膳食纤维(dietary fiber, DF)是指具有抵抗胃肠道消化且不产生能量这一特性的碳水化合物及其类似物的总称[1],被营养学界誉为“第七大营养素”[2],在维持人体肠道健康、调节血糖血脂等方面发挥重要生理功能[3]。淀粉基水溶性膳食纤维主要包括通过化学降解制备的抗性糊精和酶法改性所得的慢消化、抗消化的重构糊精[4],后者是在α-葡聚糖转移酶的催化下,对淀粉分子进行定向结构修饰所获得的一类特殊糊精产品[5]。该过程的反应核心是酶催化作用下淀粉分子中糖苷键(主要为α-1,4和α-1,6键)发生断裂[6]、非天然糖苷键(如α-1,2、α-1,3及α-1,6键等)的重连与引入[7]。这种分子水平上的结构重塑显著增强了其抗消化性[8],可抵抗人体内α-淀粉酶和葡萄糖淀粉酶的水解[9],从而模拟膳食纤维的生理效应[10]。利用GtfB型α-葡聚糖转移酶对淀粉进行酶法改性[11],已成为改善其功能特性[12]、开发新型膳食纤维的提供有效策略[13]。

4,6-α-葡聚糖转移酶(4,6-α-glucosyltransferase,4,6-α-GT)属于糖苷水解酶70(glycoside hydrolase 70,GH70)家族中的GtfB型α-葡聚糖转移酶亚家族[14]。相较于另一亚家族葡聚糖酶[15],GtfB型α-葡聚糖转移酶能够以淀粉为底物[16],通过分子内转苷催化作用[17],转糖基反应得到非天然糖苷键[18],合成重构糊精产物。该酶近年来在淀粉酶法改性中受到关注[19],因其可作用于淀粉或麦芽糊精,引入较高比例的α-1,6键[20],从而形成具有慢消化特性的葡聚糖结构[21]。4,6-α-GT具备底物适用性广[21]、产物结构多样[22]、抗消化组分产率高等优势[23],为新型功能性α-葡聚糖的酶法制备与工业化生产提供关键的技术参考与实践指导[24]。然而目前已鉴定的4,6-α-GT在催化合成重构糊精过程中普遍存在转化效率低、产物得率不理想等问题,限制了其在大规模生产中的应用。因此,开发具有高催化活性且专一性的4,6-α-GT工程酶,既是该领域研究热点,同时又是技术瓶颈。

本研究拟通过多序列比对和关键结构域分析,筛选获得一种新型4,6-α-GT,并对其酶学性质进行分析,建立高效酶法转化体系用于抗消化糊精的制备,并优化催化反应的条件。进一步对所得产物进行全面的理化性质表征与物化性质测定,以期为新型淀粉基水溶性膳食纤维的开发与应用提供理论依据和技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

质粒与菌株:载体pET-24a(+)和Escherichia coli JM109和BL21(DE3),本实验室前期构建与保藏。GT7(4,6-α-GT)基因由安升达(苏州)科技有限公司合成,并连接至pET-24a(+)质粒载体上。

主要试剂:葡萄糖当量(dextrose equivalent, DE) 5-7麦芽糊精(DE5-7麦芽糊精),山东百龙创园生物科技有限公司;糖化酶(A9913)、热稳定α-淀粉酶(A3306)、普鲁兰酶(2 000 U/mL),山东隆科特酶制剂有限公司;直链淀粉、淀粉葡萄糖苷酶(A-7095)、猪胰淀粉酶(P7545,活力8×USP),美国Sigma-Aldrich公司;葡萄糖氧化酶检测试剂盒,上海荣盛生物药业有限公司;镍柱及填料,天地人和有限公司;其他化学试剂,中国国药集团有限公司。

培养基:LB液体培养基为10 g/L NaCl,5 g/L酵母粉,10 g/L蛋白胨。TB液体培养基为24 g/L酵母粉,2.31 g/L KH2PO4,5 g/L甘油,12 g/L蛋白胨,12.54 g/L K2HPO4。

1.2 仪器与设备

1260型高效液相色谱仪,美国Agilent公司;2WAJ系列阿贝折射仪,上海精科仪器有限公司;真空冷冻干燥机,郑州华辰仪器有限公司;恒温培养箱及摇床,上海知楚仪器有限公司;ProFleTM PCR仪、mini Protein Tetra蛋白胶电泳仪、GelDoc-It凝胶成像仪,美国Bio-Rad公司;紫外可见光分光光度计,上海棱光仪器仪表厂;小型台式离心机,德国Eppendorf公司;超声破碎仪,宁波新芝生物科技股份有限公司。AVANCE NEO 600MHz数字NMR,德国布鲁克公司;高效凝胶过滤色谱(配置2414型示差折光检测器),美国沃特世公司。

