母乳寡糖(human milk oligosaccharides,HMOs)是母乳中第三大固体成分,含量仅次于乳糖和脂类[1]。目前已从母乳中鉴定出200余种HMOs,其中大多数为岩藻糖基化修饰的寡糖类物质。2′-岩藻糖基乳糖(2′-FL)是含量最为丰富的HMOs组分,约占母乳寡糖总量的30%[2-3]。2′-FL可通过调节肠道微生态[4]、抑制病原菌黏附、增强免疫应答[5]及促进神经系统发育等多种途径发挥生理功能[6]。2′-FL在婴幼儿配方食品、功能食品及生物医药领域展现出较高的应用价值,目前已成为糖生物学与食品生物技术领域的研究热点。

当前,以生物催化或微生物发酵为代表的生物制造技术已成为大规模、高效率生产2′-FL的主流方向,其中,微生物发酵法通过对大肠杆菌、酵母等底盘菌株进行代谢工程改造,强化GDP-岩藻糖供给、优化α-1,2-岩藻糖基转移酶并敲除旁路途径,可使2′-FL的发酵产量达到10～100 g/L,已满足产业应用要求[7]。酶催化法受限于产量及成本,尚未能大规模应用,但其反应条件温和、副产物少且产物易分离;同时,酶催化法简洁的催化流程可避开微生物发酵中底物竞争与代谢负担限制,便于关键催化用酶的筛选与定向进化。在2′-FL合成过程中,α-1,2-岩藻糖基转移酶(FucT)催化GDP-岩藻糖的岩藻糖基转移至乳糖分子,该催化反应是合成2′-FL的核心步骤,因此FucT的催化活性与催化效率直接决定2′-FL的合成水平与生产成本[7]。天然FucT普遍存在表达量低、可溶性差、活性有限等不足,成为2′-FL高效生物合成的关键瓶颈。微生物来源FucT及其重组表达为2′-FL生物合成提供了有利资源。目前,来源于幽门螺杆菌Helicobacter pylori的FucT是研究最早、应用最广泛的酶源之一[8]。Li等[9]将H. pylori来源的FucT基因克隆至pET-28a载体,在大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)中实现异源高效可溶表达,构建的工程菌株在3 L发酵罐中分批发酵48 h,2′-FL产量达到32.2 g/L,乳糖转化率为65.5%;Xu等[10]通过密码子偏好性优化改良FucT,在酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae中实现高效表达,发酵72 h后2′-FL产量达26.63 g/L,乳糖转化率提升至77.3%。近年来,一些新的具有活性的FucT也逐步被发现并应用,以来源脆弱拟杆菌Bacteroides fragilis的WcfB替换来源于H. pylori的FucT[11]后,分批发酵中2′-FL的产量提高了10倍,在LacZ完全缺失的工程菌中,WcfB的表达使2′-FL产量进一步提高50%;表达固氮螺菌Azospirillum lipoferum来源的FucT工程菌株,2′-FL产量达到8.03 g/L,通过补料分批发酵,在5 L生物反应器中2′-FL最高产量达到112.56 g/L[12];来源Escherichia coli O126的WbgL[13]对乳糖底物具有较高的转化活性。FucT的挖掘为2′-FL的高效合成提供了新的酶源选择。目前,FucT仍相对有限,且往往表达量低并易于形成包涵体,需要进一步拓展其来源并促进其在HMOs合成中的应用。

本研究聚焦新的来源FucT的挖掘及高效表达,从不同来源微生物基因中广泛筛选,并通过共表达分子伴侣提高适配性以优化可溶表达。再联合表达用于活化岩藻糖基的L-岩藻糖激酶/GDP-岩藻焦磷酸化酶FKP,以及引入多聚磷酸激酶PPK2,形成ATP/GTP循环再生,构建FKP-PPK2-FucT的多酶级联体系,考查挖掘获得的FucT催化合成2′-FL的能力。希望本研究能够进一步拓展FucT的来源,为2′-FL的高效合成提供酶资源与技术支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 菌株与引物

