以抑制脂肪酶来降低脂肪的生成[14],而丁酸和乙酸则可以增加肝 AMPK 磷酸化和活性,增加脂肪酸氧化和糖原储存[15]。因此,SCFAs对胰岛素抵抗具有明显的改善作用。本研究发现,山药多糖使T2DM小鼠的HOMA-IR降低,改善小鼠胰岛素抵抗,同时能够增加小鼠SCFAs含量。HOMA-IR与SCFAs的相关性分析表明,二者具有明显的相关性。因此,本研究发现山药多糖减轻T2DM小鼠胰岛素抵抗与增加其SCFAs含量相关。

4 结 论

本研究发现,山药多糖能够改善T2DM小鼠糖脂代谢紊乱,降低其FBG、FINS、HOMA-IR值,减少其肝脏脂肪堆积,改善小鼠胰岛素抵抗。山药多糖改善T2DM的作用可能与增加肠道菌群物种总量及多样性、菌群群落比例改变及增加SCFAs的含量有关。本研究对小鼠肠道菌群和胰岛素抵抗的关系进行了进一步的探讨,希望能够为山药多糖调节肠道菌群和血糖代谢的功能食品的开发提供理论依据。

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Mechanism and Effect of Yam Polysaccharides on Insulin Resistance in Type 2 Diabetes Mice

GUAN Qi1,YI Hengwei 1,LÜ Bijun 1,ZHENG Zichun1,CHEN Xiaojiao1,BAO Cheng1,HAN Niping1,2,*

(1.School of Basic Medicine,Yunnan University of Chinese Medicine,Kunming 650000,China;2.Yunnan Key Laboratory of Molecular Biology of Chinese Medicine,Yunnan University of Chinese Medicine,Kunming 650000,China)

Abstract：To study the mechanism of yam polysaccharide on insulin resistance in type 2 diabetes mellitus (T2DM) mice,C57BL/6 mice was selected and randomly assigned to the following groups：normal group,model group,low dose yam polysaccharide group,medium dose yam polysaccharide group,high dose yam polysaccharide group and metformin group.T2DM mice model was induced by feeding high fat diet combined with streptozotocin (STZ).After 6 weeks of continuous administration,serum were collected and fasting blood glucose (FBG),fasting insulin (INS),insulin resistance index (HOMA-IR) and insulin tolerance test (ITT) were determined.The abundance of intestinal flora was detected by 16S rRNA gene high-throughput sequencing,and the content of feces short-chain fatty acids (SCFAs) were detected by GC-MS.It was found that the level of serum FBG,FINS and HOMA-IR in each group of yam polysaccharide decreased significantly (P<0.01 ).The total amount and diversity of intestinal bacterial species in the yam polysaccharide group increased compared with type 2 diabetes mice.Firmicutes/Bacteroidetes ratio and Proteobacteria decreased at phylum level,Lactobacillus and Akkermansia significantly increased at genus level,while Enterobacter and Desulfovibrio significantly decreased compared with the model group.Compared with the model group,the intestinal SCFAs content of yam polysaccharide group were increased,and the upward trend of propionic acid and butyric acid was significant.The results showed that yam polysaccharide could improve glucose and lipid metabolism disorder and insulin resistance in T2DM mice,which might be related to the increase of total intestinal bacterial species and diversity,the change of bacterial community proportion and the increase of SCFAs.The aim of this study was to provide theoretical basis for yam polysaccharides development and utilization.

Keywords：yam polysaccharide;type 2 diabetes;insulin resistance;gut microbiota;short-chain fatty acids

中图分类号：TS201.4;R2-031

文献标志码：A

doi：10.12301/spxb202200873

文章编号：2095-6002(2023)03-0064-08

引用格式：管琦,易恒炜,吕碧君,等.山药多糖对2型糖尿病小鼠胰岛素抵抗的影响及作用机制[J].食品科学技术学报,2023,41(3)：64-71.

GUAN Qi,YI Hengwei,LÜ Bijun,et al.Mechanism and effect of yam polysaccharides on insulin resistance in type 2 diabetes mice[J].Journal of Food Science and Technology,2023,41(3)：64-71.

收稿日期：2022-09-14

基金项目：云南省科技厅重大科技专项计划(202102AE090031);云南省科技厅科技人才与平台计划-云南省中医药学分子生物学重点实验室(2019DG016)。

Foundation：Yunnan Provincial Science and Technology Department Major Science and Technology Special Program (202102AE090031);Yunnan Provincial Key Laboratory of Molecular Biology for Sinomedicine (Yunnan University of Chinese Medicine) (2019DG016).

第一作者：管 琦,女,硕士研究生,研究方向为中医药调节免疫及微生态平衡防治感染性疾病应用基础。

*通信作者：韩妮萍,女,副教授,主要从事中医药调节免疫及微生态平衡防治感染性疾病应用基础方面的研究。

(责任编辑：郝一铭)