1.3 实验方法

1.3.1 转移酶的筛选与鉴定

以实验室前期鉴定的Limosilactococcus fermentum NCC3057菌株的GtfB型4,6-α-GT序列(NCBI数据库,序列号:ASA47861.1)作为query序列,在NCBI数据库(https:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/)中通过BLAST搜索查询,在非冗余蛋白序列数据库中选取序列,通过MEGA 7软件中的Clustal W算法中的默认参数对蛋白序列进行比对,采用基于JTT矩阵模型的最大似然法构建系统发育树。再通过关键结构域分析,最终确定Limosilactobacillus fermentum来源推定为GTFB家族的另一个4,6-α-GT(序列号:ASA47866.1)作为研究对象(命名为GT7)。

1.3.2 转移酶的克隆表达与纯化

对GT7编码基因进行大肠杆菌偏好性密码子优化,并通过化学合成法获得。采用一步克隆法将GT7编码基因连接至pET-24a(+)表达载体,转入大肠杆菌JM109感受态细胞,涂布到含有 30 μg/mL卡那霉素的固体平板上,在37 ℃培养箱过夜培养12 h,挑取转化子进行菌落PCR验证,同时测序重组质粒,验证是否成功连接。

实验采用化学转化法将验证无误的重组质粒pET-24a(+)-GT7导入E. coli BL21(DE3)感受态细胞。转化体在含卡那霉素(30 μg/mL)的LB固体平板上于37 ℃培养12 h进行筛选。随机挑取转化子,接入含有相同浓度抗生素的LB液体培养基,在37 ℃、200 r/min条件下预培养10～12 h。然后以5%的接种量转接至TB培养基(含30 μg/mL卡那霉素),在37 ℃、200 r/min培养2 h,随即加入终浓度为0.08 mmol/L的IPTG,并将温度调节至25 ℃以启动目的蛋白的诱导表达。经24 h诱导发酵后,发酵液通过离心(7 000 g,10 min)收集菌体。菌体沉淀用缓冲液重悬,经高压匀浆破碎后,将裂解液于 7 000 g 离心10 min,最终收集的上清液为粗酶液制品。

GT7的C端带有His标签,使用镍柱亲和层析纯化该蛋白。首先使用流动相A液(100 mL的5 mol/L氯化钠和25 mL的1 mol/L Tris-HCl,pH=7.4)平衡Ni-NTA柱,让过膜后的粗酶液缓慢流过柱子,收集流出柱子的液体(流穿液),再使用含有45、60、90、150、210、300 mmol/L咪唑的A溶液进行梯度洗脱,通过SDS-PAGE分析获得正确的洗脱浓度,最后使用30 kDa超滤管进行超滤,使用50 mmol/L磷酸-柠檬酸缓冲液(pH=7.0)进行置换。

1.3.3 转移酶的酶活力的检测与酶学性质的测定

采用直链淀粉-碘染色法测定GT7的总酶活。设置了实验、对照、空白3个组别。取200 μL质量浓度为0.125 g/mL的直链淀粉水溶液(作为底物溶液),分别加入实验组和对照组的1.5 mL离心管中,空白组的离心管则加入200 μL 50 mmol/L磷酸-柠檬酸缓冲液(pH=7.0)。将全部离心管于37 ℃水浴中预热10 min后,向实验管中加入200 μL适当稀释的酶液,对照管和空白管中各加入200 μL缓冲液以替代酶液。准确反应10 min后,立即取200 μL反应液移入含3.8 mL碘显色液的试管中终止反应并进行测定。吸光度值的测定在660 nm波长下进行。一个相对酶活单位(U)被定义:在特定反应条件下,每分钟催化1 mg直链淀粉发生转化所需的酶量。

将最高酶活力定义为100%。最适反应pH值在37 ℃下测定,测定时使用不同pH值的缓冲液来配制直链淀粉底物和稀释纯化后的酶液。pH值为4.0～10.0,其中pH=4.0～8.0,选择磷酸-柠檬酸缓冲液;pH=8.0～9.0,选择Tris-HCl缓冲液;pH=9.0～10.0,选择甘氨酸-氢氧化钠(Gly-NaOH)缓冲液。其中,最适温度在已确定的最适pH条件下进行测定,温度为25～70 ℃。测定时,先将底物于设定温度下预热10 min,再加入适量稀释酶液,并在同一温度下继续反应。

