干酪富含蛋白质、维生素及矿物质,素有“奶黄金”之称[1],兼具营养与肠道调节功能。马苏里拉(Mozzarella)干酪源自意大利,因其质地细腻、融化拉伸性好,被广泛用于披萨等食品,但目前国内消费主要依赖进口,成本较高,亟须开发本土原料制品。我国水牛乳资源丰富,其中云南槟榔江水牛乳的乳蛋白和乳脂含量分别达荷斯坦牛乳的1.2倍与2.1倍,且富含κ-酪蛋白(κ-CN),有助于提升凝乳效率、降低凝乳酶用量[2],是干酪制备的优质原料。

高尿酸血症(hyperuricaemia,HUA)是一种由嘌呤代谢紊乱或尿酸排泄障碍引起的全身性代谢性疾病,我国患病率已升至18.7%[3],且与心血管疾病、糖尿病等共病密切相关,已成为严重的公共卫生负担。XOD是尿酸合成的关键限速酶,催化次黄嘌呤转化为黄嘌呤并进一步氧化为尿酸,同时伴随大量活性氧(ROS)的产生,加剧氧化应激并协同尿酸晶体激活炎症通路,进而诱发痛风性关节炎及肾损伤等并发症[4]。目前临床常用的XOD抑制剂(别嘌呤醇和非布司他等)虽能有效降尿酸[5],但长期使用易引发肝肾功能障碍与皮肤毒性等不良反应[6],亟须开发更安全、高效的替代疗法。食源性生物活性短链肽(通常为2～10个氨基酸)可通过氢键、疏水作用或π-π堆积与XOD活性中心或疏水位点结合,从而有效抑制酶活。金枪鱼来源的FH肽[7]与核桃来源的WPPKN/ADIYTE肽[8]均显示出较强的XOD抑制能力。乳源活性肽因安全性高、XOD抑制活性显著,已成为降尿酸领域研究的热点。乳清蛋白作为优质蛋白源,其酶解产物中富含多种功能肽段,已报道具有抗氧化、抗炎及ACE[9]抑制等活性,然而其在XOD抑制与尿酸代谢调节方面的作用尚缺乏系统研究[10]。

本研究利用团队前期自主开发的槟榔江水牛乳马苏里拉干酪,挖掘其水溶性肽中的 XOD 抑制活性肽段,通过超滤、液相色谱-质谱联用、分子对接及分子动力学模拟等技术,筛选并鉴定乳清蛋白中具有XOD抑制活性的肽段,旨在为开发乳清来源的降尿酸功能性食品提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

水牛乳,腾冲市巴福乐槟榔江水牛良种繁育有限公司;微生物凝乳酶(食品级),深圳市富晟生物科技有限公司;发酵剂动物双歧杆菌乳亚种(菌株编号:DSM15954),科汉森(北京)贸易有限公司;食品级CaCl2,河南万邦实业有限公司;XOD(分析纯)、黄嘌呤,上海麦克林生化科技股份有限公司。

1.2 仪器与设备

PHSJ-4F型pH计,上海锦锚工业科技有限公司;GJB1000-60型均质机,常州市均质机械有限公司;HH-M6型六孔水浴锅,江苏新春兰科学仪器有限公司;TGL20M型高速冷冻离心机,北京中兴伟业仪器有限公司;SCI ENTZ-18N型真空冷冻干燥机,上海比朗仪器制造有限公司;Multiskan Go1510型酶标仪,赛默飞世尔(上海)仪器有限公司;Binder GmbH型温控箱,德国宾得商贸有限公司;WQF-530A型傅里叶变换红外光谱仪(FTIR),北京北分瑞利分析仪器(集团)有限责任公司。

1.3 实验方法

1.3.1 马苏里拉干酪的制备

参照Zhang等[11]的方法,并略加调整。首先将新鲜水牛乳在63 ℃的水浴锅中巴氏杀菌30 min,随后冷却至40 ℃。接着加入质量分数0.03%的发酵剂进行发酵,直至凝乳形成,此时pH值降至6.0;之后添加质量分数0.01%氯化钙与质量分数0.14%微生物凝乳酶,继续凝乳过程,直至pH值为5.3。将形成的凝块切割为1 cm3的小块,置于50 ℃水浴中促使乳清排出;最后,在80 ℃的质量分数2%盐水环境中对凝块进行热烫拉伸,经过反复折叠、塑形并冷却,制成马苏里拉干酪。

1.3.2 水溶性肽冻干粉的制备

参照陈珊[12]的方法并稍加修改,将干酪样品切碎后按料液比1∶2(g/mL)混合,经14 000 r/min均质2 min,于40 ℃孵育1 h以脱除脂肪。随后在4 ℃、9 000 r/min条件下高速冷冻离心20 min,收集上清液,于-80 ℃保存。使用冷冻干燥机,在真空下冷冻干燥,即可获得水溶性肽冻干粉,-20 ℃保存备用[13]。

1.3.3 水溶性肽冻干粉XOD抑制率的测定

参考常畅等[14]的方法并稍加修改,采用50 mmol/L磷酸盐缓冲液(pH=7.4)配制0.06 mg/mL黄嘌呤溶液及0.05 U/mL XOD溶液。取50 μL样品或缓冲液与50 μL XOD于37 ℃共孵育30 min,随后加入150 μL黄嘌呤溶液(0.06 mg/mL)进行酶促反应。加入底物后立即于292 nm波长下测定吸光度。实验设样品组、样品空白组、对照组和空白组,按式(1)计算XOD抑制率。

XOD抑制率=[1-(A1-A2)/(A3-A4)]×100%。

(1)

式(1)中,A1是样品组吸光度;A2是样品空白组吸光度;A3是对照组吸光度;A4是空白组吸光度。

1.3.4 水溶性肽序列的鉴定及生物信息学分析

参考赵琼[15]的方法并稍加修改,采用LC-MS/MS分析水牛乳干酪中分子质量小于3.0 kDa的活性肽。取38 mg样品溶于0.25 mL质量分数0.1%的三氟乙酸溶液,振荡混匀后于4 ℃、9 100 r/min离心5 min,取上清液经超滤管在相同条件下离心15 min,弃滤膜,收集滤液冻干。复溶时加入30 μL质量分数0.1%三氟乙酸,振荡1 min后离心,取滤液进样。液相色谱使用0.15 mm×150 mm×3 μm色谱柱,流动相A为质量分数0.1%甲酸水溶液,B为质量分数0.1%甲酸-乙腈溶液;梯度程序为0～50 min,B相4%～50%;50～54 min,B相50%～100%;54～60 min,B相维持100%。质谱检测采用正离子模式,在全扫描后采集10组二级碎片谱,获取多肽及其碎片质荷比。最终通过MaxQuant 进行数据库检索与数据分析。

