三油酸甘油酯(glycerol trioleate,TAG)是由3分子油酸与甘油分子的3个羟基酯化形成的对称型三酰甘油。作为典型的非极性中性脂质,TAG兼具良好的化学稳定性、优异的润滑性能与优良的生物相容性,因而在食品与化妆品领域被广泛用作润滑剂、增溶剂及润肤剂[1];在医药领域,TAG亦可作为药物载体与药用辅料使用,因此,TAG在多个工业领域均展现出广阔的应用前景[1-2]。

目前,TAG的制备方法主要包括化学法和酶法两大类[3],其中化学法应用较为普遍。化学法虽然反应速度快,但存在明显缺陷:高温反应条件易导致产物色泽加深,且常伴随对甲苯磺酸、浓硫酸等催化剂残留问题[4-5];反应过程中易发生顺反异构化,造成成品中反式脂肪酸含量超标;此外,产物组成复杂,后续纯化工艺繁琐[6]。相比之下,酶法催化反应具有选择性高、副产物少等优点,更易得到高纯度的TAG产品,符合化工绿色转型的发展趋势[3-7]。

酶法合成TAG的核心在于脂肪酶的选择。目前,已有研究采用诺维信435(Novozym435)脂肪酶催化合成TAG,该酶催化效率高、耐热性良好,已成为工业酶法合成甘油酯的重要选择[8]。然而,较高的酶制剂成本限制了其在甘油酯生产中的应用。此外,工业反应环境常伴随高温、高压等极端条件,开发耐高温、适应苛刻工业环境的高催化性能、耐热脂肪酶,对推进酶法工艺国产化替代具有重要意义。

目前,国内已有学者对耐热脂肪酶进行了挖掘表征。Wang等[9]通过数据驱动挖掘方法从荧光假单胞菌HK44 中发现了一种天然的耐热脂肪酶PFHL。该酶在60 ℃下表现出最适活性,pH值为7.0条件下半衰期为2.52 h,在90 ℃高温下仍能保持48.23%的相对活性。Qin等[10]从超高温堆肥中分离的嗜热菌株Geobacillus thermoleovorans H9中发现了一种新的天然耐热脂肪酶LipGt6。该酶最适反应温度为50 ℃,最适pH值为9.0,在70 ℃下表现出良好的热稳定性。Li等[11]通过宏基因组功能筛选从堆肥土壤中发现了一种天然的耐热碱性脂肪酶Lip54q。该酶属于脂解酶第Ⅷ家族,分子量约48.33 kDa,具有良好的碱性耐受性和温度耐受性,在高碱性环境(pH值为10.0～11.0)和30～60 ℃温度范围内表现出优异的稳定性,对多种表面活性剂具有强耐受性。尽管国内在耐热脂肪酶研究方面已有所突破,但脂肪酶在热稳定性、底物特异性等方面各有局限,因此仍有必要继续挖掘新的耐热脂肪酶。项目组前期从米糠中挖掘出了一种耐热脂肪酶RBL-LC6,经异源表达和纯化后表征了其酶学性质。该酶的最适水解反应温度为100～120 ℃,在90 ℃下孵育30 min仍能保持50%以上的活性,具有良好的耐热性;最适水解反应pH值为10.0,在pH值为10.0的条件下处理1 h后仍保留92.48%的酶活性,表现出良好的耐碱性[12]。因此,其可能具备在高温合成TAG的应用潜力。

本研究拟采用重组米糠耐热脂肪酶RBL-LC6催化油酸与甘油合成TAG,系统考察反应时间、反应温度、体系含水质量分数、体系含酶质量分数和底物物质的量之比对合成效率的影响,并进一步对酶促反应动力学机制进行解析。希望研究结果可为高温条件下TAG的绿色酶法合成提供理论依据与技术支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

LB肉汤培养基、Tris缓冲液、油酸、甘油、异丙基-β-D-1-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranoside,IPTG)、棕榈酸对硝基苯酯(p-nitrophenyl palmitate,pNPP),上海源叶生物科技有限公司。单油酸甘油酯标准品(glyceryl monooleate,MAG,分析纯)、1,2-二油酸甘油酯标准品(1,2-glyceryl dioleate,1,2-DAG,分析纯)、1,3二油酸甘油酯标准品(1,3-glyceryl dioleate,1,3-DAG,分析纯)、三油酸甘油酯标准品(glycerol trioleate,TAG,分析纯)、正己烷(色谱纯)、异丙醇(色谱纯)、甲酸(色谱纯),上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.2 仪器与设备

THZ-103B型恒温培养摇床,上海一恒科学仪器有限公司;SCIENTZ-ⅡD型超声波细胞粉碎机,宁波新芝生物科技股份有限公司;Unique AutoPure 100型蛋白质纯化仪,苏州英赛斯智能科技有限公司;Tecan GENios型酶标仪,瑞士帝肯集团有限公司;Thermo Scientific UltiMate 3000型高效液相色谱仪[配置Thermo Scientific Syncronis Silica型液相色谱柱(250 mm×4.6 mm×5 μm)],赛默飞世尔科技(中国)有限公司;SCIENTZ-10N/C型冷冻干燥机,宁波新芝生物科技股份有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 重组米糠耐热脂肪酶RBL-LC6的制备