1.3.4 重构糊精的制备与表征

以5 mmol/L磷酸-柠檬酸缓冲液(pH=7.0)为溶剂,配制DE5-7麦芽糊精溶液,经加热促溶后,定容使其终浓度达200 g/L。向反应体系中加入GT7酶以及普鲁兰酶(添加量为30 U/g底物),于37 ℃、150 r/min的摇床中反应18 h。反应结束后,将反应液置于沸水浴中煮沸10 min以终止酶反应,经离心后收集上清液,用于后续分析测定。

1.3.4.1 DF含量的检测

对上清液进行两步酶解:首先在pH值为6.5、温度为95 ℃的条件下,加入0.1 mL热稳定α-淀粉酶反应30 min;冷却后,调整pH至4.5,加入0.3 mL糖化酶,于60 ℃、150 r/min下继续反应30 min。酶解液经沸水浴灭活10 min后,以7 000 g离心10 min,收集上清液并稀释10倍。采用高效液相色谱系统分析样品,色谱条件为Ca型糖分析柱(300 mm×7.7 mm),流动相为超纯水,流速0.5 mL/min,柱温80 ℃,示差折光检测器检测,进样量10 μL。样品中DF的含量即为酶解后残留的三糖及以上聚合度的糖类含量[25]。

1.3.4.2 产物纯化方法

为去除酶解产生的葡萄糖、麦芽糖等副产物,在反应液中加入30 g/L食品级干酵母,30 ℃、200 r/min振荡反应12 h。反应液经沸水浴灭活10 min并冷却后,于7 000 g离心10 min。收集上清液并稀释10倍,经液相色谱验证无副产物峰后,使用布氏漏斗抽滤2～3次至澄清。该澄清液经-80 ℃冷冻后,通过冷冻干燥获得纯化产物。

1.3.4.3 糖苷键比例的测定

利用核磁共振波谱分析样品中的α-1,6-糖苷键比例。精确称取25～30 mg样品,溶于500 μL氘代水中,涡旋混匀后移入核磁管进行检测。测定时以质量浓度为0.03 g/mL三甲基硅烷基丙酸(TMSP)为内标,在NMR仪上记录298 K下样品的一维1H和13C核磁共振波谱,并利用MestReNova软件对波谱图进行处理。其中1H NMR结果显示δ～5.40和δ～4.99的信号分别代表α-1,4和α-1,6糖苷键,通过MestReNova软件积分计算,计算方法见式(1)和式(2)。

w(α-1,6)= δ4.99/(δ5.40+δ4.99)×100% 。

(1)

w(α-1,4)= δ5.40/(δ5.40+δ4.99)×100% 。

(2)

式(1)和式(2)中,δ4.99是1H谱中化学位移为4.95～5.01的积分值,δ5.40是1H谱中化学位移为5.38～5.42的积分值。

1.3.4.4 分子质量分布的测定

采用高效凝胶过滤色谱法测定产物分子质量,色谱柱为UltrahydrogelTM线性柱(300 mm×7.8 mm×2 mm),流动相为0.1 mol/L NaNO3,柱温45 ℃,流速0.9 mL/min,进样量为50 μL,使用示差折光检测器。分子质量标准曲线由右旋糖酐标准品(分子质量2 000、300.6、135.03、9.75、2.7 kDa) 和葡萄糖(分子质量0.18 kDa)校准测定。

1.3.5 重构糊精的物化性质测定

1.3.5.1 溶解度测定

准确称取样品,溶于1 mL去离子水并超声助溶。继续添加样品达到饱和状态,于3 000 r/min转速下离心10 min。取1 mL上清液到已知质量的离心管中,105 ℃烘箱内干燥至恒重,再次称量离心管总质量[26]。根据干燥后沉淀质量与所取上清液体积的比例,计算样品的溶解度。

1.3.5.2 黏度测定

产物的黏度特性通过旋转流变仪进行测定。将样品配制成质量浓度为30 mg/mL的溶液,于流变仪样品台上,分别进行温度扫描和剪切速率扫描测试[27]。考察其在不同温度(20～60 ℃,剪切速率50 s-1)与不同剪切速率(0.1～100 s-1,温度25 ℃)下的黏度变化。所有黏度数据均以mPa·s为单位记录。