利用Peptides Bioactive数据库(https:∥biochemia.uwm.edu. pl/biopep-uwm)进行活性预测;利用肽段活性数据库(http:∥distilldeep.ucd.ie/PeptideRanker)对筛选出的肽段活性进行打分[16];利用Virtual数据库(https:∥webs.iiitd.edu.in/raghava/toxinpred/multi_submit.php)预测肽序列毒性;利用多肽参数计算器(https:∥www.allpeptide.com/canshu.html)计算肽序列溶解性。

1.3.5 XOD抑制肽的分子对接

对接使用的蛋白质晶体结构从Protein Data Bank(PDB)数据库下载,XOD的PDB ID为1 fiq;短肽的3D结构采用PyMol 2.5.5[17]绘制获取,并在MMFF94力场下进行能量最小化。本研究采用AutoDock Vina 1.2.5软件进行分子对接,在对接开始之前,使用PyMol 2.5.5对所有受体蛋白进行处理,包括去除水分子、盐离子以及多肽。之后构建对接盒子,基于晶体配体的位置定义对接盒子的中心,盒子边长设定为30 Å。此外,使用ADFRsuite 1.0[18]将所有处理好的多肽以及受体蛋白转换为AutoDock Vina 1.2.5对接必需的PDBQT格式。对接时,全局搜索的详尽度设为20,其余参数保持默认设置。输出的打分最高的对接构象被认为是结合构象,最后使用PyMol 2.5.5以及Discovery studio viewer对对接结果进行可视化分析。

1.3.6 XOD抑制肽的化学合成

合成顺序为从肽链C端至N端。首先将Fmoc-Ser(tBu)-OH树脂溶胀于DMF中30 min,抽干。加入脱保护液(质量分数20%哌啶的DMF溶液)中,氮气鼓泡反应30 min,抽干后用DMF洗涤6次。称取3倍物质的量的保护氨基酸及2.85倍物质的量的HBTU,投入反应柱,并加入6倍物质的量的NMM,氮气鼓泡反应30 min。反应后用DMF洗涤3次。取少量树脂,加入A液(质量分数80%苯酚+质量分数20%无水乙醇)、B液(重蒸吡啶)、C液(5 g茚三酮+100 mL无水乙醇)各2滴,于110 ℃加热3 min。若树脂无色透明、溶液微黄即为反应完全。若树脂杂色、溶液显蓝则需重新缩合。全部氨基酸连接完成后,脱除末端Fmoc保护基,使N端裸露。最后依次用甲醇、DCM交替洗涤各3次,再以甲醇洗涤2次,抽干后将树脂真空干燥12 h,待切割。

1.3.7 XOD抑制肽体外活性的测定

将样品用pH值为7.4的磷酸盐缓冲液(50 mmol/L)配制成0.5、1.0、1.5、2.0、3.0 mg/mL的溶液,按照1.3.3节方法测定XOD抑制率。

1.3.8 XOD抑制肽二级结构的测定

在干燥环境中,取适量样品与干燥溴化钾粉末(1 mg冷冻干燥合成肽粉末与100 mg溴化钾)置于玛瑙研钵中,充分研磨15～20 min。将研磨均匀的混合物置于压片机上,压制成1～2 mm厚的透明薄片(在137.29 N保持1 min)。随后迅速将薄片置于红外光谱仪光路中,先以空气为背景采集背景光谱,再采集样品的红外光谱[19]。测试条件为波数400～4 000 cm-1,分辨率4 cm-1,波数精度0.01 cm-1,扫描次数为64次。获取光谱后,可使用PeakFit V4.12等软件进行分析,通过Gauss峰形拟合估算子峰位置与数量,并依据各子峰与二级结构的对应关系,利用积分面积计算各二级结构的相对含量。

1.3.9 XOD抑制肽分子动力学模拟

将对接获得的多肽与蛋白质复合物作为初始结构进行全原子分子动力学模拟,模拟时使用AMBER 24软件。模拟之前,多肽和蛋白质分别采用ff14SB蛋白力场进行描述。各体系均采用LEaP模块给体系添加氢原子,在体系10 Å距离处添加截断的八面体TIP3P溶剂盒[20],并在体系中添加 Na+/Cl-用于平衡体系电荷,最后输出用于模拟的拓扑和参数文件。

整个分子动力学模拟流程主要包括能量优化、升温、平衡与最终生产模拟4个阶段。首先,对体系进行能量优化,依次采用2 500步最陡下降法和 2 500步共轭梯度法。优化完成后,在固定体积下将体系从0 K缓慢升温至298.15 K,升温过程持续200 ps。随后,在298.15 K恒温下进行500 ps的NVT(等温等体积)系综模拟,以使溶剂分子在盒子中均匀分布。接着,进行500 ps的NPT(等温等压)系综模拟,以实现体系的充分平衡。最后,在周期性边界条件下,对复合体系执行100 ns的NPT生产模拟。模拟过程中非键相互作用截断距离10 Å;长程静电相互作用采用粒子网格埃瓦尔德方法处理;所有涉及氢原子的键长均使用SHAKE算法进行约束;温度控制通过Langevin动力学实现,其碰撞频率设定为2 ps-1。体系压强为1.013 25×105 Pa,积分步长为2 fs,每隔10 ps保存轨迹用于后续分析[21]。

1.4 数据处理

为确保实验结果的可靠性和重复性,所有定量分析均设置3个平行。使用IBM SPSS Statistics 27软件进行数据处理及统计分析。组间差异采用单因素方差分析(one-way ANOVA),并根据方差齐性检验结果选择相应的多重比较方法:满足方差齐性时采用LSD法,方差不齐时采用Duncan法,显著性水平设定为P<0.05。图形绘制采用Origin 2024b、GraphPad Prism 10、PeakFit 4.12软件。

