γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)作为哺乳动物中枢神经系统中主要的抑制性神经递质,在调节焦虑情绪、改善睡眠质量、维持神经元正常功能、抗抑郁等方面具有重要作用[1-2]。目前GABA的合成方式主要以化学合成、生物催化、微生物发酵等方式进行。相较于其他合成方法,利用微生物发酵法制备过程成本低、工艺简单、安全性高且易于规模化生产,已成为健康食品领域的研究热点。乳酸菌(lactic acid bacteria,LAB)因其公认的安全性、丰富的益生特性及广泛存在于发酵食品中而备受青睐。LAB细胞内的谷氨酸脱羧酶(glutamate decarboxylase,GAD)能高效催化L-谷氨酸脱羧生成GABA,因此利用乳酸菌发酵来富集食品中的GABA成为一种天然、安全的生物转化策略[3]。目前,国内外已有利用乳酸菌发酵开发富含GABA功能性食品的研究报道。例如,Langa等[4]通过短乳杆菌发酵豆乳,成功富集GABA到0.98 mg/mL并改善了产品的营养特性;Shen等[5]发现添加玉米浸粉和调整pH值可显著提升植物乳杆菌在虫草糙米汁中的GABA产量。

黑果花楸(Aronia melanocarpa)是一种富含花青素、多酚与黄酮类物质的“超级水果”,具有极强的抗氧化活性和显著的营养保健功能,已被列为新食品原料,在功能性食品开发中展现出广阔前景[6-8]。然而,因果实味道酸涩,难以被主流消费者直接接受,黑果花楸目前主要通过加工方式实现高值化利用,如果酒、果汁及膳食补充剂等,其中果汁是重要的加工方式之一[9]。如Liu等[10]利用植物乳杆菌发酵黑果花楸汁从而改善黑果花楸汁风味,丰富了黑果花楸的特征香气;Wang等[11]研究发现乳酸菌发酵黑果花楸汁后总酚含量和抗氧化活性显著提升。因此,以黑果花楸汁为基质进行乳酸菌发酵,不仅能改善风味,还能将水果本身的营养与微生物转化产生的GABA等活性物质相结合,极具开发高价值功能性饮品的潜力。

本研究旨在从传统发酵食品中筛选出高产GABA并适用于黑果花楸汁发酵的菌株,开发富含GABA的功能性黑果花楸发酵饮品,并优化其发酵黑果花楸汁的工艺,改善果汁固有的酸涩风味。希望研究可为高GABA含量的功能性发酵饮品开发、黑果花楸汁风味的调控提供技术指导。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

黑果花楸鲜果,宁夏福寿康宁有限公司提供;乳酸菌,由江苏省农业科学院农产品加工研究所食品生物工程团队从中国传统发酵食品(泡菜、辣椒酱、包菜等)中分离并保藏,64株。

γ-氨基丁酸、四氢呋喃、无水碳酸钠,分析纯,上海麦克林生化科技有限公司;单磺酰氯,分析纯,上海阿拉丁生化科技股份有限公司;L-谷氨酸钠,分析纯,上海蓝季科技发展有限公司;MRS肉汤,分析纯,北京奥博星生物技术有限公司;琼脂,分析纯,北京擎科生物科技有限公司;甲醇、乙腈,色谱纯,美国TEDIA公司;硫酸、盐酸、丙酮、苯酚、葡萄糖,分析纯,集团化学试剂有限公司;葡萄糖,食用级,浙江一诺生物有限公司;酵母浸粉,食用级,亿宝莱食品配料有限公司;L-谷氨酸钠,食用级,华兴食品添加剂有限公司;安佳脱脂乳粉,恒天然商贸(上海)有限公司。

1.2 仪器与设备

Five Easy Plus型pH计,梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司;HH-S系列数显恒温水浴锅,常州万达升实验仪器有限公司;E-poch型酶标仪,美国BIO-TEK公司;1260型高效液相色谱仪(配有可变波长紫外检测器),美国安捷伦公司;Allegra型离心机,美国贝克曼库尔特公司;SA402B型电子舌,日本INSENT公司。

1.3 实验方法

1.3.1 菌株的活化与培养

乳酸菌由江苏省农业科学院农产品加工研究所食品生物工程团队分离保存-80 ℃保藏的乳酸菌,按体积分数为3%接种于MRS液体培养基中,37 ℃培养24 h,传代两次后,进行平板划线,挑取长势良好的单菌落于MRS液体培养基中37 ℃培养24 h作为种子液备用。将种子液以体积分数为3%的接种量接入含L-MRS液体培养基(添加质量分数为1.5%的L-谷氨酸钠的MRS液体培养基)中,37 ℃静置培养48 h。

1.3.2 乳酸菌的初筛

基于L-MRS培养基(添加质量分数为1.5%的L-谷氨酸钠的MRS液体培养基)对产GABA乳酸菌进行初筛。

1.3.2.1 薄层层析法定性测定GABA

参考Yao等 [12]的方法稍作改动,展开剂为V(正丁醇)∶V(冰醋酸)∶V(水)=4∶1∶1,以0.6%的茚三酮乙醇溶液作为显色剂,以10 mg/mL的GABA标准品作为对照,将发酵液10 000 r/min离心5 min,去上清液点样,进行薄层层析,层析完毕干燥后喷显色剂进行显色,比较比移值(Rf值)。若样品与GABA标准品出现相同的Rf值,说明样品中有GABA产生。

1.3.2.2 高效液相法定量测定GABA

参考Matta等[13]的方法稍作修改,将发酵液以转速8 000 r/min离心10 min,取50 μL上清液,依次加入0.5 mL碳酸氢钠(20 g/L)和0.5 mL丹磺酰氯丙酮(5 g/L),涡旋混合30 s后,将混合物于60 ℃环境中避光温育30 min,然后向反应混合物中加入100 μL氨水,于60 ℃环境中避光温育5 min以除去过量的衍生试剂,最后添加甲醇将体积调至2 mL,过0.22 μm有机滤膜,取20 μL样品进行色谱分析。