1.3.5.3 美拉德反应

将产物配制成质量浓度为10 mg/mL的溶液,加入质量浓度10 g/L甘氨酸后,分别调节溶液pH值为4.0、5.0、6.0,将溶液置于100 ℃水浴中保持60 min,以考察其颜色变化情况,并记录640 nm波长下处理前后吸光度的变化。

1.3.5.4 冻融稳定性测定

将产物配制成质量浓度为30 mg/mL的溶液,分装于透明玻璃管中,经-80 ℃冷冻24 h后于室温条件下自然解冻,测定溶液在640 nm处的吸光度,重复冻融循环5次[28]。

1.3.5.5 储存稳定性测定

将产物配制成50%固形物含量的水溶液,分装于白色透明玻璃瓶,并分别于室温[(25±2)℃]和4 ℃冷藏条件下储存。于储存前两周每日观察样品状态,之后每月观察一次。

1.3.5.6 体外消化分析

参考Wang等[29]的实验方法,使用猪胰淀粉酶(最适pH值为碱性条件)在pH=5.5的条件下测定淀粉类产品的消化性能。将0.1 g的样品溶于5 mL, 0.25 mol/L(pH=5.5)乙酸-乙酸钠缓冲液,37 ℃,160 r/min混匀30 min,然后加入0.83 mL混酶溶液。混酶溶液配制如下,将3 g猪胰淀粉酶与20 mL去离子水充分混匀旋涡振荡5 min,并在3 500 r/min,4 ℃下冷冻离心10 min,取上清15 mL,与1.1 mL淀粉葡萄糖苷酶充分混匀,现配现用,冰浴保存。分别在加入混酶0、20、120 min的时候取200 μL样品到1.8 mL的质量浓度为66.6 mg/mL乙醇终止液中终止反应,12 000 r/min离心5 min,取60 μL上清液用葡萄糖氧化酶试剂盒测定葡萄糖含量。根据式(3)～式(5)快消化淀粉(rapidly digestible starch, RDS)、慢消化淀粉(slowly digestible starch, SDS)和抗性淀粉(resistant starch, RS)组分的比例。

w(RDS)=(G20-G0)×0.9×100% ,

(3)

w(SDS)=(G120-G20)×0.9×100% ,

(4)

w(RS)=100%-w(RDS)-w(SDS) 。

(5)

式(3)～(5)中,G0表示游离葡萄糖质量浓度,mg/mL;G20表示消化20 min后产生的葡萄糖质量浓度,mg/mL;G120表示消化120 min后产生的葡萄糖质量浓度,mg/mL。

1.4 数据处理

使用Microsoft Excel 2016进行所有数据的基础整理与初步统计。为检验不同样品组间的差异是否显著,采用了IBM SPSS Statistics 26.0(美国SPSS公司)进行单因素方差分析(ANOVA)。图表均使用Origin 2025(美国Origin Lab公司)软件绘制完成。

2 结果与分析

2.1 假定4,6-α-GT序列筛选

基于系统发育树(见附录附图1)与多重序列比对(见附录附表表1)分析表明,筛选得到的GT7(ASA47866.1)具备GH70家族[26]的典型特征:含有4个保守基序(Ⅰ-Ⅳ)及7个严格保守的氨基酸残基,4个保守基序(Ⅰ-Ⅳ)构成催化结构域,共同塑造活性中心的几何形状,是结合底物(供体与受体)和完成催化反应的结构基础。其中包括构成催化三联体的残基:作为亲核试剂(NU)的D、作为酸碱催化剂(A/B)的E,以及作为过渡态稳定剂(TS)的D。此外,其部分保守基序(Ⅰ-Ⅳ)呈现较高的序列多样性,提示GT7可能具备新型催化特性的潜力。

2.2 GT7的表达与纯化

收集摇瓶发酵的菌体,通过超声破碎(120 W,10 min,开3 s停2 s)与离心处理制备粗酶液。酶活测定结果显示,每5OD600菌体对应的破壁上清液中GT7酶活力为79.3 U/mL。

对重组菌GT7不同组分的SDS-PAGE分析结果见图1。由图1可知,在约100 kDa处均可见明显条带,与预期重组GT7的分子质量97.23 kDa相符,表明GT7已成功表达。继而采用镍亲和层析对该蛋白进行纯化,SDS-PAGE结果显示,在45 mmol/L咪唑洗脱条件下可获得条带单一且位置正确的目标蛋白。