2 结果与分析

2.1 水牛乳干酪水溶性肽序列鉴定结果

为进一步分析分子质量小于3.0 kDa组分中的活性成分,对其进行LC-MS/MS鉴定,总离子流图如图1所示。实验共鉴定到2 500条肽段,色谱峰多分布于5 min左右、10～20 min、20～30 min、40 min,峰的数量与强度差异体现了该组分在色谱分离过程中的复杂性,以及各组分丰度、电离特性的异质性。

图1 低分子质量水溶性肽组分的LC-MS/MS鉴定结果

Fig.1 LC-MS/MS identification results of low molecular weight water-soluble peptide components

通过生物信息学方法分析水牛乳干酪中鉴定出的2 500条肽段,其中质谱鉴定分数大于50的肽段有2 407条。根据其分子质量分布、活性肽段种类、肽段生物活性评分及肽段的长度等对肽段进行分析,以深入了解水牛乳干酪中的功能性肽段。低分子质量水溶性肽组分中肽段的鉴定及筛选结果见图2。如图2(a)所示,肽段主要由7～14个氨基酸组成,该范围肽段共计1 659条,占总肽段的66.36%。含7～11个氨基酸的肽段1 004条,各残基数对应肽段数量依次为145、220、278、262、244条;12～14个氨基酸的肽段数量则分别为192、171、147条。该范围内肽段数量随氨基酸残基数呈先升后降的分布趋势,含9个氨基酸残基的肽段数量最多。此分布特征与酶解反应特性直接相关,酶对肽键的水解具有位点偏好性与随机性,更易生成9个氨基酸左右的中等长度肽段,且该类肽段在酶解体系中稳定性较高,不易被进一步水解;而长链肽段更易被酶识别并水解,因此留存数量递减[22]。由图2(b)可知,肽段分子质量主要为1.0～2.0 kDa,其中分子质量为1.0～1.5 kDa和1.5～ 2.0 kDa的肽段占比分别达43%和21.4%,而<1.5 kDa的肽段占62.86%。由图2(c)可知,干酪水溶性肽主要来源于β-酪蛋白、αS1-酪蛋白、αS2-酪蛋白、κ-酪蛋白和β-乳球蛋白,其中β-酪蛋白和αS2-酪蛋白来源的肽段占比分别达35.9%和20.2%。肽段蛋白质来源分布结果与徐紫琪等[23]鉴定结果相似。如图2(d)所示,通过Peptide Ranker数据库对肽段的生物活性进行评分,共有30条肽段的评分大于0.8,其中分子质量为0.5～1.0 kDa的肽段有8条,1.0～1.5 kDa的有13条,两者总占比为70%。

图2 低分子质量水溶性肽组分中肽段的鉴定及筛选结果

Fig.2 Identification and screening results of peptides in low molecular weight water-soluble peptide components

2.2 水牛乳干酪XOD抑制肽分子对接结果

分子对接技术能够有效识别受体蛋白表面的潜在配体结合区域,并揭示分子间的结合强度特征,其通过分子层面的相互作用模拟,为相关研究提供快速可靠的评估依据[24]。XOD被认为是一种含钼的酶,其中钼结构域是关键的活性部位。底物黄嘌呤可以通过一条狭窄的疏水通道进入钼结构域。此外,钼结构域被几个亚临界氨基酸残基包围,包括Phe649、Asn768、Glu802、Leu873、Arg880、Phe914、Phe1009、Thr1010、Leu1014、Glu1261,其中Glu802、Glu1261和Arg880对结构域的激活至关重要[25]。根据生物活性评分>0.8的肽段中的分子结合能大小筛选出潜在的5条XOD抑制肽,结果如图3所示,采用分子对接技术研究KFAWPQYLK、SLVYPFP、WPQYLK、YPFPGPIPK、FVAPFPEMF(配体)分别与受体蛋白之间的结合模式和结合力。对接能小于-17.78 kJ/mol表示两者间有一定的结合活性,小于-20.92 kJ/mol 表示有较好的结合活性,小于-29.29 kJ/mol 表示有强烈的结合活性[26]。由表1可知,KFAWPQYLK、SLVYPFP、WPQYLK、YPFPGPIPK、FVAPFPEMF与XOD的对接结合能分别为-34.02、-33.05、-32.38、-31.71、-31.67 kJ/mol,均小于-29.29 kJ/mol,表明肽KFAWPQYLK、SLVYPFP、WPQYLK、YPFPGPIPK、FVAPFPEMF与XOD结合能力均较好。

表1 肽段KFAWPQYLK、SLVYPFP、WPQYLK、YPFPGPIPK、FVAPFPEMF 与XOD受体蛋白的分子对接分析

Tab.1 Molecular docking analysis of peptides KFAWPQYLK,SLVYPFP,WPQYLK,YPFPGPIPK, FVAPFPEMF with XOD receptor proteins

肽序列蛋白质来源结合能/(kJ/mol)氢键数量/个结合位点酶的氢键残基酶的疏水残基平均氢键距离/ÅKFAWPQYLKαS2-酪蛋白-34.022Phe1142-Ser876Leu648-Phe649-Val1011-Pro1076-Pro1012-Lys771-Ala1079-Ala10782.72SLVYPFPβ-酪蛋白-33.053Ser876-His875-Asn768Leu1014-Val1011-Leu873-Phe914-Phe1019-Phe649-Pro10122.63WPQYLKαS2-酪蛋白-32.383Asn650-Tyr1140-Ser876Leu648-Phe1013-Pro1012-Val10112.86YPFPGPIPKβ-酪蛋白-31.713Pro1076-Pro1012-Tyr708Phe649-Leu1014-Leu648-His875-Arg871-Pro10122.41FVAPFPEMFαS1-酪蛋白-31.672Ser876-Glu879Leu648-Leu712-Phe649-Lys713-Phe11422.59

图3 肽段KFAWPQYLK、SLVYPFP、WPQYLK、YPFPGPIPK和FVAPFPEMF与XOD的分子对接结果

Fig.3 Molecular docking results of peptides KFAWPQYLK,SLVYPFP,WPQYLK,YPFPGPIPK and FVAPFPEMF with XOD