高效液相色谱条件:色谱柱为TC-C18反相色谱柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);检测器为紫外检测器;流动相A为含有50 mmol/L乙酸钠的四氢呋喃-甲醇-水溶液[V(四氢呋喃)∶V(甲醇)∶V(水)=10∶150∶840],用磷酸调节pH至6.2左右;流动相B为甲醇。梯度洗脱条件为流动相B在0～25 min内,从10%升高到45%,维持2 min,然后从27 min到28 min升高到90%,维持5 min,然后在1 min内降到10%,维持7 min,整个梯度洗脱程序持续41 min。柱温:35 ℃;流速:1 mL/min;进样量:20 μL;紫外检测器波长:254 nm。

1.3.3 对产GABA乳酸菌的复筛

基于黑果花楸汁对产GABA乳酸菌进行复筛。

黑果花楸鲜果与水质量比1∶1打浆后制成原浆-20 ℃冷冻备用,黑果花楸汁的制备参考ALIMS[14]的方法稍作改动。采用Lj11、Lj14、Lj15、Lj16、Lj18、PC-2发酵黑果花楸汁,以将原浆与水质量比1∶4混匀制得黑果花楸汁,葡萄糖质量分数为1.5%、酵母浸粉质量分数为2.4%、脱脂乳粉的质量分数为2.5%、L-谷氨酸钠质量分数为2%、巴氏杀菌85 ℃、25 min;接种量的体积分数为3%,37 ℃发酵36 h。选用在黑果花楸汁中GABA产量最高的菌株进行后续实验。

1.3.4 形态学观察与分子生物学鉴定方法

形态观察:将6株产GABA乳酸菌菌株在MRS固体培养基上划线,37 ℃培养36 h,观察单菌落形态和颜色等并对单菌落进行革兰氏染色,于显微镜下观察菌株形态及特征。

分子生物学鉴定:将6株产GABA乳酸菌传代后使用细菌试剂盒进行DNA提取,并进行PCR扩增。PCR反应体系(总体积25 μL):50 mmol/L MgSO4 12.5 μL,H2O 9.5 μL,Primer F和Primer R各1 μL,DNA模板1 μL。16S rRNA基因的PCR反应条件:95 ℃预变性5 min,94 ℃变性30 s,57 ℃退火30 s,72 ℃延伸90 s,循环30次;72 ℃末端延伸10 min;4 ℃保温。通过2%琼脂糖核酸电泳对PCR产物进行分析后将PCR产物送至生工工程生物(上海)股份有限公司测序,结果在NCBI数据库中进行BLAST比对。

1.3.5 优良菌株短乳杆菌Lj16的生理特性优势分析

1.3.5.1 乳酸菌的生长曲线、产酸曲线的测定

取活化两代的种子液,以质量分数3%的接种量接入MRS液体培养基中,37 ℃静置培养。前4 h每隔2 h取样,4 h以后每隔4 h取样,于600 nm波长下测定其吸光度并用pH计测定pH值,以时间(h)为横坐标,OD600值与pH为纵坐标绘制菌株生长曲线及pH变化曲线。

1.3.5.2 乳酸菌耐酸能力的测定

参考Liu等[15]的方法对菌株的体外耐酸能力进行测定。用1 mol/L的HCl调节MRS肉汤培养基pH值至2.5、3.5、4.5。按照质量分数3%的接种量接种于不同pH值的MRS肉汤培养基中并在37 ℃、100 r/min条件下培养4 h,分别在0 h、2 h、4 h取样,稀释涂布 MRS 平板进行活菌计数,置于37 ℃生长48 h。每株菌进行3次平行实验。菌株存活率按照式(1)计算。

存活率

(1)

式(1)中,A1为在不同pH的MRS液体培养基中培养2 h/4 h的活菌数,CFU/mL;A0为在不同pH的MRS液体培养基中培养0 h的活菌数,CFU/mL。

1.3.5.3 乳酸菌的GAD酶活力的测定

参考李文杰[16]的方法,将0.1 mmol/L 的磷酸吡哆醛(PLP)溶于质量分数2%的L-谷氨酸钠溶液,调节pH值为4.6,作为底物溶液。取10 mL发酵36 h的发酵液,4 ℃条件下离心,取100 μL上清液,加入400 μL底物溶液,37 ℃恒温水浴振荡30 min,沸水水浴5 min终止反应。按照1.3.2.2节方法测定GABA生成量。GAD酶活定义:以L-谷氨酸钠为反应底物,每分钟生成1 μmol GABA所需要的酶量为一个酶活力单位,以U/mL表示。计算方法见式(2)。

GAD酶活

(30×0.1)

(2)

1.3.6 短乳杆菌Lj16发酵黑果花楸汁的工艺优化

1.3.6.1 黑果花楸汁的制备

黑果花楸鲜果与水质量比1∶1打浆后制成原浆,-20 ℃冷冻备用。将原浆与水质量比1∶4混匀,制得黑果花楸汁,用于发酵。

1.3.6.2 发酵工艺的单因素实验

将Lj16菌株接种于MRS液体培养基中,培养至菌液浓度达到1×107 CFU/mL。取10 mL菌液于4 ℃下8 000 r/min离心10 min,弃上清液,收集菌体沉淀。向沉淀中加入10 mL无菌生理盐水轻轻吹打重悬,再次离心,重复洗涤2次,以去除残留的培养基成分。用于接种黑果花楸汁。

以黑果花楸汁为发酵基质,在初始发酵条件(葡萄糖质量分数1.5%、脱脂乳粉质量分数2.5%、Lj16菌液的体积分数3%)的基础上,分别考察以下4个因素对GABA含量的影响。每组实验设置3个平行,结果取平均值。