菌株E.coli JM109、E.coli BL21(DE3)和质粒pCold Ⅰ均来自本实验室保藏,所用引物见表1。

表1 引物信息

Tab.1 Primers information

引物名称序列(5′-3′)Fkp-FcatatcgaaggtaggcatatgCAAAAATTGCTATCATTACCCCCFkp-RagactgcaggtcgacaagcttTTAGCTACGGGAGACCTGGAAAPPK2-Fcatatcgaaggtaggcatatg ATGGCTGAAACCAACGAAAATGATCTTPPK2-Ragactgcaggtcgacaagctt CTAGTCACCGATCTGGTCGCGH.p-FucT-FcatatcgaaggtaggcatatgGCTTTTAAAGTAGTTCAAATATGTGGAGGH.p-FucT-RagcagagattacctatctagaAGCGTTATACTTTTCGCTTTTAACCH.h-FucT-FggatcttccagagatCATATGAAAGACGATCTTGTAATCTTGCH.h-FucT-RctgccgttcgacgatTCTAGATTATGCTGAGGCGTTATCTTH.m-FucT-FggatcttccagagatCATATGGATTTCAAGATCGTTCAAGH.m-FucT-RctgccgttcgacgatTCTAGATTAAGATTTTGTTTCAAATTGAGAH.b-FucT-FggatcttccagagatCATATGAAGGACAATCTGACCATCAH.b-FucT-RctgccgttcgacgatTCTAGATTAGGCGATAGTGGAGATAGA

1.1.2 主要试剂

胰蛋白胨、酵母提取物、琼脂粉、甘油、葡萄糖、盐酸、乙腈、七水合硫酸镁,国药集团化学试剂有限公司;氨苄青霉素钠、氯霉素、L-阿拉伯糖、异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG),生工生物工程(上海)股份有限公司;2′-FL、GDP-岩藻糖,Sigma(上海)贸易有限公司;L-岩藻糖,麦克林生化科技有限公司;电泳缓冲液MOPS-SDS Running Buffer、上样缓冲液4×LDS Loading Buffer,伯仪生物科技有限公司;预染蛋白质Marker、考马斯亮蓝快速染色液,上海碧云天生物技术股份有限公司;2×phanta Taq Master Mix、2×Rapid Taq Master Mix、Exnase Ⅱ、小量质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒,南京诺唯赞生物科技有限公司。

1.1.3 培养基

LB培养基(g/L):酵母提取物5,胰蛋白胨10,NaCl 10。

LB固体培养基:在LB培养基的基础上添加15 g/L琼脂粉末,121 ℃、20 min条件下灭菌。

共表达分子伴侣用LB培养基:在LB培养基的基础上,分子伴侣pGro7、pKJE7、pTf16的培养基添加0.5 mg/mL L-阿拉伯糖,pG-Tf2添加5 ng/mL四环素;pG-KJE8同时添加0.5 mg/mL L-阿拉伯糖和5 ng/mL四环素。

1.2 仪器与设备

Centrifuge 5430R小型低温离心机,Eppendorf公司;Himac CR22G型台式高速冷冻离心机,日本日立公司;HH-4型恒温水浴锅,金坛市富华电器有限公司;UV-2100型紫外可见分光光度计,尤尼柯上海仪器有限公司;JY92-Ⅱ型超声破碎仪,宁波新芝生物科技股份有限公司;HYL-C型恒温振荡培养箱,太仓市实验设备厂;Bio-Rad C1000型PCR仪、Mini-PROTEAN 3Cell型蛋白电泳系统,美国Bio-Rad公司;Mupid-2型核酸电泳系统,日本Mupid公司;GelDoc-It/EC3型凝胶成像仪,美国UVP公司;1260型高效液相色谱仪,美国Agilent公司。