分子对接结果显示,KFAWPQYLK与XOD的Phe1142和Ser876残基形成2个氢键相互作用,其氢键距离为2.41～3.02 Å,氢键的平均键长为2.72 Å;与Leu648、Phe649、Val1011、Pro1076、Pro1012、Lys771、Ala1079、Ala1078形成8个Alkyl疏水相互作用,与Leu712、Thr1144、Gly1139、Glu879等残基形成9个范德华力,与Glu1143残基存在1个盐桥作用,与Phe914、Phe1013残基形成2个π-π堆积。这表明KFAWPQYLK肽链中的多个氨基酸与蛋白羧基形成氢键网络;肽链中的正电荷残基与蛋白质负电荷区域形成静电作用;通过结构互补和多模式相互作用实现对XOD活性的强效抑制。SLVYPFP与XOD的His875、Ser876和Asn768残基形成3个氢键(平均键长2.63 Å),并与Leu1014和Phe1019等7个残基发生疏水相互作用。肽段 SLVYPFP 能够占据活性位点空间,阻止黄嘌呤与XOD结合,同时通过多区域接触实现中等强度结合。而WPQYLK则通过3条氢键(Ser876、Asn650等)与疏水相互作用(Lea648、Phe1013等)实现高效抑制,肽链中的带电残基与蛋白质相反电荷形成强静电作用。YPFPGPIPK主要通过与XOD形成氢键(Pro1076、Tyr708)及疏水相互作用(Phe649、Leu1014等),与XOD的Phe1142、Thr1010和Ser874等残基形成范德华力。FVAPFPEMF与XOD的Ser876等残基形成2个氢键相互作用,其氢键距离2.35～2.84 Å,氢键的平均键长为2.59 Å;同时与Leu648、Phe649、Lys713、Phe1142等多个残基形成Alkyl疏水相互作用。

肽段KFAWPQYLK、YPFPGPIPK和FVAPFPEMF能更深入地穿透XOD的疏水通道,直接阻断活性位点并阻止底物黄嘌呤的氧化,氢键与疏水相互作用共同构成肽与酶结合的主要驱动力,疏水残基(Phe1142、Leu1014等)在稳定复合物构象中发挥关键作用。综上所述,筛选得到的KFAWPQYLK、YPFPGPIPK和FVAPFPEMF是具有开发前景的XOD抑制剂,其高结合活性归因于氢键与疏水相互作用的协同效应。

2.3 XOD抑制肽化学合成的质谱分析

对化学合成的肽段KFAWPQYLK、YPFPGPIPK和FVAPFPEMF进行质谱分析,通过b离子(蓝色)和y离子(红色)的特征碎片峰解析其氨基酸序列,结果见图4。3条肽段b、y离子的m/z与该序列从N端、C端裂解的碎片组成一致,氨基酸序列正确,不同离子的丰度差异体现了肽键断裂的特异性。

蓝色,b离子;红色,y离子。

图4 潜在XOD抑制肽二级质谱及化学结构式

Fig.4 Tandem mass spectrometry and chemical structures of potential XOD inhibitory peptides

2.4 XOD抑制肽体外活性分析

通过体外XOD抑制实验评估了3种合成肽(KFAWPQYLK、YPFPGPIPK、FVAPFPEMF)的降尿酸活性(图5)。FVAPFPEMF、YPFPGPIPK、KFAWPQYLK的IC50分别为0.46、1.15、1.18 mg/mL。分析表明,这3种肽段均表现出显著的酶抑制能力,特别是FVAPFPEMF显示出优异的活性。与现有文献报道的食源肽相比,该肽的抑制活性优于英红九号茶蛋白降尿酸肽(IC50=0.72 mg/mL)[27],显著高于藜麦蛋白肽(IC50=5.97 mg/mL)[28]和羊骨生物活性肽(IC50=14.27 mg/mL)[29],展现出良好的应用潜力。3种肽段之间的活性差异提示其氨基酸组成和空间结构可能对抑制效果具有重要影响。现有研究显示,疏水性氨基酸和芳香族氨基酸(苯丙氨酸)可通过疏水相互作用和π-π堆叠与XOD活性中心结合,从而增强抑制效果[30]。值得注意的是,本研究中活性最强的肽FVAPFPEMF(IC50=0.46 mmol/L)与黄鳍金枪鱼来源的HWGTDSF(IC50=0.325 mg/mL)[31]相比仍有一定差距,这可能与肽链长度、氨基酸组成及空间构象有关。对照肽(HWGTDSF)序列较短、空间位阻小,且关键残基更利于与 XOD 活性中心结合;本研究KFAWPQYLK肽链较长,空间构象较大,一定程度上影响了与酶的结合效率,从而表现出略低的体外抑制活性。