1)酵母浸粉添加量对GABA含量的影响。固定黑果花楸汁中葡萄糖质量分数为1.5%、脱脂乳粉质量分数为2.5%、Lj16菌液的体积分数为3%、发酵时间96 h、发酵温度37 ℃、L-谷氨酸钠质量分数为2%,分别设置酵母浸粉质量分数为0、0.6%、1.2%、1.8%、2.4%,考察不同酵母浸粉添加量下发酵汁中GABA含量的变化。

2)发酵时间对GABA含量的影响。固定葡萄糖质量分数为1.5%、脱脂乳粉质量分数为2.5%、Lj16菌液的体积分数为3%、发酵温度37 ℃、L-谷氨酸钠质量分数为2%、酵母浸粉质量分数为2.4%,分别设置发酵时间48、72、96、108、120 h,考察不同发酵时间发酵液下GABA含量的变化。

3)L-谷氨酸钠添加量对GABA含量的影响。固定葡萄糖质量分数为1.5%、脱脂乳粉质量分数为2.5%、Lj16菌液的体积分数为3%、发酵时间96 h、发酵温度37 ℃、酵母浸粉质量分数为2.4%,分别设置L-谷氨酸钠质量分数为0、2%、4%、6%、8%,考察不同L-谷氨酸钠添加量下发酵液中GABA含量的变化。

4)发酵温度对GABA含量的影响。固定葡萄糖质量分数为1.5%、脱脂乳粉质量分数为2.5%、Lj16菌液的体积分数为3%、发酵时间96 h、酵母浸粉质量分数为2.4%、L-谷氨酸钠质量分数为2%,分别设置发酵温度28、33、37、42、47 ℃,考察不同发酵温度下GABA含量的变化。

1.3.6.3 发酵工艺的响应面试验

使用Design Expert软件,根据单因素实验结果,选取酵母浸粉、L-谷氨酸钠、发酵时间、发酵温度为自变量,以GABA含量为响应值,运用Box-Behnken试验设计方法,设计四因素三水平试验,各因素水平见附录附表1。

1.3.6.4 发酵工艺的人工神经网络模型建立与优化

在响应面试验的基础上,通过MATLAB软件建立人工神经网络模型,对乳酸菌发酵黑果花楸汁的最优条件进行预测。利用软件MATLAB2018b中Neural Network Tool构建人工神经网络模型,设计的4-10-1 BP-ANN模型结构见附录附图1。训练终止条件为达到预设的误差极限或完成设定的最大迭代次数(1 000次)。试验过程中,将样本数据随机划分为训练集(70%)、验证集(15%)和测试集(15%)。输入层有4个神经元,分别对应(酵母浸粉添加量、L-谷氨酸钠添加量、温度、发酵时间),而输出层有1个神经元,为GABA含量。然后,利用遗传算法(GA)对该模型进行优化,以寻找最优参数值。

1.3.7 感官评价方法

1.3.7.1 主观感官评价方法

依据NY 82.2—1988《果汁测定方法 感官检验》制定感官评定标准,由10名具备品评经验的人员组成评价小组,评定人员在试验前2 h未进食、吸烟,且人员之间分开进行评价。对果汁口感、色泽、香气和质地4项进行评分,使用上述标准的线性尺度按百分制(大于80分为优、60～80分为良、40～50分为中、20～40分为差、小于20分为极差)进行打分。具体产品感官评分标准见表1。

1.3.7.2 电子舌分析方法

分别对发酵(F)与未发酵(UF)的果汁样品进行电子舌分析。首先进行平衡操作,随后进行上机测试,测试时间为30 s。首先输出初味值;然后在参比液中清洗3 s,并将传感器插入新的参比液中测试回味30 s。食品五味传感器(C00、AE1、CA0、CT0、AAE)各测试4次,去掉第1次循环,取后3次平均值作为最终测试结果。

1.4 数据处理

利用Microsoft Excel 2023、SPSS Statistics 23、Origin 2022等软件对试验结果进行分析处理。采用SPSS 23.0软件进行单因素方差分析(ANOVA),并用邓肯新复极差法(Duncan’s new multiple range test)进行多重比较,以P<0.05表示差异显著,P<0.01表示差异极显著。所有试验均进行3次平行试验,结果以平均值±标准差表示。

2 结果与分析

2.1 发酵黑果花楸汁产GABA乳酸菌的筛选结果

2.1.1 对产GABA乳酸菌的初筛结果

本研究所用64株乳酸菌分离自中国传统发酵食品,包括东北泡菜、湖北辣椒酱和新疆传统发酵乳制品。选择上述来源的依据是:传统发酵食品中蕴藏着丰富的乳酸菌资源,这些菌株经过长期自然筛选,通常具有良好的酸耐受性和环境适应性;且泡菜、辣椒酱等基质的pH环境(3.5～4.5)与黑果花楸汁(pH=3.8)相近,来源于此类环境的菌株更易于适应目标基质[17]。