2.3 GT7的酶学性质鉴定

GT7的酶学性质分析结果见图2。由图2可知,该酶的最适pH值为6.0。在55 ℃时酶活性达到最大值,在50 ℃时仍有80%的相对酶活;但温度超过55 ℃后酶活迅速丧失。酶在最适pH值(pH=6.0)的时候。而且酶在50 ℃的时候,酶活下降很快,在12 h就降为80%,且稳定性不佳;即使GT7在37 ℃的时候相对酶活为70%,但是在72 h内稳定性保持在80%以上,所以还是选择37 ℃进行反应。

2.4 加酶量对重构糊精DF含量的影响

为探究加酶量对重构糊精DF含量的影响,进行了系列酶促反应实验,结果见图3。由图3(a)可知,当加酶量为3 000 U/g时,所得重构糊精的DF含量达到最高值65%;而当加酶量为2 000 U/g时,DF含量为64.2%。考虑到实际工业应用中需兼顾成本与效益,将加酶量控制在2 000 U/g较为适宜。进一步提高加酶量并未导致DF含量显著上升,反而呈下降趋势,推测过量酶促反应可能导致重构糊精发生水解,从而减少DF的积累。

2.5 底物浓度对重构糊精DF含量的影响

为探究GT7制备产物的转化率,设计了底物浓度梯度实验,结果见图3(b)。由图3(b)可知,当底物质量分数为250 g/L时,DF含量最高为65.48%,而在200 g/L时,DF含量为64.51%,但从工业生产的经济性及效率角度综合考虑,底物浓度为200 g/L较为适宜。而且当底物浓度提升至300 g/L时,DF含量下降了,说明出现底物抑制现象,过量底物与酶形成非生产性复合物。

2.6 反应时间对重构糊精DF含量的影响

为探究反应时间对重构糊精DF含量的影响,本研究进行了时间梯度的酶促反应实验,结果如图3(c)所示。随着反应进行,DF含量逐渐上升,在3 000 U/g 的加酶量下,于18 h达到峰值65%。进一步延长反应时间至48 h,DF含量下降至56.8%,表明过度延长反应可能导致重构糊精发生水解,从而引起DF的降解。在反应12 h时DF含量为63.8%,虽略低于最高值,但从工业生产的经济性及效率角度综合考虑,最终确定反应时间为12 h。当加酶量为1 000 U/g时,反应时间延长至36 h,DF含量也达到了64.05%。

2.7 重构糊精的糖苷键比例

采用核磁共振氢谱(1H NMR)与碳谱(13C NMR)对重构糊精产物的分子结构进行表征,结果见图4。由图4可知,通过MestReNova软件积分计算,α-1,6-糖苷键的比例为92%。通过13C NMR分析进一步推断产物结构特征。如图4(c)所示,重构糊精a的13C NMR图谱在化学位移δ76.41、δ74.41、δ73.49、δ72.53和δ63.48处出现5个特征信号,分别对应于C3、C2、C5、C4以及非取代的C6。此外,在δ100.71和δ68.53处产生的信号分别对应于参与α-1,6-糖苷键连接的C1与C6。该谱图特征与右旋糖苷结构高度一致,进一步支持产物以α-1,6糖苷键为主要连接方式,结合13C NMR的结果也可验证α-1,6-糖苷键的比例为92%。综合分析表明,该产物为一种高分子线性糊精,其主链由α-1,6-糖苷键构成,末端连接有少量α-1,4糖苷键。

2.8 重构糊精的分子质量分布及反应途径分析

在优化反应条件下制备得到的重构糊精,其分子质量分布经过高效凝胶渗透色谱分析,结果见图5。由图5可知,产物主要组分的分子质量约为7.6 kDa,而底物DE5-7的麦芽糊精,其分子质量主要分布于180 kDa和2.3 kDa附近。这一结果表明,底物在经过普鲁兰酶脱支后,又在GT7酶的转苷催化下发生了分子链的延长与重排,成功合成了分子质量显著高的重构糊精。而后在最优条件下,将底物更换成DE15-20的麦芽糊精进行实验,所得产物重构糊精b的分子质量降低了一半,但还是高于已表征的Lf3057酶的产物MIMD。