RBL-LC6催化合成TAG的方法参照参考文献[17]的报道,前期课题组已从米糠中筛选获得耐热脂肪酶RBL-LC6,经重组表达后获得该酶的工程表达菌株。取100 μL上述菌株接种于2 mL含0.1 mg/mL氨苄青霉素的LB培养基的试管中,将试管放于37 ℃条件下,200 r/min活化4 h;取32 μL活化菌液与990 μL 0.1 mg/mL氨苄青霉素的LB培养基在试管中混匀;再吸取32 μL活化菌液与500 mL 0.1 mg/mL氨苄青霉素的LB培养基在锥形瓶中混匀,于37 ℃条件下,200 r/min培养16 h至OD600=1.0～1.5;随后,向菌液中加入500 μL 0.1 mg/mL的IPTG诱导表达,于37 ℃条件下,200 r/min 培养4 h后,在7 000 r/min条件下离心3 min,收集沉淀,即为菌体。向收集得到的菌体中加入Tris-HCl(pH=7.4)缓冲液,涡旋振荡均匀,在 200 W超声条件下破碎5 min,收集上清液;利用MBP亲和层析柱对上清液中的目的蛋白进行分离纯化,随后使用 Tris-HCl(pH=7.4)缓冲液于 4 ℃透析过夜,收集透析液用 10 kDa 超滤管进行过滤,得到的分子量大于10 kDa的物质即为重组米糠耐热脂肪酶(RBL-LC6);将所得酶液分装于冻干瓶中,置于冷冻干燥机中,先预冻至-80 ℃,再在真空度20 Pa、冷阱温度-80 ℃条件下冷冻干燥36 h至恒重,收集冻干酶粉,于4 ℃密封保存备用。

使用pNPP法测定酶活。使用Tris-HCl(pH=7.4)配制5 mmol/L底物工作液(pNPP),并定义在100 ℃ pH=7.4的条件下每分钟每毫升底物溶液生成1 μmol对硝基苯酚为1个酶活单位。经测定,重组米糠耐热脂肪酶RBL-LC6的酶活为 0.30 U/g。

1.3.2 三油酸甘油酯的合成

RBL-LC6催化合成三油酸甘油酯的酯化反应方法参考文献[13-14],并略加修改。

初始投料为0.98 g甘油和9.02 g油酸(即甘油与油酸的物质的量之比为1∶3),随后根据所需底物物质的量之比调整甘油与油酸的质量,但保持总质量为10 g不变,反应混合物通过水浴锅维持设定温度。加入40 mg(1.20×10-2 U)冻干酶粉后,添加100 μL超纯水使体系含水质量分数为1%。反应容器密封后置于恒温水浴中,并以磁力搅拌进行反应。每小时取样一次,取样体积小于反应总体积的1%,且尽量避免吸出酶粉,以确保取样过程不影响反应进程。

1.3.3 酯化反应产物的分析

酯化反应产物通过高效液相色谱法进行分析,具体方法参照文献[15]。称取50 μL产物于离心管中,加入20 mg无水硫酸钠去除水分,然后加入1 mL正己烷,涡旋混合30 s,离心分离取上清液500 μL,通过高效液相色谱方法分析产物,采用Thermo Scientific Syncronis Silica型液相色谱柱(250 mm×4.6 mm×5 μm)进行分离,检测器为折射率检测器(RID),柱温箱温度为30 ℃,流动相为V(正己烷)∶V(异丙醇)∶V(甲酸)=21∶1∶0.003,进样量为10 μL,流速为1 mL/min。TAG、1,2-DAG、1,3-DAG、MAG的产率按照式(1)～式(4)计算。

TAG产率=

(1)

1,2-DAG产率=

(2)

1,3-DAG产率=

(3)

MAG产率=

(4)

式(1)～式(4)中,AMAG表示产物中单油酸甘油酯的高效液相色谱峰面积;A1,2-DAG表示产物中1,2-二油酸甘油酯的高效液相色谱峰面积;A1,3-DAG表示产物中1,3-二油酸甘油酯的高效液相色谱峰面积;ATAG表示产物中三油酸甘油酯的高效液相色谱峰面积;AGLY表示产物中甘油的高效液相色谱峰面积。

1.3.4 不同温度下反应产物类型的分析

称取0.98 g甘油和9.02 g油酸(甘油与油酸的物质的量之比为1∶3)于烧杯中,使用水浴锅将混合物维持在所需温度(30～90 ℃)15 min。加入RBL-LC6冻干酶粉使体系中脂肪酶的质量分数为0.4%(1.20×10-2 U),随后将烧杯置于水浴磁力搅拌锅中,调整转速为220 r/min,分别设置水浴温度为30、40、50、60、70、80、90 ℃,反应8 h后取样。