不同菌株发酵液中的GABA含量测定结果见图1。为获得高产γ-氨基丁酸(GABA)的乳酸菌,本研究首先以L-MRS发酵液(添加质量分数为1.5%的L-谷氨酸钠的MRS液体培养基)发酵基质,采用薄层层析(TLC)与高效液相色谱(HPLC)相结合的方法进行筛选。图1(a)为TLC筛选结果,从实验室保藏的64株菌株中初步筛选出6株与10 mg/mL GABA标准品具有相同Rf值的菌株,分别为Lj11、Lj14、Lj15、Lj16、Lj18和PC-2。进一步采用HPLC法对上述6株菌进行GABA定量分析,结果如图1(b)所示,菌株间GABA的合成能力具有明显差异,其中Lj11和Lj14分别以(8.50±0.15) mg/mL 和(7.90±0.08) mg/mL的产量显著高于其他菌株,表明其具备较强的谷氨酸脱羧酶活性与高效的GABA转化潜力。相比之下,Lj15和Lj16的产量接近4.3 mg/mL,属于中等水平,而Lj18和PC-2产量较低,分别为(1.73±0.61) mg/mL和(1.29±0.05) mg/mL,说明不同菌株在相同培养条件下代谢GABA的能力存在显著分化。从菌株功能多样性来看,初筛得到的6株菌株均为潜在的优良GABA生产者,尤其是Lj11与Lj14的GABA产量远高于多数文献中报道的从传统食品中分离的乳酸菌产量,通常为0.2～0.3 mg/mL[18-19]。这一结果为开发富含GABA的功能性发酵饮品提供了优良的菌种资源。

2.1.2 对产GABA乳酸菌的复筛结果

产GABA乳酸菌在黑果花楸汁中复筛的结果如图2所示。乳酸菌合成GABA的能力受碳氮源、pH及底物浓度等多种因素影响。当菌株从L-MRS发酵液(添加质量分数为1.5%的L-谷氨酸钠的MRS液体培养基)转换至成分复杂的黑果花楸汁基质时,其GABA合成能力发生了显著变化。短乳杆菌Lj16展现出卓越的环境适应性,以(2.07±0.04)mg/mL的产量显著领先(P<0.05),而MRS发酵液中的高产菌株Lj11在果汁中产量最低为0.15 mg/mL。这主要是由于菌株在代谢适应性的差异。研究表明[20],短乳杆菌属菌株通常具备更强的酸耐受力和底物利用能力,其谷氨酸脱羧酶(glutamic acid decarboxylase,GAD)系统在酸性环境下可通过构象变化保持较高活性,而植物乳杆菌Lj11虽在富营养培养基中表现优异,但其酶系统可能对果汁中的酚酸类抑制剂更为敏感。黑果花楸汁富含绿原酸、花青素等多酚类物质,这些酚类化合物通过抑制GAD活性或干扰底物跨膜运输来影响GABA合成[21]。此外,短乳杆菌属通常具有更丰富的碳水化合物转运与代谢基因,能更有效地利用果汁中的碳源维持生长[22] 。

2.1.3 产GABA乳酸菌的形态学观察与分子生物学鉴定结果

本研究通过产GABA能力初筛获得6株高产菌株后,为进一步明确其分类学地位,对这6株菌进行了形态学观察和16S rDNA分子生物学鉴定结果见图3。菌落形态观察如图3(a)所示,所有菌株在MRS固体培养基上均形成表面光滑、边缘整齐的典型乳酸菌菌落,但颜色与大小存在种内及种间差异。其中,Lj11与Lj18菌落呈白色,表面光滑,菌落大小适中;Lj14、Lj15与Lj16的菌落呈微乳白色,表面光滑,菌落较小。菌落形态如图3(b)所示,通过革兰氏染色镜检证实6株菌均为革兰氏阳性杆菌,其中Lj11、Lj18和PC-2菌体呈长杆状,而Lj14、Lj15和Lj16则呈现典型的短杆状形态,这一形态差异初步提示了其可能分属不同的菌种。

通过16S rDNA序列测序与比对,进一步明确了各菌株的分类学地位。分子鉴定结果见表2,菌株Lj11、Lj18和PC-2与植物乳杆菌(Lactiplantibacillus plantarum)的参考序列同源性最高(99.73%～99.87%);而菌株Lj14、Lj15和Lj16则鉴定为短乳杆菌(Levilactobacillus brevis),同源性达99.67%～99.93%。所有菌株与数据库已知菌株的序列相似度均高于99.6%,确保了鉴定结果的可靠性。高产GABA乳酸菌在物种分布上呈现多样性,涵盖了植物乳杆菌和短乳杆菌这两个在发酵食品中常见且具有良好GABA合成潜力的属。菌株来源信息显示,所有菌株均分离自中国传统发酵食品(辣椒酱、泡菜),进一步印证了传统发酵环境是筛选功能性乳酸菌的宝贵资源库。

2.2 优良菌株Lj16的生理特性优势分析结果

2.2.1 乳酸菌的生长曲线及产酸曲线

初筛获得的6株乳酸菌生长曲线和产酸曲线测定结果如图4所示。生长曲线可以反映菌株的生长规律及在不同时期的生长状态。对初筛获得的6株乳酸菌进行生长能力分析,结果见图4(a),所有菌株均呈现典型的S形微生物生长周期,但不同菌株在延滞期时长、生长速率及产酸模式上存在明显差异。Lj11、Lj14、Lj18及PC-2的延滞期较短(0～4 h),随后快速进入对数生长期,约8 h后进入稳定期。说明此类菌株适应性强,迅速增殖,有利于在发酵初期快速建立菌群优势。Lj15和Lj16的延滞期同样约为4 h,但对数生长期显著延长,分别持续至44 h和36 h左右,Lj16最终菌体生长量OD600为1.36时达到稳定;较长的对数期表明Lj15和Lj16在MRS培养基中具有持续、稳健的生物量积累能力,这为其后续在稳定期进行次级代谢产物的高效合成提供了充足的细胞基础。

通过测定发酵过程中的pH动态变化,从而评价不同菌株的产酸动力学特征,为筛选适合黑果花楸汁发酵的菌株提供依据。6株菌株的产酸曲线如图4(b)所示,所有菌株在发酵过程中pH均持续下降符合乳酸菌发酵特性,产酸动力学模式与生长曲线分类高度对应。Lj11、Lj14、Lj18、PC-2高效产酸的特点,在0～12 h内pH急剧下降,之后趋于较低水平。Lj15、Lj16的产酸曲线相对平缓,pH在8 h后开始缓慢下降,直至48 h左右趋于稳定,最终pH值为5.0;高于Lj11等菌株且在GAD最适pH范围内, GAD酶的最适pH值为4.5～5.0,过低的pH会抑制其活性,Lj15和Lj16的产酸能力更适合GAD酶的最适pH,从而保证了GAD酶的活性。