1.3 实验方法

1.3.1 重组酶的构建与分子伴侣促溶表达

1.3.1.1 目的基因的扩增

从Genebank中挖掘得到4段螺杆菌来源的FucT,包括幽门螺杆菌Helicobacter pylori来源的H.p-FucT(AAC44443.1)、肝螺杆菌Helicobacter hepaticus来源的H.h-FucT(WP011114915.1)、雪貂螺杆菌Helicobacter mustelae来源的H.m-FucT(AAP78373.1)和胆型螺杆菌Helicobacter bilis来源的H.b-FucT(WP320612746.1),同时挖掘获得1段脆弱拟杆菌Bacteroides fragilis来源的FKP(WP005800300.1),谷氨酸棒杆菌Corynebacterium glutamicum来源的PPK2(WP003860171.1),并委托无锡天霖生物科技公司进行优化合成。以合成的基因片段为模板,使用表1中引物扩增目的基因,并在末端添加组氨酸标签便于后续分离纯化。PCR体系为50 μL:2×phanta Taq Master Mix酶缓冲液、引物2 μL、模板DNA 1 μL、ddH2O 22 μL。PCR扩增条件:95 ℃预变性3 min;95 ℃变性20 s,55 ℃退火 20 s,72 ℃延伸45 s,变性-退火-延伸共35个循环;终延伸5 min。反应结束后对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳验证,参数为150 V、15 min,并在凝胶成像仪下观察目的基因片段扩增结果,或切胶回收。

1.3.1.2 载体构建

重组质粒的构建采用同源重组的方法,将分别带有目的基因FucT、FKP和PPK2片段和酶切后的线性化载体pCold Ⅰ按比例混匀,在同源重组酶 Exnase Ⅱ的催化下发生环合,使目的基因和载体连接。将扩增的基因克隆至pCold Ⅰ载体的多克隆位点Nde Ⅰ和Xba Ⅰ之间,以此获得重组质粒。

1.3.1.3 工程菌的构建

将构建好的质粒转化至E. coli JM109感受态,37 ℃过夜培养,挑取单菌落。通过菌落PCR验证重组质粒转化情况,测序正确的阳性克隆转接至10 mL LB培养基中,过夜培养后提取质粒,转化至E. coli BL21(DE3)感受态获得工程菌。

1.3.1.4 分子伴侣共表达

以FucT与分子伴侣共表达为例。将前期构建的工程菌接种于含100 μg/mL卡那霉素的液体LB培养基,37 ℃、220 r/min振荡培养,待细菌生长到OD600 0.4～0.6时,用CaCl2溶液制备感受态细胞。将pGro7、pKJE7、pG-Tf2、pTf16、pG-KJE8五种分子伴侣质粒分别转化到新制备的感受态细胞,在 20 μg/mL 氯霉素和100 μg/mL卡那霉素的平板筛选阳性克隆,获得同时含FucT表达质粒和分子伴侣质粒的基因工程菌。将筛选得到的各阳性转化子分别转接至含对应诱导剂的LB培养基中,37 ℃、220 r/min 振荡培养,当发酵液OD600达到0.6～0.8时,加入终浓度50 μmol/L的IPTG,16 ℃发酵诱导24 h后收集发酵上清液,通过SDS-PAGE电泳检测FucT的可溶表达情况。FKP与PPK2与分子伴侣共表达采用相同方法。

1.3.2 酶的表达与纯化

将工程菌在LB培养基中发酵,待OD600达 0.6～0.8时,加入终浓度为50 μmol/L的IPTG,在16 ℃条件下诱导24 h。发酵结束后,将发酵液以 8 000 r/min 转速离心10 min,分别收集发酵上清液和菌体。菌体用磷酸盐缓冲液(pH值为7.4)重悬后超声破碎。离心去除细胞碎片,上清液采用SDS-PAGE分析蛋白表达情况。

采用Ni-NTA亲和层析柱对粗酶进行纯化。洗脱液:Tris浓度为20 mmol/L,NaCl浓度为500 mmol/L,咪唑浓度为10～50 mmol/L。采用糖基转移酶活性检测试剂盒GDP-GloTM Glycosyltransferase Assay (Promega)对FucT酶活进行检测。以GDP-岩藻糖为供体、乳糖为受体,37 ℃条件下反应30 min,加等量检测试剂,室温孵育60 min,利用化学发光法检测释放的GDP。酶活定义为每分钟催化1 μmol岩藻糖转移并释放1 μmol GDP所需酶量。