不同小写字母表示组间数据差异显著(P<0.05)。

图5 潜在XOD抑制肽的体外活性及IC50值

Fig.5 In vitro activity and IC50 value of potential XOD inhibitory peptides

2.5 XOD抑制肽二级结构分析

肽段KFAWPQYLK、YPFPGPIPK、FVAPFPEMF的红外光谱结果见图6。位于1 600～1 700 cm-1的酰胺Ⅰ带吸收峰与肽链骨架的排列有序性直接相关,该峰波数越大,通常表明蛋白质二级结构的有序度越高[32]。由图6可见,在酰胺 I 带范围内,拟合了4个子峰,β-折叠、无规则卷曲、α-螺旋和β-转角的波长分别为1 600～1 640、1 640～1 650、1 650～1 660、1 660～1 700 cm-1。肽段KFAWPQYLK、YPFPGPIPK、FVAPFPEMF蛋白质二级结构相对含量见表2。KFAWPQYLK的二级结构由β-折叠(19.2%)、β-转角(59.18%)和无规则卷曲(21.62%)组成,YPFPGPIPK的二级结构由α-螺旋(21.28%)、β-折叠(38.49%)和β-转角(40.23%)组成,FVAPFPEMF的二级结构由β-折叠(47.47%)、α-螺旋(12.7%)和β-转角(39.83%)组成。结果表明,β-折叠和β-转角结构在肽中均占主导地位[33]。β-折叠对XOD抑制活性至关重要,β-折叠形成的刚性片层结构,能提升肽与XOD结合后的复合物稳定性,延长作用时间;同时其规整构象可增强肽对XOD催化域的空间挤占,抑制酶的氧化还原反应,减少尿酸生成[34]。同时,位于β-转角区域的氢键相互作用可能进一步增强了结构的稳定性[35]。XOD活性中心多为凹陷口袋结构,肽链的β-转角可灵活嵌入口袋,通过氢键、疏水作用与活性中心氨基酸残基精准对接,阻断黄嘌呤/次黄嘌呤与酶的结合位点,从而达到抑制酶活性、减少尿酸生成的目的。综上,KFAWPQYLK、YPFPGPIPK、FVAPFPEMF 均形成以β-折叠和β-转角为主的有序二级结构,该构象特点能够促进肽段与 XOD 结合并占据其活性位点。β-折叠可增强肽段稳定性并空间阻碍催化反应,β-转角则能灵活嵌入 XOD 的活性口袋,通过氢键与疏水作用阻断底物结合。这些二级结构特征从结构层面揭示了3条肽段具有降尿酸潜力的内在原因,正是该结构使其具备显著的黄嘌呤氧化酶抑制活性,可作为减少尿酸生成的潜在功能肽。

表2 肽段KFAWPQYLK、YPFPGPIPK、FVAPFPEMF

二级结构的相对含量

Tab.2 Relative content of secondary structure of peptides KFAWPQYLK, YPFPGPIPK and FVAPFPEMF

肽段二级结构相对含量/%β-折叠无规则卷曲α-螺旋β-转角KFAWPQYLK19.2021.62/59.18YPFPGPIPK38.49/21.2840.23FVAPFPEMF47.47/12.739.83

图6 肽段KFAWPQYLK、YPFPGPIPK和FVAPFPEMF红外光谱的分峰拟合

Fig.6 Peak fitting of infrared spectra of peptides KFAWPQYLK, YPFPGPIPK and FVAPFPEMF

2.6 XOD抑制肽分子动力学模拟结果

由于分子对接可能导致假阳性结果,因此对肽段进行了100 ns分子动力学(MD)模拟以探索结合稳定性,并获得详细的相互作用曲线[36],FVAPFPEMF和XOD形成的复合物模拟结果见图7。

图7 肽FVAPFPEMF与XOD在100 ns分子动力学模拟中的相互作用结果

Fig.7 Interaction results between peptide FVAPFPEMF and XOD in 100 ns molecular dynamics simulations

均方根偏差(RMSD)可以用于评价配体-蛋白质复合物的稳定状态。由图7(a)可知,配体的RMSD反映了FVAPFPEMF在XOD结合位点内的构象稳定性。肽段在模拟初期(0～10 ns)迅速适应结合口袋,随后RMSD维持相对稳定,说明其在结合状态下未发生剧烈漂移,整体构象较为稳定,具备良好的结合适应性。由图7(b)可见,FVAPFPEMF-XOD复合物RMSD在模拟初期迅速趋于平衡,后期波动较小,结构稳定且无明显构象重排或解离,呈现稳定结合特征。体系于20 ns后逐步达到平衡,平均RMSD为0.48 nm,表明多肽可与XOD活性位点稳定结合。

均方根波动(RMSF)反映各氨基酸残基随时间的构象波动程度。由图7(c)可知,RMSF的偏差主要来自区域A、区域B和区域C(残基497～503、529～535和564～569)。在区域B中,FVAPFPEMF-XOD复合物表现出最高的RMSF值,表明该区域灵活性更高。在模拟条件下,最大的RMSF值也小于1,表明FVAPFPEMF-XOD在复合物形成过程中相对稳定。

在MD模拟中,回旋半径(Rg)是表征蛋白质结构变化的物理参数,结构相对稳定的蛋白质具有更好的紧密性和相应较小的Rg。如图7(d)所示,在100 ns的模拟过程中,FVAPFPEMF-XOD复合物的Rg在开始和结束时没有明显的变化,Rg在3.18～3.20 nm波动,在此范围内Rg均呈上升趋势。蛋白质在复合物形成过程中呈现出轻微的构象松弛趋势,但整体结构依然保持紧致。

氢键数量(hydrogen bonds)是多肽与蛋白质相互作用强度的重要参数,结合稳定的复合物通常会形成数量较多的氢键。这些氢键在数量上虽有一定波动,但整体维持在较高水平,为稳定结合提供了重要支撑[图7(e)]。由图7(f)可知,复合物溶剂可及表面积(SASA)在模拟过程中略有上升,提示肽段和XOD的结合可能导致部分区域更易暴露于溶剂环境。尽管存在一定波动,但整体变化平稳,表明结合过程未显著影响复合物的疏水/亲水平衡或整体构象的暴露特征。

图7(g)展示了FVAPFPEMF-XOD复合物的结合能分解结果,反映了不同关键残基对多肽结合稳定性的贡献,结合能数值越低,代表残基对多肽结合的稳定化贡献越强。其中,Phe 1142 的结合能约为-20.920 kJ/mol,为所有残基中最低值,是主导多肽与 XOD 稳定结合的核心残基;Phe 649、Glu 1143 次之,为次关键贡献残基;其余残基(Pro1012、Val1011、Tyr1140、Thr1010等)结合能绝对值较小,仅提供辅助稳定作用。该结果定量阐明了不同关键残基对多肽结合稳定性的贡献差异。

吉布斯自由能图描绘了受体配体结合的稳定性,其中蓝色表示在自由能图中最小自由能区域内的较低能量,例如可表现为多重和粗糙结构对应较弱或不稳定相互作用,而对于几乎单一和光滑的能量团簇则呈现更强和更稳定的相互作用[37]。如图7(h)～(i)所示,FVAPFPEMF-XOD复合物存在2个尖锐的最低能量区域,推测这这种多肽对XOD具有较强的亲和性。比较分子对接和分子动力学结果,FVAPFPEMF具有更关键的对接位点(Phe 1142、Glu 879),能够更稳定地与XOD结合,说明其抑制活性较强,这与体外抑制实验的结果一致,表明具有最佳的抑制效果。整体分析表明,肽段FVAPFPEMF与XOD形成的复合物在模拟过程中结构稳定、相互作用良好,未出现解离或明显重排。该肽段具有良好的结合潜力和稳定的动力学特性,为其进一步的机制研究或药效优化提供了理论基础。