配制MAG、1,2-DAG、1,3-DAG、TAG标准品正己烷溶液,通过外标法对RBL-LC6催化油酸与甘油的酯化产物类型和含量进行检测,方法参照1.3.3节所述方法。

1.3.5 酯化反应条件的优化

通过对反应时间、反应温度、体系含水质量分数、体系含酶质量分数、底物物质的量之比5个影响因素的单因素实验,优化酯化反应条件。

1.3.5.1 反应时间的影响

称取0.98 g甘油和9.02 g油酸(甘油与油酸的物质的量之比为1∶3)于烧杯中,使用水浴锅将混合物维持在80 ℃保温15 min。加入RBL-LC6冻干酶粉使体系中脂肪酶的质量分数为0.4%(1.20×10-2 U),随后将烧杯置于水浴磁力搅拌锅中,调整转速为220 r/min。设置水浴温度为80 ℃,反应14 h,每隔一小时取样测定TAG产率。

1.3.5.2 反应温度的影响

称取0.98 g甘油和9.02 g油酸(甘油与油酸的物质的量之比为1∶3)于烧杯中,使用水浴锅将混合物维持在所需温度(40～90 ℃)15 min。加入RBL-LC6冻干酶粉使体系中脂肪酶的质量分数为0.4%(1.20×10-2 U),随后将烧杯置于水浴磁力搅拌锅中,调整转速为220 r/min,分别设置水浴温度为40、50、60、70、80、90 ℃,反应时间为9 h,每隔一小时取样测定TAG产率。

1.3.5.3 体系含水质量分数的影响

称取0.98 g甘油和9.02 g油酸(甘油与油酸的物质的量之比为1∶3)于烧杯中,于烘箱中放置2 h进行干燥处理,随后使用水浴锅将混合物维持在80 ℃保温15 min。加入RBL-LC6冻干酶粉使体系中脂肪酶的质量分数为0.4%后,分别加入质量分数为总反应体系质量0.5%、1.0%、1.5%、2.0%的超纯水,随后将烧杯置于水浴磁力搅拌锅中,调整转速为220 r/min。设置水浴温度为80 ℃,反应6 h后取样测定TAG产率。

1.3.5.4 体系含酶质量分数的影响

称取0.98 g甘油和9.02 g油酸(甘油与油酸的物质的量之比为1∶3)于烧杯中,使用水浴锅将混合物维持在80 ℃保温15 min。分别加入质量分数为总反应体系质量0.1%(2.96×10-3 U)、0.2%(5.92×10-3 U)、0.3%(8.88×10-3 U)、0.4%的(1.20×10-2 U)的脂肪酶后,加入质量分数1.0%超纯水,随后将烧杯置于水浴磁力搅拌锅中,调整转速为220 r/min。设置水浴温度为80 ℃,反应时间为9 h,每隔一小时取样测定TAG产率。

1.3.5.5 底物物质的量之比的影响

称取不同底物物质的量之比的甘油和油酸(1∶1、1∶1.5、1∶2、1∶2.5、1∶3、1∶3.5、1∶4、1∶4.5、1∶5),加入质量分数为总反应体系质量0.4%(1.20×10-2 U)的脂肪酶后加入1.0%超纯水,随后将烧杯置于水浴磁力搅拌锅中,调整转速为220 r/min。设置水浴温度为80 ℃,反应时间为10 h,每隔一小时取样测定TAG产率。

1.3.6 RBL-LC6酶促反应动力学分析

在单因素实验的基础上,交替改变2种反应物的物质的量浓度来计算初始反应速率,将所得数据分别代入Ordered Bi-Bi、Random Bi-Bi、Ping-Pong Bi-Bi 3个不同的模型中进行拟合[16]。