1.3.3 酶结构与分子对接分析

利用CB-Dock 2平台,基于AutoDock Vina算法对FucT与GDP-岩藻糖进行对接分析[14]。不同FucT的三维结构通过SWISS-MODEL同源建模服务器构建,以PDB数据库中同源性最高的岩藻糖基转移酶结构为模板,经PROCHECK工具分析,95%以上残基位于Ramachandran图中允许区,确认结构合理性。使用AutoDockTools对蛋白结构进行预处理:去除结晶水分子与冗余配体,添加极性氢原子,计算Gasteiger电荷并保存为PDBQT格式。配体GDP-岩藻糖的三维结构从PubChem数据库下载,同样添加极性氢原子与 Gasteiger 电荷,保存为PDBQT格式。将预处理后的蛋白与配体文件上传至CB-Dock 2平台。对接参数设置为:网格中心由平台自动计算,网格尺寸为20 Å×20 Å×20 Å,搜索精度exhaustiveness 8,其余参数保持默认。以结合能最低的构象作为最优结合模式进行后续分析。使用PyMOL对最优对接构象进行可视化与相互作用分析。采用CASTp 3.0在线工具计算活性口袋体积,探针半径设为1.4 Å。通过PyMOL的氢键检测功能分析底物与蛋白残基间的氢键相互作用,同时识别静电相互作用与疏水相互作用的关键残基,对比两种酶活性口袋的结构差异与底物结合机制。

1.3.4 多酶级联催化合成2′-FL体系构建与优化

1.3.4.1 2′-FL多酶级联催化体系与条件优化

初始催化采用1 mL反应体系,在Tris-HCl(pH值为7.5)缓冲液中分别加入10 mmol/L乳糖和岩藻糖、2.5 mmol/L的GTP和ATP,以及5 mmol/L的Mg2+,按1 mg/mL分别添加FucT与FKP,形成双酶级联催化体系。考察反应温度(25、30、37、45 ℃)、岩藻糖与乳糖的浓度比例(1∶10、1∶4、1∶2、1∶1、2∶1)、ATP与GTP的浓度比例(1∶4、1∶2、1∶1、2∶1、4∶1);Mg2+浓度(1.0、2.5、5.0、10.0、20.0 mmol/L)等条件对反应后2′-FL含量的影响。

1.3.4.2 辅因子循环辅助2′-FL的补料催化合成

引入能量循环系统辅助2′-FL催化合成。在优化反应条件基础上,在10 mL反应体系中添加20 mmol/L多聚磷酸盐、1 mg/mL的PPK2,形成ATP-GTP能量循环。催化过程中分别在1、2、4 h时进行分批补加混合酶液FKP-FucT-PPK2与乳糖,以提高2′-FL的合成产量。37 ℃反应10 h后100 ℃水浴10 min终止反应,12 000 r/min离心10 min除酶,样品经0.22 μm滤膜过滤后进行液相分析。

1.3.5 2′-FL的定量分析

采用高效液相色谱(HPLC)对2′-FL进行定量分析。色谱条件:XBridgeTM Amide柱(4.6 mm×250 mm,5 μm),流动相比例为V(乙腈)∶V(水)=7∶3,流速 1 mL/min,柱温35 ℃,示差检测器温度设置为35 ℃。

1.4 数据分析

采用Origin 2021软件对数据进行统计分析和绘图,每个实验设置3个平行。

2 结果与分析

2.1 FucT基因挖掘与筛选结果分析

2.1.1 FucT基因挖掘与进化结果

FucT可催化GDP-岩藻糖以α-1,2糖苷键形式转移至乳糖的半乳糖残基,是2′-FL生物合成的核心限速酶。FucT的异源表达水平、可溶性与催化活性直接决定2′-FL的合成效率[15]。本研究以文献中常用的Helicobacter pylori的H.p-FucT(AAC44443.1)为模板探针,通过NCBI的BLAST同源序列比对,筛选获得序列同源性在30%～80%,且完整保留GT10家族岩藻糖基转移酶核心催化结构域与保守功能基序的氨基酸序列作为候选,利用MEGA软件进行多序列比对分析,并基于比对结果构建系统发育树,结果如图1所示。由图1可知,基于序列的亲缘关系,同时考虑所选序列对螺杆菌属不同物种的覆盖,选择AAP78373.1(Helicobacter mustelae)、WP_011114915.1(Helicobacter hepaticus)与WP_320612746.1(Helicobacter bilis)3条候选序列。挖掘得到的FucT基本信息汇总于表2。结合图1的聚类结果,这3条序列与模板序列分属不同进化支系,和模板的同源度在35%～58%,可避免遗传背景高度相似带来的功能冗余,也可为后续对比不同进化来源酶的催化性能提供遗传多样性基础。将这3条候选序列与模板序列进行后续表达与催化实验。