目前所发现的4,6-α-GT酶能够进行两种转糖基反应,一种产物是连续α-1,6键连接的线性产物,例如目前已报道的LrE81在37 ℃反应24 h得到产物α-1,6键为46%,DP值为8[11],Lf3057[30] 的产物SIMD和MIMD产物结构信息见表1,WcMBF8-1 GtfB在37 ℃反应24 h得到产物α-1,6键仅为22%,Mw为3.1 kDa[31];另一种产物是由α-1,4与α-1,6糖苷键共同连接形成的分支化结构产物,比如Lr2613在37 ℃反应72 h得到产物α-1,6键仅为21%,Mw为5.1 kDa[16],LrN1GtfB在37 ℃反应24 h,产物线性α-1,6为5%,分支α-1,4,6为20%,Mw为3.0 kDa[32];可以发现不管是线性还是分支型产物均存在产物分子质量低,α-1,6糖苷键比例低,而且其中在线性产物中,GT7的催化效率产物以及产物的α-1,6糖苷键和分子质量均高于同类酶。基于上述酶重构糊精糖苷键比例分析,可确定GT7催化转糖基产物为连续α-1,6键连接的线性产物,反应过程如图5(c)所示,是一种可高效合成高分子质量线性糊精的酶,其产物重构糊精从分子质量和糖苷键比例上来分析都更具优势。

根据杨卫康[29]的研究可知,GT7催化合成高α-1,6键线性产物的可能结构机制在于GT7通过其独特的蛋白结构实现对催化活性中心的协同优化。该酶在完全保守催化三联体(D, E, D)以执行经典“切割-重组”反应的基础上,其结构显著强化了活性中心对受体糖环的特异性结合与精确空间定向。与已表征的同源分泌型酶Lf3057相比,GT7能够更稳定地结合并持续延伸葡聚糖链,有效延缓产物解离,从而合成分子质量更高、α-1,6糖苷键比例更高的线性葡聚糖。这表明,在GH70家族GtfB亚家族中,催化核心虽保守,但非催化结构域(如特定的结合域与锚定域)的差异是驱动产物结构多样化与催化性能优化的决定性因素。

2.9 重构糊精的物化性质分析

在本研究中,经纯化获得的重构糊精在常温下呈淡黄色粉末状。重构糊精的理化性质对其加工、储存及实际应用具有重要影响。为此,本研究选择DE5-7的麦芽糊精作为对照,系统分析了所制备重构糊精的多项理化特性。

2.9.1 溶解度分析

溶解度反映了淀粉颗粒在水中的溶解能力,即淀粉分子从有序颗粒结构向水相中解离并分散的程度。一般而言,高溶解度的淀粉会释放出更多直链淀粉,从而显著影响面制品的黏度、质构及口感等品质属性。本研究比较了DE5-7麦芽糊精与重构糊精的溶解度,结果见表2。由表2可知,重构糊精的溶解度与DE5-7麦芽糊精的接近,表明两者在水中形成均匀分散体系的能力较为接近。而对线性糊精的研究指出,由于其较高的聚合度,通常表现出较差的水溶解性[33]。这为高分子质量物质普遍存在的溶剂化障碍提供了直接证据。

2.9.2 黏度分析

黏度是衡量流体抵抗流动能力的重要物理参数。对于淀粉及其衍生物而言,黏度会直接影响淀粉在各类应用中的功能表现、体系稳定性以及最终产品的品质。本研究分别考察了DE5-7麦芽糊精与重构糊精的黏度随剪切速率和温度的变化关系。结果见图6。由图6可知,两种样品均表现出典型的“剪切变稀”和“热变稀”行为,即表观黏度随剪切速率升高或温度上升而呈现下降趋势。在25 ℃、剪切速率50 s-1条件下,DE5-7麦芽糊精的黏度为32.32 mPa·s,而重构糊精的黏度为14.7 mPa·s。 这为淀粉黏度的深入理解与精确调控提供了案例,也是食品工业中新产品开发、工艺优化与产品质量控制的重要基础。产物呈现低黏度其根本机理在于,线性α-1,6糖苷键赋予分子链高度的柔性与卷曲构象,导致其在水溶液中的流体力学半径较小,因而特性黏度较低[34]。本研究产物的α-1,6键比例更高,这一构象效应更为显著,从而解释了其独特的流变性质。

2.9.3 美拉德反应结果

美拉德反应是氨基酸与还原糖反应产生色泽与风味物质的过程,是食品加工过程中至关重要的化学反应之一,可赋予食品独特的气味、滋味和色泽。为了明确重构糊精在该反应中的行为,本研究将质量浓度为10 mg/mL的DE5-7麦芽糊精,葡萄糖和重构糊精分别进行了美拉德反应,同时分别测定了其在反应前后的OD640下的吸光值,结果见图7和表3。由图7和表3可知,在pH=4.0和5.0的条件下,DE5-7麦芽糊精,葡萄糖和重构糊精均保持很好的透明度;但在pH=6.0条件下,葡萄糖和重构糊精发生了美拉德反应,相比之下,重构糊精的颜色变化更为明显,这为风味增强剂和天然着色剂在食品工业中的应用提供了新思路。重构糊精和底物麦芽糊精的由于分子质量很高均不易发生美拉德反应,这与Li等[35]的研究结论高分子质量糖类发生美拉德反应的活性很低一致。