综合生长曲线与产酸曲线分析,不同菌株展现了不同的代谢策略:Lj11、Lj14等菌株倾向于快速生长、快速产酸,适合于追求快速发酵和酸化的工艺;而Lj15、Lj16则表现为稳健生长、温和产酸,其较长的稳定期和相对较高的终末pH值可能更有利于GABA等次级代谢产物的持续积累。这为根据目标产物GABA的合成特点选择合适的发酵菌株提供了关键依据。

2.2.2 乳酸菌的耐酸能力

乳酸菌耐酸能力测定结果如图5所示。乳酸菌的耐酸能力是其发挥益生功能的重要因素之一。由于胃排空时间通常为2～3 h,因此采用低pH培养基(pH值为2.5～3.5的MRS肉汤,处理2～4 h)模拟胃内酸性胁迫环境来评价乳酸菌的耐酸能力[23]。菌株间耐受酸性胁迫的能力存在显著差异(P<0.05),且与其在后续发酵体系中的适应性密切相关。pH值在3.5～4.5处理2 h内,各菌株之间存活率差距不大。模拟胃部极端酸性环境pH=2.5条件下,处理4 h,所有菌株存活率均急剧下降,但PC-2和Lj16的存活率分别为67.35%±3.5%和65.79%±0.84%,表现出最强的耐受性, 这表明PC-2和Lj16在极端酸性环境下能更好地维持细胞活性,具备更强的酸耐受潜力,这为其在酸性黑果花楸汁基质中的生长与代谢提供了有利条件。当环境pH值上升至近似于果蔬汁发酵条件的3.5和4.5时,各菌株存活率普遍大幅提升,其中Lj15和Lj16在pH=3.5条件下展现出了良好的持续耐受能力与适应潜力。Lj16的良好耐酸能力为适合黑果花楸汁发酵提供了理论依据。

2.2.3 乳酸菌的GAD酶活力

表3为各菌株在MRS发酵液与L-MRS发酵液中的GAD酶活力。结果表明,菌株Lj16的GAD酶活力显著优于其余5株菌。其在MRS发酵液中的酶活力为(0.283±0.048)U/mL,而在L-MRS培养基(添加质量分数1.5% L-谷氨酸钠的MRS发酵液)中,酶活力显著提高至(2.020±0.182)U/mL。已有研究指出,多数乳酸菌(如鼠李糖乳杆菌、干酪乳杆菌和植物乳杆菌)通常仅具备由gadA或gadB基因编码的GAD酶系统,而短乳杆菌则拥有编码两种相同亚型GAD酶的基因,这是Lj16表现出较高GAD酶活力的内在原因[24]。此外,GAD酶活力反映的是酶在测定条件下的瞬时催化能力,而GABA产量则是菌株在36 h发酵过程中代谢积累的最终结果。Lj11和Lj14可能在发酵前期酶活较高,迅速将底物转化为GABA;而Lj16的GAD活力高峰可能出现在更晚的时间点,或其在MRS培养基中生长较慢,导致总产量偏低。与在MRS发酵液中相比,Lj11、Lj15、Lj18和PC-2在L-MRS发酵液中的GAD酶活力分别提高了76.20%、144%、37.78%和52.50%,表明L-谷氨酸钠对其GAD酶活力有显著促进作用。

2.3 发酵工艺的单因素实验结果

不同单因素对黑果花楸汁中GABA含量的影响结果见图6。酵母浸粉作为重要的氮源,对乳酸菌发酵黑果花楸汁过程中GABA的积累具有显著影响。由图6(a)可知,当酵母浸粉质量分数在0～1.2%时,GABA含量随其浓度增加而稳步上升,当酵母浸粉质量分数达到2.4%时,菌体生长与GABA合成均处于较佳状态,GABA积累量最高,为(7.04±0.29)mg/mL。

图6(b)为发酵时间对乳酸菌发酵黑果花楸汁GABA含量的影响。发酵前120 h内,GABA产量显著增加(P<0.05),从3.17 mg/mL增长至7.6 mg/mL。发酵120 h后GABA含量增长趋于平缓,此时乳酸菌发酵进入稳定生长期。这一结果说明,GABA的合成并不严格依赖于菌体的快速增殖阶段,而主要发生在稳定期,即产物合成与菌体生长呈部分偶联型关系[25]。这与Hyun[26]研究乳酸菌发酵稻芽产GABA的结果一致:在发酵48 h后GABA含量迅速上升,72 h达到峰值。综合考虑,选用发酵时间120 h进行后续试验。

乳酸菌可将L-谷氨酸钠直接作为底物,在GAD酶的催化下发生不可逆的a-脱羧反应,从而合成GABA。L-谷氨酸钠添加量对乳酸菌发酵黑果花楸汁中GABA含量的影响如图6(c)所示。当L-谷氨酸钠质量分数为0～2%时,GABA含量随L-谷氨酸钠浓度的增加而显著上升。当L-谷氨酸钠质量分数在2%时,GABA含量达到最高值7.81 mg/mL,此时菌体代谢活跃,可以更高效地通过GAD酶将L-谷氨酸钠转化为GABA;当L-谷氨酸钠质量分数超过2%时,GABA产量反而呈现明显下降趋势。这主要是由于当底物浓度过高时,体系渗透压上升、离子强度增大,对乳酸菌的生长产生抑制作用,导致菌体生物量下降;此外,过高浓度的底物也会对谷氨酸脱羧酶活性产生底物抑制效应,降低酶催化效率[27]。因此,L-谷氨酸钠质量分数2%是本研究中实现GABA富集的最适宜添加量。