1.4 数据处理

每组实验重复进行3次,采用Origin 2021和SPSS 20.0软件分析作图,其中P<0.05表示为差异显著。

2 结果与分析

2.1 温度对RBL-LC6催化油酸与甘油酯化产物类型的影响

脂肪酶催化油酸与甘油的酯化产物有多种类型,包含MAG、1,2-DAG、1,3-DAG、TAG;产物的含量受酶催化性能和反应温度影响。利用外标法对不同温度下RBL-LC6催化油酸与甘油的酯化产物类型和产率进行检测,结果见表1。由表1可见,反应温度在30～50 ℃时,在终产物中未检测到MAG;而随着反应温度的升高,MAG的产率逐渐上升。提高温度促进MAG生成的原因可能是高温下加剧了油酸分子的热运动,使其难以与甘油剩余羟基发生酯化反应,从而促进了MAG的生成[16]。对于2种DAG(1,2-/1,3-二油酸甘油酯),在所选温度条件下均能检测到1,2-DAG的生成,且随着温度升高,其产率逐渐提高;而1,3-DAG只能在60 ℃以下被检测到,且其产率远低于1,2-DAG和TAG。这一现象与已发表的结果相似[17-19]。Mao等[19]发现,sn-1,3-二月桂酰甘油(sn-1,3-LDAG)和sn-1,3-二棕榈酰甘油(sn-1,3-PDAG)的酰基迁移发生在100 ℃以上的温度下,而sn-1,3-PDAG即使在60 ℃条件下储存3 h后也不会发生变化。相比之下,高油酸葵花籽油基sn-1,2DAG很容易在60 ℃条件下转化为其他物质[20]。其原因为甘油的C1位(伯羟基)被占据后,油酸分子进攻C3位(伯羟基)的空间位阻较C2位(仲羟基)更小,因此,更易形成1,3-DAG;而反应温度升高引起的分子热运动又加剧了空间位阻对油酸进攻选择性的影响,使得油酸分子更难定位到空间受阻大的C2位上[21]。同时,酯化的过程是可逆的,高温脱水推动平衡右移,但2种DAG的比例由热力学稳定性决定,1,3-DAG因为两个长链间距大,位阻小,热力学更稳定,故高温下能够成为两者之间产率较高的优势产物,甚至是唯一产物[3]。相比于MAG和DAG,TAG在反应温度50 ℃后成为了产率最高的优势产物,达36.36%,进一步提高温度,其产率虽逐渐增加,但趋势渐缓,80 ℃后达到最大产率为48.04%,继续提高温度,生成的TAG产率并无显著差异。然而,高温同样引起了MAG和1,2-DAG含量的富集,产物的总产率显著提高,但TAG的相对产率则在降低。

表1 反应温度对酯化反应产物的影响

Tab.1 Effect of reaction temperature on esterification products %

反应温度/℃MAG产率/%1,2-DAG产率/%1,3-DAG 产率/%TAG产率/%30—0.84±0.640.56±0.491.47±1.3140—7.26±0.682.24±1.074.52±1.2150—12.68±1.092.62±1.3636.36±2.61603.58±0.7413.37±0.333.43±0.9641.35±0.44708.30±1.1214.72±1.03—46.28±1.468012.01±0.7515.15±0.57—48.04±1.949014.97±2.6014.74±1.16—46.00±2.96

—表示未检出。

因此,RBL-LC6脂肪酶高温下更易催化生成TAG;80 ℃下,TAG产率达48.04%。后续将进一步对RBL-LC6催化合成TAG的条件进行优化。

2.2 RBL-LC6催化合成TAG反应条件的优化

脂肪酶催化酯化反应过程中,反应时间、反应温度、体系含水质量分数、体系含酶质量分数和底物物质的量之比会影响产物的富集,因此,需进一步优化反应因素,以提升RBL-LC6催化合成TAG的产率。

2.2.1 反应时间的影响

不同反应时间下酯化反应产物中TAG产率的变化见图1。由图1可见,RBL-LC6催化合成TAG的产率呈先增加后稳定的趋势,在0～6 h内TAG产率持续增加;6 h时,其产率达44.92%。继续延长时间,TAG产率最大提高到45.25%,但与6 h数值无显著差异。在反应初始阶段(6 h内),由于底物充足且产物积累量少,反应平衡向生成产物的方向移动,促使TAG快速合成。随着反应持续进行,TAG积累至一定浓度,底物逐渐消耗殆尽,产物抑制作用增强,最终导致反应达到平衡状态。Kuperkar等[22]使用脂肪酶Novozym435将丙酸与异丁醇酯化合成丙酸异丁酯,在8 h内,产物迅速增加,超过8 h后,反应达到平衡,产物无显著变化,与本研究结果相符。因此,确定6 h为RBL-LC6催化TAG合成最适宜反应时间。

图1 反应时间对酯化反应产物中TAG产率的影响

Fig.1 Effect of reaction time on TAG yield in esterification products

2.2.2 反应温度的影响

反应温度是限制酯化反应速率的关键因素[23],根据Arrhenius方程,提高温度可以提高底物分子的动能,增加它们与酶分子的碰撞频率,从而加快反应速率。然而,反应温度的升高虽会增加反应速率,但酶的稳定性可能也会受到影响,甚至发生不可逆变性,因此,优化反应温度对于酶催化反应具有重要意义。