图1 不同来源FucT基因序列进化树

Fig.1 Evolutionary tree of FucT gene from different sources

表2 挖掘得到的FucT信息

Tab.2 Information of gene fragments encoding FucT

酶代号来源基因长度/bp蛋白分子质量/kDaH.p-FucTHelicobacter pylori900 35.0H.m-FucTHelicobacter mustelae87033.2H.h-FucTHelicobacter hepaticus97236.0H.b-FucTHelicobacter bilis960 36.2

2.1.2 重组表达FucT的比较结果

进一步对挖掘所得的3个FucT及模板进行重组表达,结果如图2所示。由图2可知,4种重组FucT菌株的细胞破碎液上清液中(泳道2～5)均可见与理论蛋白分子质量相符的特征条带(33.2～36.2 kDa),表明4个来源的FucT基因均能够实现可溶表达,其中,H.m-FucT蛋白条带灰度值最高,表明其可溶表达水平显著优于其他3种来源的FucT。此外,细胞破碎液沉淀的电泳结果显示,4种重组FucT均大量存在包涵体形式的目的蛋白,提示4种FucT中均有不同程度的不可溶现象。这是由于,大部分FucT是参与糖基化修饰的膜蛋白,其疏水结构域在异源表达过程中易发生疏水相互作用,从而聚集形成不溶性包涵体,导致可溶性蛋白表达量偏低[16]。因此,进一步提高FucT的可溶表达水平是提高FucT催化性能的关键。

M为蛋白Marker,1为不含目标蛋白的空载菌株的细胞破碎液上清液,2～5依次为重组H.p-FucT、H.m-FucT、H.h-FucT和H.b-FucT的细胞破碎液上清液,6为空载菌株的细胞破碎液沉淀,7～10依次为重组H.p-FucT、H.m-FucT、H.h-FucT和H.b-FucT的细胞破碎液沉淀。

图2 不同来源FucT的SDS-PAGE

Fig.2 SDS-PAGE of FucT from different sources

将4个重组FucT纯化后比较其催化活力。以GDP-岩藻糖为底物,通过检测GDP的释放量分析重组FucT的酶活,实验结果如图3所示。由图3可知,4个FucT均具有一定的岩藻糖基转移酶催化活性。本研究挖掘所得的H.m-FucT的比酶活(约为3.60 U/mg)与文献报道中H.p-FucT的比酶活(约为3.57 U/mg)相近,高于本研究挖掘的H.h-FucT和H.b-FucT的酶活,说明H.m-FucT具有良好的转糖基活力。进一步将H.m-FucT和糖基供体GDP-岩藻糖进行分子对接,并与H.p-FucT对比,分析其结构差异[14],实验结果如图4所示。由图4可见,本研究挖掘所得H.m-FucT与供体GDP-岩藻糖的结合能为-33.47 kJ/mol,显著高于H.p-FucT与GDP-岩藻糖的结合能(-41.42 kJ/mol),说明H.m-FucT与底物亲和作用更强,更有利于催化过程中与供体的结合及岩藻糖基转移[17]。进一步对活性口袋与关键残基分析发现,H.m-FucT的底物结合口袋体积约 1 394 Å3,显著小于H.p-FucT(3 860 Å3)。H.m-FucT活性口袋中,Arg29、Arg93、Arg105、Arg154等带正电的Arg残基可与GDP-岩藻糖的焦磷酸基团形成较强氢键与静电相互作用,Asn54、Ser55、Gln127等极性残基可与底物糖基形成稳定氢键,Val86、Phe90、Leu112等疏水残基则围绕底物形成紧凑结合腔,共同辅助底物的结合锚定;而在H.p-FucT活性口袋区域,参与氢键结合的残基以极性较弱的Ser、Asp、Gln为主,疏水残基侧链基团更大,从而形成体积更大的口袋空腔[18-19]。酶活测定与分子对接分析结果表明,H.m-FucT兼具良好的催化效率与底物结合能力,因而可作为后续优化的研究对象。