温度对黑果花楸汁发酵过程中GABA的合成如图6(d)所示,发酵温度在28～47 ℃变化时,GABA含量呈现明显的先升高后降低的趋势。当温度从28 ℃升高至37 ℃时,GABA含量持续增加,并在37 ℃时达到峰值(7.83±0.30)mg/mL。这与Santos-Espinosa等[28]研究结果一致,在乳酸菌发酵牛奶富集GABA的过程中,孵育温度从30 ℃提高至37 ℃,GABA含量随着温度上升而增强,适宜的发酵温度促进了底物向GABA的高效转化。因此,发酵最佳温度为37 ℃。

2.4 发酵工艺的响应面试验结果

2.4.1 回归模型建立

黑果花楸汁发酵工艺响应面结果见附录附表2。基于酵母浸粉添加量、L-谷氨酸钠添加量、发酵时间和发酵温度4因素3水平的响应面试验,设计建立GABA含量的回归方程为:Y=8.42+0.029 51A+1.02B+0.939 8C+0.511 4D+0.271 3AB-0.029 3AC-0.702 2AD-0.447 4BC+0.778 2BD-0.586 2CD-1.99A2-3.71B2-4.87C2-1.26D2,并对该模型进行方差分析,结果见附录附表3。试验所建立的模型决定系数R2=0.931 0,P=0.143 3>0.05,失拟项不显著(P>0.05)、回归模型影响效果为极显著(P<0.01),说明构建的响应面二次多项式模型极显著,能较好地拟合试验数据。模型中,二次项A2、D2影响显著(P<0.05),B2、C2影响为极显著(P<0.01);各因素的P值按从小到大的顺序为:B(L-谷氨酸钠添加量)< C(发酵温度)< D(酵母浸粉添加量)< A(发酵时间),表明4个因素中L-谷氨酸钠添加量对GABA含量的影响最为显著;F值反映试验因素对GABA含量的影响强度,F值越大,越有可能表明该因素影响强度越大,FB>FC>FD>FA,表明4个因素对GABA产量影响的强度顺序为B[w(L-谷氨酸添加)]> C(发酵温度)>D[w(酵母浸粉添加)]>A(发酵时间)。综上所述,该二次回归方程拟合效果较好,可用于工艺分析与优化。

2.4.2 响应面数学模型的分析

附录附图2为响应面各因素之间的交互作用对GABA含量影响的响应面图和等高线图。由附录附图2(a)可知,发酵时间(A)和发酵温度(C)的等高线呈椭圆形,两者增加均明显提升GABA产量,表明二者之间存在良好协同效应。附录附图2(b)中L-谷氨酸钠添加量(B)和发酵时间(A)的等高线图为椭圆形,且响应面图的坡度较大,在L-谷氨酸钠添加量较低时,发酵时间的增加能有效提高GABA产量,整体三维图变化趋势平缓,表明时间与L-谷氨酸钠的交互作用对GABA含量影响不大。附录附图2(c)中L-谷氨酸钠的添加量(B)和发酵温度(C)的反应面图显示两者的陡峭度大致相同,L-谷氨酸钠的陡峭度比发酵温度的略大,对应的等高线形状大致呈圆形,表明L-谷氨酸钠与发酵温度的交互作用对GABA含量的影响并不显著。附录附图2(d)中酵母浸粉添加量(D)与L-谷氨酸钠(B)的等高线形状呈圆形,表明酵母浸粉与L-谷氨酸钠的交互作用对GABA含量影响不显著。

2.4.3 响应面模型的验证

响应面数学模型得到乳酸菌发酵黑果花楸汁的最佳工艺为:发酵时间120.914 h、L-谷氨酸钠质量分数2.43%、温度37.25 ℃、酵母浸粉质量分数1.84%,葡萄糖质量分数1.5%,该条件下GABA含量为8.20 mg/mL。考虑试验的可操作性,将工艺条件稍作调整,发酵时间121 h、L-谷氨酸钠质量分数2.43%、发酵温度37 ℃、酵母浸粉质量分数1.9%、葡萄糖质量分数1.5%。在此条件下进行试验,通过3次工艺验证实验,最终得到黑果花楸汁的平均GABA含量为(8.23±0.77) mg/mL,该结果与预测值相差0.03 mg/mL,可以看出实际值和预测值相差较小,说明本次实验所做模型可以较好地反映乳酸菌发酵黑果花楸汁产GABA的工艺,表明通过响应面法获得的优化参数可靠、准确。

2.5 发酵工艺的人工神经网络模型优化结果

2.5.1 人工神经网络模型的构建

附录附图3为人工神经网络拟合结果。模型在训练集、验证集及全体数据集上均表现出极高的拟合优度,其R值分别达到0.999 74、0.990 4和0.932以上。所有数据点的预测值与实测值高度集中于拟合线(Y=T)附近,表明所构建的ANN模型能够极其准确地学习和复现训练数据中复杂的输入-输出关系,具备卓越的非线性映射能力。ANN训练结果得到R值近似接近于1,此高回归值显示预测值与数据集的实际值相似度较高,表明构建的神经网络模型对于试验结果的预测能力可靠。

2.5.2 人工神经网络模型的分析与验证

附录附图4为人工神经网络均方误差曲线。在ANN模型中,随着迭代次数增加,训练、验证和测试集的均方误差(mean-square error, MSE)值逐渐下降并趋于最优, MSE值越小,代表模型预测试验数据准确性越高[29]。随着训练迭代次数(Epoch)的增加,训练集、验证集和测试集的均方误差(MSE)均迅速下降并趋于稳定。如附录附图4所示,MSE值的随变次数增加在训练、验证和测试过程中逐渐向最优值靠拢。验证效果最佳的为第4个epoch,MSE值为0.348 58,几乎接近于0。表明模型获得了最佳的泛化性能,确保了模型对新工艺条件的预测可靠性。