反应连续进行9 h,考察不同反应温度下酯化产物中TAG产率的变化规律,结果如图2所示。由图2可见,随着温度的升高,反应达到平衡的时间逐渐缩短,从7 h(50 ℃)降低至4 h(90 ℃),产物TAG的产率也逐渐增加,从39.21%(50 ℃)提高至49.27%(80 ℃);较高的温度有助于提高酶分子的构象柔性,从而有利于催化循环的顺利进行。同时,温度升高增加了酶-底物复合物形成的速率,提高了催化转化效率。值得注意的是,40 ℃条件下TAG产率较低,且随时间延长几乎保持不变,这可能与RBL-LC6催化TAG合成需要高温激活有关,温度过低,RBL-LC6的酶分子构象柔性较差,活性位点与底物结合受限,影响了催化反应的进行。而提高温度,可以降低反应体系黏度,改善两相底物的混溶性和界面接触效率;同时,高温增强了底物分子的热运动,提高了有效碰撞频率,促进了酶-底物复合物的形成,从而促进底物传质效率[24]。此外,在90 ℃条件下,最终生成TAG 产率为48.37%,尽管该温度下反应达到最大值的时间有所缩短,但其最终产率低于80 ℃条件下的结果(49.27%)。这一现象可能与过高温度导致酶分子氢键和疏水相互作用减弱,引起酶分子二级和三级结构的部分展开,导致活性位点几何构型发生改变,从而影响了底物结合的特异性和催化效率有关[25],降低了目标产物的产率。因此,确定80 ℃为RBL-LC6催化TAG合成的最适宜反应温度。

图2 反应温度对酯化反应产物中TAG产率的影响

Fig.2 Effect of reaction temperature on TAG yield in esterification products

2.2.3 体系含水质量分数的影响

脂肪酶在催化酯化反应时,微量水的存在能够维持脂肪酶三级结构的稳定性,从而保证其拥有更优的催化活性;而水作为酯化反应的产物,向体系中额外引入水分会形成产物抑制从而影响反应的平衡[26]。因此,体系中存在适量的水对于保障催化效率具有重要作用。

在反应连续进行6 h后,考察不同体系含水质量分数下酯化产物中TAG产率的变化规律,结果如图3所示。由图3可见,随着体系含水质量分数的增大,TAG的产率呈现先增大后减小的趋势,其中1.0%的体系含水质量分数效果最优,较对照组,其TAG产率增加2.05%。这一结果揭示了水分子在酶催化酯化反应中的双重调控作用,当体系含水质量分数低于1.0%时,水分含量的增加对反应具有显著的促进效应。作为界面活性酶,脂肪酶的催化功能高度依赖活性位点的构象稳定性,而这需要适度的水化层予以维持。本研究中,1.0%的体系含水质量分数恰好能为RBL-LC6提供最优的微水环境,保障其三维结构的完整性与活性中心的正确构象,从而最大限度地发挥催化效果[27]。然而,当体系含水质量分数超过1.0%后,水分的抑制作用开始占主导,导致TAG产率显著下降,这可从热力学与动力学层面得到合理解释。从热力学角度而言,酯化与水解反应互为逆过程,过量水分会促使反应平衡向水解方向移动;从动力学角度分析,过量水分不仅会稀释底物浓度、降低油酸与甘油分子同酶活性位点的碰撞概率,还可能与底物竞争结合活性中心,形成竞争性抑制,最终显著降低酯化反应速率[28]。据此,确定1.0%为该反应体系的最适宜含水质量分数。

不同小写字母表示组间数据存在显著性差异(P<0.05)。

图3 水质量分数对酯化反应产物中 TAG产率的影响

Fig.3 Effect of water mass fraction on TAG yield in esterification products

2.2.4 体系含酶质量分数的影响

在2种反应底物充足的情况下,增加酶剂量能够显著提升产物生成的速率[29]。然而,鉴于酶的生产成本因素,确定合适的酶添加量对于工业应用至关重要。

反应连续进行9 h,考察不同体系含酶质量分数下酯化产物中TAG产率的变化规律,结果如图4所示。由图4可见,在反应达到平衡之前,随着体系含酶质量分数的增大,TAG产率逐渐增大。提高体系含酶质量分数能够加快反应速率的原因是较高的酶浓度提供了更多的活性位点,从而提高了酶与底物结合的概率,促进酶-底物复合物的形成。此外,除0.1%添加组,其他添加组反应达到平衡后产物中TAG产率都在53%左右,说明酶的多少只能缩短反应时间,不能影响目标产物的生成量。增加体系含酶质量分数通常会提高反应速率,然而,当底物浓度有限时,增加体系含酶质量分数到一定程度后,反应速率会达到一个饱和状态。在此状态下,所有的酶活性位点都被底物占据,反应速率不再增加。此时,尽管酶的数量增加了,但由于底物的限制,目标产物的生成量不会进一步提高。这说明反应平衡受热力学因素控制,而非动力学因素。从经济角度考虑,0.2%的体系含酶质量分数表现出更优的性价比。虽然0.3%和0.4%的体系含酶质量分数能够缩短达到平衡的时间,但考虑到酶制剂的成本较高,额外增加的酶用量将带来边际效益的递减。因此,0.2%(5.92×10-3 U)体系含酶质量分数在6 h反应时间下获得53.23%的TAG产率,代表了反应效率与经济成本之间的较优平衡。因此,综合考虑,选择0.2%为体系最适宜含酶质量分数。