2.9.4 冻融稳定性分析

在食品工业中,冻融稳定性好的食品可以防止冷冻食品内部结构因温度变化而被破坏,延长食品的货架期;而且食品的冻融稳定性对其在贮藏与运输过程中品质变化有重要意义。本研究将质量浓度为30 mg/mL的DE5-7麦芽糊精和重构糊精溶液放进-80 ℃冰箱里进行反复冷冻,通过观察吸光值的变化以探究其冻融稳定性,结果见图8。由图8可知,DE5-7麦芽糊精在第2次冻融后吸光度值显著升高,随后趋缓;相比之下,重构糊精在前两次冻融过程中表现出较好的稳定性,自第3次开始吸光度值缓慢上升,但其增幅仍明显低于DE5-7麦芽糊精。结果表明重构糊精的冻融稳定性相对较高,但在超过3次冻融后可能出现结构变化,提示其在冷冻食品应用中存在一定限制。本研究发现高α-1,6键产物冻融稳定性与Yasuda等[36]的研究结论一致。酶催化淀粉分子链重构α-1,6键,产物呈现“右旋糖酐”结构,使其具有良好的冻融稳定性。这为“线性α-1,6键可赋予糊精优异冻融稳定性”提供了强有力的文献支持。

2.9.5 储存稳定性分析

淀粉的储存稳定性在食品工业及消费者体验等多个方面具有重要意义。良好的储存稳定性有助于显著延长产品的货架期与最佳食用期,并有效维持产品的新鲜度与品质一致性。为评估所制备样品的稳定性,本研究将高浓度的DE5-7麦芽糊精与重构糊精溶液分别置于室温及4 ℃条件下进行储存观察,结果见图9。由图9可知,两种样品在室温和4 ℃条件下均于6 h内发生凝固现象,表明其高浓度溶液在实际储存中稳定性较差。低分子质量的碳水化合物能够抑制糊精的回生[36],而重构糊精的高分子质量导致其极易回生。因此,为提高储存可行性,建议将此类物料以冻干固体形式保存。

2.9.6 重构糊精的体外消化特性分析

体外消化特性作为食品健康评价与功能性食品开发中的关键指标,在连接成分分析与实际生理效应之间扮演着重要角色。本研究参考文献[28]的方法,使用猪胰淀粉酶在pH=5.5的条件下,测定了重构糊精的消化特性。以DE5-7麦芽糊精为对照,对重构糊精的体外抗消化性能进行了测定,结果见表4。由表4可知,重构糊精的快速消化淀粉(RDS)含量显著降低至11.54%,同时,其慢消化淀粉(SDS)含量由9.6%略提升至15.45%,而抗性淀粉(RS)含量则显著提高,达到73.01%。可见,酶法改性显著提升了重构糊精的抗消化性,其中RS的大幅提升是主要贡献因素,体现出良好的膳食纤维特性。但是,猪胰淀粉酶最适宜环境为碱性环境,可能对淀粉的消化特性模拟环境欠准确,未来实验考虑使用自然采集肠液或者人工模拟肠液作为反应体系。

3 结 论

本研究筛选并鉴定了1种Limosilactobacillus fermentum来源的新型4,6-α-GT(GT7),该酶属于典型的GtfB亚家族,能够以淀粉为底物高效合成以α-1,6-糖苷键为主链的高分子质量线性重构糊精,这一发现可拓展GtfB亚家族酶的产物结构多样性,为其添加新的高分子线性多糖合成范例。重构糊精具备优良的溶解性、低黏度及显著抗消化特性,显示出作为功能性膳食纤维的应用潜力,不仅在食品工业中可作为稳定剂和膳食纤维功能配料,更在定制化多糖材料、益生元开发及血糖管理食品中显示出广阔的应用潜力。值得强调的是,重构糊精的高分子质量不仅证明4,6-α-GT酶在构建大分子葡聚糖方面的有效性,也为今后制备具有特定结构和功能性质的大分子重构糊精提供了新策略。大分子重构糊精因其独特的流变特性及在食品、医药载体材料等领域的应用潜力,具有重要的研究价值和开发前景。因此,GT7酶不仅为糖酶催化机制研究提供了新案例,也为定向合成功能明确的葡聚糖产品提供了有价值的酶工具。目前该酶仅在大肠杆菌中实现表达,而大肠杆菌的细胞壁组分中含有内毒素,限制了其在食品工业中的应用;同时也考虑到酶的发酵制备水平是决定其规模放大和工业化应用成本与可行性的关键因素,后续可将该酶转入食品级安全菌株枯草芽孢杆菌中进行异源表达,以推动该类酶的实际应用。