基于分子动力学模拟,采用MM-GBSA方法计算了多肽与XOD间的结合自由能,以获得更准确的结合作用评估(表3)。如表3所示,肽段FVAPFPEMF与XOD的结合能为(-138.99±13.64) kJ/mol。负值证实二者结合是自发过程,且结合能绝对值较大,说明二者相互作用较强。能量分解分析揭示,范德华力是肽段和XOD结合的主要驱动力,其次是非极性溶剂化自由能的贡献。基于分子对接结果的分子动力学分析表明,肽FVAPFPEMF能够与XOD形成稳定的复合物,从而发挥抑制作用,表现出较好的稳定性。

表3 MM/GBSA法预测的结合自由能及能量分量

Tab.3 Binding free energies and energy components predicted by MM-GBSA method kJ/mol

系统名称FVAPFPEMF-XODΔEvdw-285.60±6.65ΔEelec-654.50±4.73ΔGGB833.12±2.64ΔGSA-32.01±0.38ΔGbind-138.99±13.64

ΔEvdw: 范德华力作用能;ΔEelec: 静电相互作用能;ΔGGB:极性溶剂化自由能;ΔGSA: 非极性溶剂化自由能;ΔGbind: 总结合自由能。

3 结 论

本研究以自主开发的云南特色水牛乳马苏里拉干酪为原料,基于超滤分级得到具有良好体外降尿酸活性的水溶性肽组分,进一步采用质谱鉴定技术结合生物信息学手段,从水溶性肽组分中成功筛选出3种新型XOD抑制肽KFAWPQYLK、YPFPGPIPK和FVAPFPEMF,其中,FVAPFPEMF的IC50达到0.46 mmol/L。肽段二级结构中β-转角和β-折叠是维持其XOD抑制活性和稳定性的主要影响因素。FVAPFPEMF的分子对接和分子动力学模拟分析表明,芳香环氨基酸与酶活性中心疏水口袋形成π-π堆叠及π-σ相互作用,疏水相互作用促进了肽段与XOD的精准结合;正电荷残基与酶负电荷区域形成静电吸引;氢键、静电吸附和范德华力能够使FVAPFPEMF与XOD结合并形成稳定且紧密的复合物。本研究从水牛乳马苏里拉干酪中分离得到的多肽FVAPFPEMF具有良好的XOD抑制活性,希望研究可为云南特色水牛乳干酪中功能性肽的挖掘、高品质干酪开发及安全温和的降尿酸功能性食品研发提供参考。后续研究可进一步探索FVAPFPEMF的体内降尿酸活性和生物可行性。

参考文献：

[1] Bansal V, Mishra S K. Reduced-sodium cheeses: implications of reducing sodium chloride on cheese quality and safety[J].Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety, 2020,19(2):733-758.

[2] Stocco G, Casali D, Summer A, et al. Effects of animal rennet, fermentation-produced chymosin, and microbial coagulants on bovine milk coagulation properties[J]. Journal of Dairy Science, 2025, 108(5): 4614-4625.

[3] Yang B K, Zhong Z P, Zhang C Q, et al. Identification of novel xanthine oxidase inhibitory peptides from Takifugu obscurus: peptidomic analysis, molecular docking, and dynamics simulation[J]. Food Chemistry, 2025, 472: 142935.

[4] Agarwal V, Hans N, Messerli F H. Effect of allopurinol on blood pressure: a systematic review and meta-analysis[J]. Journal of Clinical Hypertension, 2013, 15(6): 435-442.

[5] 祁丹辉, 史晓雨, 刘新泳, 等. 降尿酸化合物的活性评价方法研究进展[J]. 中国药科大学学报, 2024, 55(2): 167-180.Qi D H, Shi X Y, Liu X Y, et al. Recent advances in bioactivity evaluation methods of uric acid-lowering compounds[J]. Journal of China Pharmaceutical University, 2024, 55(2): 167-180.

[6] 臧薇, 曹荣, 孙国辉, 等. 蛋白核小球藻黄嘌呤氧化酶抑制肽的酶法制备及活性分析[J]. 食品工业科技, 2026, 47(9): 248-257.Zang W, Cao R, Sun G H, et al. Enzymatic preparation and activity analysis of xanthine oxidase inhibitory peptide from Chlorella pyrenoidosa[J]. Science and Technology of Food Industry, 2026, 47(9): 248-257.

[7] He W W, Su G W, Sun-Waterhouse D, et al. In vivo antihyperuricemic and xanthine oxidase inhibitory properties of tuna protein hydrolysates and its isolated fractions[J]. Food Chemistry, 2019, 272: 453-461.

[8] Velarde-Salcedo A J, Barrera-Pacheco A, Lara-González S, et al. In vitro inhibition of dipeptidyl peptidase IV by peptides derived from the hydrolysis of amaranth (Amaranthus hypochondriacus L.) proteins[J]. Food Chemistry, 2013, 136(2): 758-764.

[9] Wei G Q, Wang T, Li Y Y, et al. Identification, structural characterization, and molecular dynamic simulation of ACE inhibitory peptides in whey hydrolysates from Chinese Rushan cheese by-product[J]. Food Chemistry, 2024, 21: 101211.

[10] Jiang C, Liu L, Li X D, et al. Separation and purification of hypocholesterolaemic peptides from whey protein and their stability under simulated gastrointestinal digestion[J]. International Journal of Dairy Technology, 2018, 71(2): 460-468.

[11] Zhang L, Wu G Z, Li D, et al. Isolation and identification of milk-clotting proteases from Prinsepia utilis Royle and its application in cheese processing[J]. Food Research International, 2024, 183: 114225.

[12] 陈姗. 乳酸菌发酵乳中抗氧化肽活性及序列结构的研究[D]. 天津: 天津科技大学, 2018.Chen S. Study on activity and sequence structure of antioxidant peptides in Lactobacillus fermented milk[D]. Tianjin: Tianjin University of Science &Technology, 2018.