相同小写字母表示组间差异不显著(P>0.05),不同小写字母表示组别差异显著(P<0.05)。

图3 重组FucT的酶活检测结果

Fig.3 FucT enzymatic activity assay

图4 H.p-FucT、H.m-FucT与GDP-岩藻糖的分子 对接模拟

Fig.4 Molecular Docking simulation of H.p-FucT and H.m-FucT with GDP-Fucose

2.2 分子伴侣共表达结果分析

为明确H.m-FucT异源表达的限制因素,利用TMHMM软件对其跨膜结构域进行预测[20],分析结果见图5。由图5可见,H.m-FucT序列存在跨膜螺旋的概率为0,证实该蛋白为非膜结合蛋白,无跨膜结构与膜定位需求,理论上可在胞内实现可溶性表达,排除了膜蛋白特有的转运与膜整合障碍[21]。H.m-FucT酶可溶性预测的分析结果见图6。由图6可知,尽管H.m-FucT无跨膜结构,但其天然可溶性概率仅为30.5%,由此推测,H.m-FucT自身固有的低可溶性是导致其在大肠杆菌中表达时形成包涵体的主要原因,这也是许多糖基转移酶重组表达的共性问题[16,22-23]。

图5 H.m-FucT酶的穿模结构域预测结果

Fig.5 Prediction results of transmembrane domain of H.m-FucT

图6 H.m-FucT酶的可溶性预测结果

Fig.6 Solubility prediction results of H.m-FucT

分子伴侣是蛋白质稳态调控的核心因子之一,可通过介导新生肽链正确折叠、抑制错误聚集及平衡蛋白质周转而有效改善蛋白异源表达中的包涵体现象[24],这为解决FucT蛋白可溶表达提供了途径。采用双质粒共表达体系,通过两步法转化构建FucT与不同分子伴侣的共表达菌株。系统评价了5种分子伴侣质粒(pGro7、pKJE7、pG-Tf2、pTf16、pG-KJE8)对H.m-FucT可溶表达的促进效果,分析结果见图7。由图7(a)可知,与无分子伴侣的对照组相比,5种分子伴侣均能不同程度提升H.m-FucT的可溶表达水平,其中,H.m-FucT与pGro7、pKJE7共表达时,细胞破碎液上清液中目的蛋白条带最为明显。图7(b)为通过ImageJ软件对图7(a)的SDS-PAGE条带进行灰度半定量分析的结果。由图7(b)可知,无分子伴侣的对照组中,H.m-FucT可溶性蛋白的校正积分光密度值(integrated optical density,IOD)仅为3 847;与pKJE7共表达后,H.m-FucT可溶性蛋白的IOD值达26 932,较对照组提升6倍,促溶效果最为显著;pGro7、pG-KJE8、pG-Tf2及pTf16共表达组的IOD值则分别较对照组提升3倍、2.5倍、2倍与1.5倍。综合考虑可溶性表达水平、蛋白表达稳定性及后续多酶催化体系的适配性,最终确定以H.m-FucT与pKJE7的共表达体系为优化组合,后续2′-FL多酶级联合成体系的构建将以H.m-FucT与pKJE7的组合为酶源基础。

M为蛋白Marker,1为不含目标蛋白的空载细胞破碎液上清液,2为不含分子伴侣的H.m-FucT细胞破碎液上清液,3～7分别为含有分子伴侣pGro7、pKJE7、pG-Tf2、pTf16和pG-KJE8的H.m-FucT细胞破碎液上清液。