附录:补充数据

与本文相关的补充数据可以在http:∥dx.doi.org/10.12301/spxb202500547在线版本中找到。

Appendix:supplementary data

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Study on Characteristics of Catalytic Products of 4,6-α-Glucantransferase from Limosilactobacillus fermentum

Yan Si’e, Chen Sheng*, Xia Wei*

(School of Biotechnology/Key Laboratory of Industrial Biotechnology, Ministry of Education/National Key Laboratory of Food Science and Resource Development, Jiangnan University, Wuxi 214122, China)

Abstract： Modifying the molecular structure of dextrin can yield reconstituted dextrin products with different digestive properties, including slow-digesting dextrin and resistant dextrin, which are important starch-based water-soluble dietary fibers (DF). 4,6-α-glucan transferase can use starch as a substrate and catalyze the synthesis of resistant dextrin through a transglycosylation reaction. However, the currently identified enzymes of this type generally had low conversion efficiency and unsatisfactory product yield during the catalytic process, which limited their industrial application. A 4,6-α-glucan transferase (GT7) from Limosilactobacillus fermentum was screened and successfully heterologously expressed in Escherichia coli. Subsequently, it was applied to the industrial preparation of resistant dextrin, and the properties of the reconstituted dextrin were identified and systematically analyzed. The results showed that the recombinant strain Escherichia coli BL21(DE3)/pET-24a(+)-GT7 produced an enzyme with activity of 79.3 U/mL. After optimizing the process conditions, with an enzyme dosage of 3 000 U/g and a reaction time of 18 h, high-performance liquid chromatography detection showed that the relative peak area of DF in the reconstituted dextrin sample reached 65%. The average molecular weight of the reconstituted dextrin was 7.6 kDa, and the proportion of α-1,6-glycosidic bonds was 92%. The reconstituted dextrin sample was a high-molecular-weight linear dextrin, with the glucan chains mainly connected by α-1,6-glycosidic bonds and a small amount of structures connected by α-1,4-glycosidic bonds at the chain ends. The solubility of the reconstituted dextrin sample was 70.5 g/100 mL, and the viscosity was 14.7 mPa·s. It had Maillard reaction ability and good freeze-thaw stability (freeze-thaw cycles ≤3), as well as high storage stability. In vitro anti-digestion experiments showed that the resistant starch content in the reconstituted dextrin sample was 73.01%. It was hoped that this research could provide technical support for the screening and efficient expression of 4,6-α-glucan transferase, and the industrial preparation and property evaluation of resistant dextrin.

Keywords： 4,6-α-glucan transferase; reconstituted dextrin; dietary fiber; resistant starch; α-1,6-glycosidic bond

doi：10.12301/spxb202500547

文章编号：2095-6002(2026)04-0132-14

引用格式：颜四娥, 陈晟,夏伟. Limosilactobacillus fermentum来源4,6-α-葡聚糖转移酶催化产物特性研究[J]. 食品科学技术学报,2026,44(4):132-145.

Yan Si’e, Chen Sheng, Xia Wei. Study on characteristics of catalytic products of 4,6-α-glucantransferase from Limosilactobacillus fermentum[J]. Journal of Food Science and Technology, 2026,44(4):132-145.

中图分类号： TS236.9

文献标志码： A

收稿日期： 2025-11-19

基金项目： 国家重点研发计划项目(2024YFF1106300); 国家自然科学基金重点项目(32430081)。

Foundation： National Key Research and Development Program of China (2024YFF1106300); National Natural Science Foundation of China (32430081).

第一作者： 颜四娥,女,硕士研究生,研究方向为功能糖的酶法制备。

*通信作者：

陈 晟,女,教授,博士,主要从事发酵工程方面的研究。E-mail: chensheng@jiangnan.edu.cn。

夏 伟,男,副研究员,博士,主要从事功能糖生物制造方面的研究。E-mail: weixia@jiangnan.edu.cn。

(责任编辑：李 宁)