[13] von Oesen T, Treblin M, Clawin-Rädecker I, et al. Identification of marker peptides for the whey protein quantification in Edam-type cheese[J]. Foods, 2023, 12(10): 2002.

[14] 常畅, 陈哲漪, 张泓, 等. 裙带菜蛋白黄嘌呤氧化酶抑制肽的酶法制备及作用机制[J]. 食品科学技术学报, 2025, 43(1): 55-62.Chang C, Chen Z Y, Zhang H, et al. Enzymatic preparation and inhibitory mechanism of xanthine oxidase inhibitory peptides from Undaria pinnatifida proteins[J]. Journal of Food Science and Technology, 2025, 43(1): 55-62.

[15] 赵琼. 槟榔江水牛乳清蛋白源活性肽筛选、体外抗炎机制及稳态化研究[D]. 昆明: 云南农业大学, 2023.Zhao Q. Screening of whey protein-derived active peptides from Binglangjiang buffalo, in vitro anti-inflammatory mechanism and stabilization[D]. Kunming: Yunnan Agricultural University, 2023.

[16] 和金泽, 崔浩然, 李钰芳, 等. 中甸牦牛乳酪蛋白源生物活性肽的鉴定及抗氧化活性[J]. 乳业科学与技术, 2024, 47(6): 1-7.He J Z, Cui H R, Li Y F, et al. Identification and antioxidant activity of bioactive peptides derived from Zhongdian yak milk casein[J]. Journal of Dairy Science and Technology, 2024, 47(6): 1-7.

[17] Schiffrin B, Radford S E, Brockwell D J, et al. PyXlinkViewer: a flexible tool for visualization of protein chemical crosslinking data within the PyMOL molecular graphics system[J]. Protein Science, 2020, 29(8): 1851-1857.

[18] Ravindranath P A, Forli S, Goodsell D S, et al. AutoDockFR: advances in protein-ligand docking with explicitly specified binding site flexibility[J]. PLoS Computational Biology, 2015, 11(12): e1004586.

[19] 钟玉旺, 徐万莉, 范尧珠, 等. 辣木籽ACE抑制肽的分离纯化、结构鉴定及其体外活性评价[J]. 食品科学, 2023, 44(24): 118-126.Zhong Y W, Xu W L, Fan Y Z, et al. Isolation, structural identification and in vitro activity evaluation of angiotensin-converting enzyme inhibitory peptides from Moringa oleifera seeds[J]. Food Science, 2023, 44(24): 118-126.

[20] Maier J A, Martinez C, Kasavajhala K, et al. ff14SB: improving the accuracy of protein side chain and backbone parameters from ff99SB[J]. Journal of Chemical Theory and Computation, 2015, 11(8): 3696-3713.

[21] Larini L, Mannella R, Leporini D. Langevin stabilization of molecular-dynamics simulations of polymers by means of quasisymplectic algorithms[J]. The Journal of Chemical Physics, 2007, 126(10): 104101.

[22] Montserrat-de la Paz S, Rivero-Pino F, Villanueva A, et al. Nutritional composition, ultrastructural characteri-zation, and peptidome profile of antioxidant hemp protein hydrolysates[J]. Food Bioscience, 2023, 53: 102561.

[23] 徐紫琪, 王玉珠, 魏光强, 等. 奶疙瘩抗氧化肽、α-葡萄糖苷酶抑制肽的鉴定及其稳定性分析[J]. 食品工业科技, 2025, 46(14): 1-12.Xu Z Q, Wang Y Z, Wei G Q, et al. Identification of antioxidant peptides and α-glucosidase inhibitory peptides from milk pimples and their stability analysis[J]. Science and Technology of Food Industry, 2025, 46(14): 1-12.

[24] Norris R, Casey F, FitzGerald R J, et al. Predictive modelling of angiotensin converting enzyme inhibitory dipeptides[J]. Food Chemistry, 2012, 133(4): 1349-1354.

[25] Wang Y X, Ma M X, Huang Y M, et al. Food-derived bio-functional peptides for the management of hyperuricemia and associated mechanism[J]. Food Science and Human Wellness, 2024, 13(4): 1767-1786.

[26] Gao Y F, Liu M Q, Li Z H, et al. Purification and identification of xanthine oxidase inhibitory peptides from enzymatic hydrolysate of α-lactalbumin and bovine colostrum casein[J]. Food Research International, 2023, 169: 112882.

[27] 叶灏铎, 管晓盛, 马凤, 等. 英红九号茶蛋白降尿酸肽的酶解制备及不同分子量组分的活性对比[J]. 现代食品科技, 2023, 39(3): 147-155.Ye H D, Guan X S, Ma F, et al. Enzymatic preparation of uric acid-lowering peptides from yinghong No.9 tea protein and activity comparison of different molecular weight fractions[J]. Modern Food Science and Techno-logy, 2023, 39(3): 147-155.

[28] 钟婉滢, 苗建银, 叶灏铎, 等. 藜麦蛋白肽的酶解制备及体外降血脂与降尿酸活性研究[J]. 食品工业科技, 2023, 44(23): 156-166.Zhong W Y, Miao J Y, Ye H D, et al. Enzymatic preparation of quinoa protein peptides and their in vitro hypolipidemic and uric acid-lowering activities[J]. Science and Technology of Food Industry, 2023, 44(23): 156-166.

[29] 李晓彤, 胡冠华, 王诗琪, 等. 羊骨生物活性肽体内外降尿酸活性及作用机制[J]. 食品科学, 2025, 46(8): 143-150.Li X T, Hu G H, Wang S Q, et al. Uric acid-lowering activity in vitro and in vivo and mechanism of sheep bone bioactive peptides[J]. Food Science, 2025, 46(8): 143-150.

[30] Khemaissa S, Bauzá A, Lesur É, et al. Hydrophobic and polarized aromatic residues promote internalization of arg-rich cell-penetrating peptides through ionpair-π interactions[J]. Chemistry, 2025, 31(41): e202501138.

[31] Hao L, Tian Q J, Li S Q, et al. Dual anti-hyperuricemic and anti-gout effects of novel peptides: xanthine oxidase inhibition, digestive properties, and TLRs-NF-κB pathway suppression in cellular models[J]. Food Bioscience, 2025, 72: 107488.