利用遗传算法对模型进行了优化,成功寻找到最优发酵条件,酵母浸粉质量分数2.37%、L-谷氨酸钠质量分数2.32%、发酵温度36.17 ℃、发酵时间119.73 h,此时,黑果花楸汁中GABA含量理论上最大,为8.65 mg/mL。考虑实验操作的可进行性,将工艺条件稍作调整,酵母浸粉质量分数2.4%、L-谷氨酸钠质量分数2.3%、葡萄糖质量分数1.5%、发酵温度36.5 ℃、发酵时间120 h,在此条件下进行验证实验,GABA含量为(8.77±0.16) mg/mL。与预测值基本一致。由此说明,采用ANN-GA优化产GABA乳酸菌发酵黑果花楸汁准确可靠。

2.6 发酵工艺的响应面试验与人工神经网络模型结合优化结果

ANN-GA模型在本研究中表现出优于RSM的预测精度,这与其处理非线性、高维交互作用的能力有关。RSM基于二次多项式回归,适用于因素间关系较为平滑、线性的体系;而乳酸菌发酵黑果花楸汁过程中,GABA的合成受温度、pH值、底物浓度、菌体代谢状态等多因素的非线性交互影响,可能存在阈值效应或协同或拮抗作用。ANN通过多层神经元结构能够自动学习并拟合这些复杂的非线性关系,无须预先假设模型形式,而GA则可在全局范围内搜索最优解,避免陷入局部极值[30]。因此,利用RSM-ANN优化黑果花楸汁经乳酸菌发酵而提高GABA含量的工艺条件更准确可靠,这说明将人工神经网络模型与应答面结合在一起可以对工艺条件进行很好的预测。这与Sonawane等[31]在研究人工神经网络和响应面法优化贝尔果汁的发酵结果一致,采用RSM-ANN优化发酵贝尔果汁提高营养物质的工艺条件准确性高,将BP神经网络模型与响应面相结合能很好地预测工艺条件。最终确定最佳发酵条件为发酵温度36.5 ℃、发酵时间120 h、酵母浸粉质量分数2.4%、L-谷氨酸钠质量分数2.3%、葡萄糖质量分数1.5%,黑果花楸汁GABA产量8.77 mg/mL(见表4)。

2.7 感官评价结果

图7是综合评价发酵对黑果花楸汁感官品质的影响,本研究组织感官评价小组对样品进行人工评分,从口感、色泽、香气和质地4个方面进行比较。由图7(a)可知,未发酵黑果花楸汁总得分为46分,其中口感与香气得分较低,这主要是由于其天然酸涩味较强。经Lj16优化工艺发酵后,发酵黑果花楸汁总得分提升至80分,尤其在口感方面改善最为显著,酸甜协调、涩味降低、回味良好,有效缓解了原汁的刺激涩感。色泽方面,发酵汁保持清亮紫红色,透明度良好,得分与未发酵组接近。香气评价中,发酵组呈现出更丰富的果香与柔和的发酵香,这与乳酸菌代谢产生的酯类、醇类等挥发性风味物质有关[32]。质地上,发酵汁均匀澄清,无明显沉淀,整体接受度显著优于未发酵组。

电子舌作为一种客观、灵敏且标准化的风味分析工具,能够全面、准确地反映果汁在口感与风味等多维感官属性上的差异[33]。本研究利用电子舌对未发酵黑果花楸汁与经短乳杆菌Lj16发酵后的果汁进行比较分析,结果见图7(b)。雷达图表明,未发酵果汁在涩味、酸味指标上表现较强,这是由于黑果花楸中富含花青素、多酚类等呈涩物质[34]。经Lj16发酵后,果汁的涩味与酸味明显下降,苦味则有所增强,这是由于乳酸菌代谢产生的有机酸(如乳酸)可与多酚类物质发生相互作用,改变其分子结构,从而降低涩感[35]。其次,部分乳酸菌具有单宁酶或β-葡萄糖苷酶活性,可降解缩合单宁等多酚类聚合物,减少其与唾液蛋白的结合能力[36]。此外,发酵过程中产生的胞外多糖可能通过包埋或络合作用,屏蔽多酚类物质的涩味感受[37],类似地,已有研究报道乳酸菌发酵可有效改善枸杞汁、蓝莓汁等果蔬汁的苦涩口感,提升风味协调性[38-39]。本研究中,发酵后的黑果花楸汁在鲜味与丰富度上也呈现上升趋势,说明发酵过程不仅降低了不良风味,还赋予了果汁更圆润、饱满的口感特征。

综合电子舌客观分析与人工感官评价可知,经短乳杆菌Lj16发酵后,黑果花楸汁的涩味和酸味显著降低,丰富度和鲜味有所提升,风味协调性明显改善。结合GABA含量测定结果,表明Lj16发酵可在富集GABA的同时有效改善产品的风味品质。

3 结 论

研究筛选出1株适于黑果花楸汁发酵产GABA的乳酸菌短乳杆菌Lj16(Levilactobacillus brevis Lj16),由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏,编号为:CGMCC No.35546。Lj16具良好的酸耐性,GAD酶活力达(2.020±0.182)U/mL且黑果花楸汁中GABA产量显著高于其他菌株(P<0.05)。采用RSM与ANN-GA耦合模型优化Lj16发酵黑果花楸汁工艺,确定优化条件为葡萄糖质量分数1.5%、L-谷氨酸钠质量分数2.30%、酵母浸粉质量分数2.40%、发酵温度36.5 ℃、发酵时间120 h,此时GABA产量达(8.77±0.16) mg/mL。感官评价与电子舌分析表明,Lj16发酵显著降低了黑果花楸汁的酸涩味,改善了风味协调性,实现了功能成分富集与感官品质提升的协同目标。希望研究可为开发富含GABA的黑果花楸功能性发酵饮品提供优良菌种和工艺参考。

附录:补充数据

与本文相关的补充数据可以在http:∥dx.doi.org/10.12301/spxb202600052在线版本中找到。

Appendix:supplementary data

Supplementary data associated with this article can be found in the online version, at http:∥dx.doi.org/10.12301/ spxb202600052.