图4 体系酶质量分数对酯化反应产物中 TAG产率的影响

Fig.4 Effect of enzyme mass fraction on TAG yield in esterification products

2.2.5 底物物质的量之比的影响

底物物质的量之比是影响酶促酯化反应的一个重要参数[30]。反应连续进行10 h,考察不同底物物质的量之比下酯化产物中TAG产率的变化规律,结果如图5所示。由图5可见,不同甘油与油酸底物物质的量之比条件下产物中TAG产率随反应时间的变化呈现出明显的阶段性特征。在反应初期(0～1 h),所有配比条件下TAG产率均呈现缓慢增长趋势,这主要归因于酶促反应的迟滞期效应。在此阶段,酶分子需要时间与底物充分接触并形成有效的酶-底物复合物,同时反应体系的温度平衡和底物分散也需要一定时间。随着反应时间延长(2～6 h),各配比条件下TAG产率快速上升,表明反应进入线性期。值得注意的是,不同底物物质的量之比条件下TAG产率的增长速率存在显著差异,这直接反映了底物配比对酶催化效率的重要影响[31]。

图5 底物物质的量之比对酯化反应产物中 TAG产率的影响

Fig.5 Effect of substrate molar ratio on TAG yield in esterification products

在较低的甘油与油酸物质的量之比(1∶1～1∶2)条件下,TAG的最终产率相对较低,特别是1∶1配比显示出明显的劣势。这种现象可以从反应机理角度解释:甘油分子具有3个羟基,理论上需要3分子油酸进行完全酯化。当油酸浓度不足时,会导致反应不完全,大量中间产物单酰甘油酯(MAG)和二酰甘油酯(DAG)积累,无法进一步转化为目标产物TAG[32-33]。同时,研究结果表明,当底物物质的量之比达到1∶3.5时,TAG产率显著提升,这一原因可从2方面解释。首先,过量的油酸提供了充足的酰基供体,确保甘油分子的3个羟基位点都有足够的反应活性,因此显著提高了完全酯化的概率。再者,油酸作为长链脂肪酸,其含量增加降低了体系黏度,增强了底物与酶活性中心的接触频率,从而提升了反应效率[34]。当甘油与油酸物质的量之比超过1∶3.5时,TAG产率的增长趋于平缓,表明反应已接近平衡状态。此时,继续增加油酸含量对TAG生成的促进作用有限,这可能是由于在固定酶添加量条件下,当底物浓度达到一定水平后,酶的催化能力成为限制因素。同时,过量的油酸可能会增加体系的复杂性,影响底物在反应介质中的有效传质,这一趋势与相关报道一致[13]。虽然1∶4和1∶5的物质的量之比在TAG产率上与1∶3.5相近,但从经济角度考虑,过量的油酸会增加后续分离回收的复杂性。因此,1∶3.5的底物物质的量之比在保证高TAG产率(55.13%)的同时,兼顾了经济效益,是更优的工艺参数。

2.3 催化反应动力学分析

为探究反应过程中的底物抑制效应,本研究进一步测定了不同底物物质的量之比下RBL-LC6催化合成TAG的动力学参数,基于线性回归拟合斜率计算得到不同底物物质的量之比下TAG合成的反应初速度,其随甘油、油酸浓度变化的结果见图6。由于实验在无溶剂体系中进行,采用交替改变两种底物浓度的方式测定反应初速度。当油酸浓度从6.09 mol/L[c(甘油)∶c(油酸)=1∶2]增加到6.27 mol/L[c(甘油)∶c(油酸)=1∶3.5]时,初始反应速率从0.185 4 mol/(L·min)增加到最大值0.185 5 mol/(L·min),随着油酸浓度增至6.55 mol/L[c(甘油)∶c(油酸)=1∶4.5],初始反应速率逐渐下降。有学者在类似的系统中观察到类似的趋势,Kuperkar等[22]发现,使用固定化脂肪酶合成丙酸异丁酯的过程中,丙酸浓度从2.25 mol/L增加到8.27 mol/L时,初始速度从0.23 mol/(L·min)达到最高值1.10 mol/(L·min),然后开始下降。

图6 底物物质的量之比对反应初速度影响的实验值与预测拟合值的比较

Fig.6 Comparison of experimental and fitted values for initial reaction rate at different substrate molar ratios

Kuperkar等[22]采用了Ordered Bi-Bi、Random Bi-Bi和Ping-Pong Bi-Bi等3种不同的机制模型进行动力学分析。这些模型均通过测定反应初速度(v0)以及不同反应时间下底物A和B的浓度([A]、[B])来确定一系列动力学参数,包括最大反应速率(Vmax)、底物A的米氏常数(KA)、底物B的米氏常数(KB)、底物A的抑制常数(KiA)和底物B的抑制常数(KiB)。在Ordered Bi-Bi机制中,酶对2种底物的亲和力不同,2种底物按特定顺序与酶结合,产物也按特定顺序释放;Random Bi-Bi 机制则允许2种底物以任意顺序与酶结合,产物也随机释放;而Ping-Pong Bi-Bi机制与前2种机制显著不同:酶首先与底物A结合形成酰基-酶中间复合体(E·A),随后释放第一个产物P,同时底物A的一部分以共价键形式连接于酶上,此时酶转变为修饰形态F;接着底物B与酶F结合形成F·B复合物,进一步反应生成第2个产物Q并释放,酶F也随之恢复为其原始形态E。