[32] Abouelsayed A, El-Bahy G S, Abdelrazzak A B. FTIR spectroscopic investigations of protein conformation provide clues of radioadaptation in the kidney of low-dose irradiated rats[J]. Journal of Molecular Structure, 2024, 1295: 136643.

[33] Tu M L, Wang C, Chen C, et al. Identification of a novel ACE-inhibitory peptide from casein and evaluation of the inhibitory mechanisms[J]. Food Chemistry, 2018, 256: 98-104.

[34] 张南海, 金雨楠, 陈怡冉, 等. 阿魏酸对黄嘌呤氧化酶的抑制机理[J]. 食品科学技术学报, 2023, 41(1): 115-125.Zhang N H, Jin Y N, Chen Y R, et al. Inhibitory mechanism of ferulic acid on xanthine oxidase[J]. Journal of Food Science and Technology China, 2023, 41(1): 115-125.

[35] Hadianamrei R, Tomeh M A, Brown S, et al. Correlation between the secondary structure and surface activity of β-sheet forming cationic amphiphilic peptides and their anticancer activity[J]. Colloids and Surfaces B, Biointerfaces, 2022, 209(Pt 2): 112165.

[36] Tedasen A, Chiabchalard A, Tencomnao T, et al. Anti-melanogenic activity of ethanolic extract from Garcinia atroviridis fruits using in vitro experiments, network pharmacology, molecular docking, and molecular dynamics simulation[J]. Antioxidants, 2024, 13(6): 713.

[37] Liu L Y, Jiao Y, Yang M, et al. Network pharmaco-logy, molecular docking and molecular dynamics to explore the potential immunomodulatory mechanisms of deer antler[J]. International Journal of Molecular Sciences, 2023, 24(12): 10370.

Identification and Screening of Xanthine Oxidase Inhibitory Peptides from Yunnan Distinctive Buffalo Milk Cheese and Their Action Mechanisms

Shi Guoyan1, Zhang Lu1, Shi Li2, Xu Yushan2, Jiang Yan2,*, Wang Xuefeng1,*

(1.College of Food Science and Technology, Yunnan Agricultural University, Kunming 650201, China; 2.Department of Endocrinology, The First Affiliated Hospital of Kunming Medical University, Kunming 650032, China)

Abstract： To screen xanthine oxidase (XOD) inhibitory peptides with high activity and clarify their action mechanisms, water-soluble peptide fractions with good in vitro XOD inhibitory activity from Mozzarella cheese prepared with Yunnan distinctive betel nut buffalo milk were used as raw material. The peptide sequences in the water-soluble peptide fractions were identified by liquid chromatography-tandem mass spectrometry, and the peptides with good XOD inhibitory activity were selected by combining molecular docking binding energy scoring and amino acid composition characteristics. The in vitro XOD inhibitory activity of the peptides was verified by chemical synthesis, and the secondary structures were characterized by infrared spectroscopy. The binding stability and action mechanism of the peptides with XOD were further investigated via molecular docking and molecular dynamics simulation. The results showed that a total of 2 500 peptides were identified from the water-soluble peptide fractions with molecular weight less than 3.0 kDa by mass spectrometry, which were mainly derived from αS1-casein, αS2-casein, β-casein, β-lactoglobulin and κ-casein, among which the peptides with molecular weight less than 1.5 kDa accounted for 62.86%. Three novel XOD inhibitory peptides, FVAPFPEMF, YPFPGPIPK and KFAWPQYLK, were screened out based on the results of active peptide database retrieval, relative content of peptides, biological activity prediction score and molecular docking binding energy, with IC50 of 0.46, 1.15 and 1.18 mg/mL, respectively. Infrared spectroscopy analysis showed that the secondary structures of the three peptides were mainly β-turn and β-sheet, which could enhance the binding efficiency with the XOD active center and interfere with the catalytic conformation of the enzyme. Molecular docking and molecular dynamics simulation analysis showed that the three peptides could bind to XOD active sites through hydrogen bonds and hydrophobic interactions, and FVAPFPEMF could form a more stable complex with XOD. The study aimed to provide a theoretical basis for the development of high value-added buffalo milk cheese and milk-derived uric acid-lowering functional products.

Keywords： buffalo milk Mozzarella cheese; xanthine oxidase inhibitory peptide; liquid chromatography-tandem mass spectrometry; secondary structure;molecular docking;molecular dynamics simulation

doi：10.12301/spxb202500552

文章编号：2095-6002(2026)04-0146-14

引用格式：石国艳,张璐,史丽,等. 云南特色水牛乳干酪黄嘌呤氧化酶抑制肽的鉴定筛选及其作用机制[J]. 食品科学技术学报,2026,44(4):146-159.

Shi Guoyan, Zhang Lu, Shi Li, et al. Identification and screening of xanthine oxidase inhibitory peptides from Yunnan distinctive buffalo milk cheese and their action mechanisms[J]. Journal of Food Science and Technology, 2026,44(4):146-159.

中图分类号： TS252.53; Q516

文献标志码： A

收稿日期： 2025-11-21

基金项目： 国家自然科学基金地区项目(32360562);云南省兴滇英才支持计划青年项目(XDYC-QNRC-2023-0420);云南省代谢性疾病临床医学研究中心科研项目(202505AJ310007);云南省内分泌代谢疾病临床医学中心科研项目(2024YNLCYXZX0069)。

Foundation： Regional Program of National Natural Science Foundation of China (32360562);Yunnan Province Xingdian Talent Support Program Youth Project (XDYC-QNRC-2023-0420);Yunnan Province Clinical Research Center for Metabolic diseases (202505AJ310007);Yunnan Clinical Medical Center for Endocrine and Metabolic Diseases Research Project(2024YNLCYXZX0069).

第一作者： 石国艳,女,硕士研究生,研究方向为食品加工与安全。

*通信作者：

江 艳,女,副主任医师,主要从事代谢相关性脂肪性肝病、脂代谢紊乱、糖尿病方面的研究。E-mail: jyan-6@126.com。

王雪峰,男,教授,博士,主要从事食品蛋白质资源利用与畜产品加工方面的研究。E-mail: 364135728@qq.com。

(责任编辑：张逸群)