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Screening of γ-Aminobutyric Acid-Producing Lactic Acid Bacteria and Fermentation Process Optimization of Aronia melanocarpa Juice

Wu Yiqing1,3, Xu Junnan1, Meng Chaoxiong2, Li Shuai2, Wang Yuan1, Liu Huiyan1, Shi Xin3,*, Fang Haitian1,*

(1. School of Food Science and Engineering, Ningxia University, Yinchuan 750021, China; 2. Institute of Agri-Products Processing, Jiangsu Academy of Agricultural Sciences, Nanjing 210014, China;3. Ningxia Institute of Agricultural Product Quality Standards and Testing Technology, Yinchuan 750002, China)

Abstract： To develop a functional fermented beverage of Aronia melanocarpa rich in γ-aminobutyric acid (GABA), a GABA-producing lactic acid bacterium (LAB) suitable for fermenting Aronia melanocarpa juice was screened, and the fermentation process was optimized. Six GABA-producing strains were screened based on L-MRS medium from 64 LAB isolates derived from traditional Chinese fermented foods by thin-layer chromatography and high-performance liquid chromatography. These six strains were further used to ferment Aronia melanocarpa juice, and the mass concentration of GABA in the fermented juice was determined. Morphological observation and 16S rDNA molecular identification were performed on the six strains to select one excellent fermentation strain. For this strain, the growth curve, acid production curve, acid tolerance, and glutamate decarboxylase (GAD) activity were measured. Single-factor experiments, response surface methodology, and an artificial neural network (ANN) model were applied to optimize the fermentation process and determine the optimal conditions. Subjective sensory evaluation and electronic tongue analysis were used to evaluate the fermented Aronia melanocarpa juice produced under the optimal conditions and to assess the impact of fermentation on juice flavor. The results showed that among the fermented juices prepared by the six GABA-producing LAB strains, the highest GABA mass concentration reached 2.07 mg/mL. The strain yielding the highest GABA concentration in the fermented juice was selected as the excellent strain (designated Lj16). Based on morphological observation and 16S rDNA molecular biological identification, Lj16 was identified as Levilactobacillus brevis. The GABA production of Lj16 in fermented Aronia melanocarpa juice was significantly higher than that of the other strains (P<0.05). Characterization of the growth curve, acid production curve, acid tolerance, and GAD enzymatic activity of Lj16 revealed that Lj16 exhibited a long logarithmic phase, indicating sustained and robust biomass accumulation. After treatment at pH 2.5 for 4 h, the survival rate of Lj16 reached 65.79%±0.84%. The GAD enzymatic activity was as high as (2.020±0.182)U/mL, and the acid production was mild (final pH 5.0), which facilitated sustained GAD function. Single-factor experiments, response surface methodology, and an artificial neural network-genetic algorithm (ANN-GA) coupled model were used to optimize the fermentation process. The optimal conditions were determined as follows: sodium L-glutamate mass fraction 2.30%, yeast extract powder mass fraction 2.40%, fermentation temperature 36.5 ℃, fermentation time 120 h and glucose mass fraction 1.5%. Under these optimal conditions, the GABA mass concentration in the fermented juice reached (8.77±0.16) mg/mL. Subjective sensory evaluation and electronic tongue analysis of the fermented juice prepared under the optimal conditions showed that the sour and astringent tastes were significantly reduced, and the flavor harmony was markedly improved. This study screened a LAB strain suitable for GABA enrichment during Aronia melanocarpa juice fermentation, optimized the fermentation conditions, and improved the juice flavor. These findings could provide technical guidance for the development of functional fermented beverages with high GABA content and for the flavor regulation of Aronia melanocarpa juice.

Keywords： lactic acid bacteria; γ-aminobutyric acid; Aronia melanocarpa juice; fermentation; flavor

doi：10.12301/spxb202600052

文章编号：2095-6002(2026)04-0193-16

引用格式：吴易青,徐俊南,蒙朝雄,等. 产γ-氨基丁酸乳酸菌的筛选及其发酵黑果花楸汁的工艺优化[J]. 食品科学技术学报,2026,44(4):193-208.

Wu Yiqing, Xu Junnan, Meng Chaoxiong, et al. Screening of γ-aminobutyric acid-producing lactic acid bacteria and fermentation process optimization of Aronia melanocarpa juice[J]. Journal of Food Science and Technology, 2026,44(4):193-208.

收稿日期： 2026-01-29

基金项目： 宁夏农林科学院科技创新引导科技攻关项目(NKYG-24-10);宁夏回族自治区重点研发计划项目(2024BEG01006);宁夏回族自治区重点研发计划引才专项(2024BEH04143)。

Foundation： Science and Technology Innovation Guiding Research Project of Ningxia Academy of Agriculture and Forestry Sciences (NKYC-24-10); Key Research and Development Program of Ningxia Hui Autonomous Region (2024BEG01006); Talent Introduction Special Project of the Key Research and Development Program of Ningxia Hui Autonomous Region (2024BEH04143).

第一作者： 吴易青,女,硕士研究生,研究方向为健康食品生物制造。

*通信作者：

方海田,男,教授,博士,主要从事健康食品与生物制造方面的研究。E-mail:fanght@nxu.edu.cn。

石 欣,女,副研究员,主要从事健康食品与生物制造方面的研究。E-mail:sxdewp@163.com。

中图分类号： TS255.44

文献标志码： A

(责任编辑：李 宁)