采用以上3种反应机制评估初始反应速率随甘油与油酸浓度变化的关系,发现Random Bi-Bi和Ordered Bi-Bi 2种机制与实验数据拟合效果较差,相比之下,Ping-Pong Bi-Bi机制则显示出良好的拟合度,反应初速度随甘油、油酸浓度变化的预测结果分别如图6(a)、图6(b)中的Ping-Pong Bi-Bi拟合曲线所示,反应初速度的观测值与预测值的对比结果见图7。由图6可知,甘油与油酸浓度对RBL-LC6催化合成TAG的反应初速度均呈现先升后降的影响趋势,且二者在高浓度下均表现出明显的底物抑制效应:其中甘油浓度在2.51 mol/L时反应初速度达到峰值,继续升高至5.34 mol/L则催化效率显著下降;同理,油酸浓度在约6.26 mol/L时初速度达到最大值,浓度超过该值后初速度快速降低。由图7可知,实验观测值与模型预测值的散点紧密分布在对角线两侧,二者高度吻合,充分证明 Ping-Pong Bi-Bi 模型能够准确描述该无溶剂体系下的酶促酯化反应动力学行为,为反应机制解析及后续工艺优化提供了可靠的理论依据。

图7 反应初速度观测值与预测值的比较

Fig.7 Comparison of observed and predicted initial reaction rates

进一步使用Ping-Pong Bi-Bi模型获得了拟合参数,结果见表2。由表2可知,Ka表示甘油的米氏常数,Kb表示油酸的米氏常数,Kia表示甘油的抑制常数,Kib表示油酸的抑制常数。较高的Kia=8.965 6和Kib=7.664 3表明底物与RBL-LC6的非催化位点的结合增加,导致抑制。同时,由Kb=0.464 3高于Ka=0.390 5可以得出RBL-LC6对于甘油的亲和力更强。根据Ping-Pong Bi-Bi模型,RBL-LC6在无溶剂系统中催化的酯化反应包括以下步骤:由于Ka<Kb,RBL-LC6对甘油亲和力较高,甘油首先进攻RBL-LC6,形成不稳定的复合物后迅速脱水生成RBL-LC6-酰基中间体,此外由于Kia>Kib,油酸对RBL-LC6活性抑制较强,其也会与油酸反应形成无活性RBL-LC6-FA复合物,从而形成酸抑制。RBL-LC6-酰基中间体与油酸反应形成二元复合物,最终产生油酸甘油酯和游离RBL-LC6;同时,如甘油与RBL-LC6-酰基中间体结合,则形成无活性RBL-LC6-GLY复合物,导致醇抑制。

表2 Ping-Pong Bi-Bi 模型拟合参数

Tab.2 Ping-Pong Bi-Bi model fitting parameters

模型vmax/(mol/(L·min))Ka/(mol/L)Kb/(mol/L)Kia/(mol/L)Kib/(mol/L)标准差Ping-Pong Bi-Bi0.20410.39050.46438.96567.66430.0136

Ping-Pong Bi-Bi机制的关键动力学参数为催化体系优化提供了核心理论指导:Ka小于Kb表明RBL-LC6对甘油的亲和力强于油酸,这意味着底物必须遵循“甘油先结合形成酰基-酶中间体,再与油酸反应”的顺序。因此,在单因素实验确定的c(甘油)∶c(油酸)=1∶3.5为最优摩尔比,该比例既能够为甘油的完全酯化提供充足的酰基供体,又与酶对甘油的高亲和力特性相适配;而Kib小于Kia,说明过量的油酸更易形成“死端复合物”,从而引起底物抑制,这限定了油酸过量的合理边界,即底物物质的量之比超过1∶3.5后,TAG产率增长趋于平缓,故无须盲目扩大底物比例。此外,该反应机制为后续工艺改进指明了方向,可采用“初始1∶3底物物质的量之比投料、反应4 h后补充油酸至1∶3.5”的分段投料策略以避免初始油酸过量抑制反应的进行,也可通过定点突变修饰酶活性位点口袋结构,降低Kb值(增强油酸结合能力)并提高Kib值(减轻油酸抑制),从根本上提升催化循环效率[35]。

3 结 论

研究将重组米糠耐热脂肪酶RBL-LC6应用于无溶剂体系中催化甘油与油酸的酯化反应合成TAG。随着反应温度从40 ℃升高至90 ℃,RBL-LC6在高温(80 ℃)条件下更有利于TAG的催化合成,TAG产率达48.04%;通过优化反应条件,在较优的反应条件下(反应时间6 h、反应温度80 ℃、体系含水质量分数1.0%、体系含酶质量分数0.2%、底物甘油与油酸的物质的量之比1∶3.5),TAG产率最高可达55.13%。酶促反应动力学拟合结果显示,RBL-LC6催化的酯化反应遵循Ping-Pong Bi-Bi机制,且对甘油的亲和力强于油酸。

研究提供了一种能在高温下较好催化酯化反应生成TAG的重组脂肪酶RBL-LC6,建立了高效的酶促合成工艺体系,希望为绿色生物催化技术在精细化工领域的应用奠定理论基础。未来需结合分子蒸馏或柱层析等手段实现TAG的高纯度分离,同时针对性开展多脂肪酸底物的酶法合成研究,为该酶的工业化应用积累更丰富的数据。

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Study on Catalytic Synthesis of Triolein by Recombinant Rice Bran Thermostable Lipase RBL-LC6

Zhang Mingyu1, Zhou Pengfei2, Deng Yuanyuan2, Zeng Jiarui2, Zhang Yan2, Li Ping2, Zhao Zhihao2, Hu Songqing1,*, Liu Guang2,*

(1. School of Food Science and Engineering, South China University of Technology, Guangzhou 511442, China;2. Institute of Sericulture and Agricultural Product Processing, Guangdong Academy of Agricultural Sciences/Key Laboratory of Functional Food, Ministry of Agriculture and Rural Affairs/Guangdong Provincial Key Laboratory of Agricultural Product Processing, Guangzhou 510640, China)

Abstract： Enzymatic synthesis of triolein (TAG) has become an important approach for green development in the fine chemical industry due to its high product purity, low pollution, and simple downstream separation. However, the industrial application of enzymatic TAG synthesis is limited by insufficient thermal stability and low catalytic efficiency of lipases at high temperatures. Therefore, developing lipases with excellent thermostability and high catalytic activity is the key to technological breakthroughs. In this study, recombinant rice bran thermostable lipase (RBL-LC6) derived from rice bran was used as the catalyst to investigate the optimal conditions for the enzymatic esterification of oleic acid and glycerol for TAG production at high temperatures. The effect of temperature on product distribution was first explored. Then single-factor experiments were carried out to examine the effects of reaction time, temperature, water mass fraction, enzyme mass fraction, and substrate molar ratio on TAG synthesis. The enzymatic reaction kinetics was also analyzed.The results showed that as the temperature increased from 40 ℃ to 90 ℃, RBL-LC6 exhibited better catalytic performance for TAG synthesis at 80 ℃, with a TAG yield of 48.04%. After optimization, the highest TAG yield reached 55.13% under the optimal conditions: reaction time 6 h, temperature 80 ℃, water mass fraction 1.0%, enzyme mass fraction 0.2%, and substrate glycerol/oleic acid molar ratio 1∶3.5. Kinetic analysis indicated that the esterification catalyzed by RBL-LC6 followed the Ping-Pong Bi-Bi mechanism and the enzyme exbibited a stronger affinity for glycerol than for oleic acid.This study aimed to provide theoretical and technical support for the green enzymatic synthesis of TAG under high-temperature conditions.

Keywords： rice bran thermostable lipase; high-temperature lipase; esterification reaction; triolein; reaction kinetics

doi：10.12301/spxb202500537

文章编号：2095-6002(2026)04-0120-12

引用格式：张明宇,周鹏飞,邓媛元,等. 重组米糠耐热脂肪酶RBL-LC6催化合成三油酸甘油酯研究[J]. 食品科学技术学报,2026,44(4):120-131.

Zhang Mingyu, Zhou Pengfei, Deng Yuanyuan, et al. Study on catalytic synthesis of triolein by recombinant rice bran thermostable lipase RBL-LC6[J]. Journal of Food Science and Technology, 2026,44(4):120-131.

收稿日期： 2025-11-11

基金项目： 广东省重点研发计划项目(2023B0202060002);广东省自然科学基金资助项目(2023A1515030242);广东省农业科学院科技创新战略专项基金(R2023PY-JX018、R2023PY-JG014);广东省现代农业产业共性关键技术研发创新团队建设项目(2024CXTD16、2024CXTD05)。

Foundation： Key R&D Program of Guangdong Province (2023B0202060002); Natural Science Foundation of Guangdong Province (2023A1515030242); Science and Technology Innovation Strategic Special Fund of Guangdong Academy of Agricultural Sciences (R2023PY-JX018, R2023PY-JG014); Construction Project of Innovation Team for General and Key Technology R&D of Modern Agricultural Industry in Guangdong Province (2024CXTD16, 2024CXTD05).

第一作者： 张明宇,男,硕士研究生,研究方向为食品生物技术与生物加工。

*通信作者：

胡松青,男,教授,博士,主要从事食品生物技术与生物加工方面的研究。E-mail: fesqhu@scut.edu.cn。

刘 光,男,研究员,博士,主要从事粮食加工及功能食品方面的研究。E-mail: liuguang@gdaas.cn。

中图分类号： TS229

文献标志码： A

(责任编辑：李 宁)