图7 H.m-FucT与分子伴侣共表达结果

Fig.7 Co-expression results of H.m-FucT with molecular chaperones

2.3 多酶级联催化体系构建与2′-FL合成的结果分析

针对2′-FL的合成,基于前期筛选获得的H.m-FucT,本研究拟进一步构建“岩藻糖活化→GDP-岩藻糖合成→转糖基催化”的体外多酶级联反应体系,核心反应路径包括3个功能模块(图8)。1)底物活化模块。以岩藻糖为底物,由拟杆菌来源的双功能酶FKP催化,消耗ATP完成磷酸化修饰,生成岩藻糖-1-磷酸。2)供体合成模块。岩藻糖-1-磷酸与GTP经由PPK2催化合成岩藻糖基供体GDP-岩藻糖,完成岩藻糖活化。3)转糖基合成模块。由前期筛选的高活性H.m-FucT催化,将GDP-岩藻糖的岩藻糖基定向转移至受体底物乳糖上,生成目标产物2′-FL,同时释放GDP[25-26]。此外,引入辅因子能量循环再生模块优化反应,PPK2酶催化ATP-GTP-能量循环,由此实现2′-FL的高效、一锅法合成[27]。

图8 2′-FL的多酶级联催化示意图

Fig.8 Schematic diagram of in vitro multi-enzyme cascade catalysis of 2′-FL

2.3.1 基于FKP的GDP-岩藻糖合成结果

在2′-FL的多酶级联催化体系中,双功能酶FKP通过两步连续反应催化岩藻糖合成GDP-岩藻糖[28],在底物活化与终产物合成过程中起关键衔接作用。选取脆弱拟杆菌Bacteroides fragilis来源的FKP进行重组表达,SDS-PAGE检测结果如图9所示。由图9(a)可见,细胞破碎液上清液中,在约105 kDa处出现与蛋白理论分子质量相符的特征蛋白条带,表明FKP能可溶表达,但同时存在包涵体。进一步构建FKP与5种分子伴侣(pGro7、pKJE7、pTf16、pG-KJE8、pG-Tf2)的共表达体系以提高FKP的可溶表达水平,由图9(b)可见,5种分子伴侣均能不同程度提升FKP的可溶性表达水平,其中FKP与pG-Tf2共表达时,胞内可溶蛋白量最高。因此,后续选用FKP-pG-Tf2共表达体系用于GDP-岩藻糖的合成与多酶催化合成2′-FL。

图(a)中,M为蛋白Marker,1为空载菌株的细胞破碎液上清液,2为重组FKP细胞破碎液上清液,3为不含目标蛋白的空载菌株的细胞破碎液沉淀,4为FKP的细胞破碎液沉淀;图(b)中,M为蛋白Marker,1～5为FKP分别与pGro7、pKJE7、pTf16、pG-KJE8和pG-Tf2五个分子伴侣共表达后的细胞破碎液上清液。

图9 重组表达FKP的SDS-PAGE检测结果

Fig.9 SDS-PAGE analysis result of recombinant FKP

2.3.2 多酶级联催化合成2′-FL的条件优化结果

为提升多酶级联体系合成2′-FL的催化效率,本研究以2′-FL产量为评价指标,采用单因素优化方法分别探究温度、酶添加量、底物岩藻糖与乳糖比例、ATP与GTP浓度比例以及Mg2+浓度对反应的影响,实验结果如图10所示。由图10(a)可知,在反应温度为25～37 ℃时,2′-FL的产量随反应温度升高逐步增加,并在37 ℃时达到峰值;当温度升高至45 ℃时,2′-FL产量出现显著下降,说明过高温度会导致酶蛋白空间结构改变、催化活性丧失,进而降低2′-FL的合成效率。由图10(b)可知,维持FKP与FucT酶等比例加入催化体系,当酶质量浓度在0.2～1.0 mg/mL时,2′-FL产量随酶浓度增加显著提升,当酶质量浓度为1.0 mg/mL时,2′-FL产量达到最高。由图10(c)可知,在底物添加量和比例方面,岩藻糖与乳糖浓度比例在1∶2时,2′-FL产量达到最大值;进一步提高底物比例时,2′-FL产量出现明显下降,表明过高浓度的岩藻糖并不能提高底物反应效率。由图10(d)可知,进一步优化ATP与GTP浓度比例,ATP与GTP配比对2′-FL合成效率影响显著,当ATP与GTP添加浓度比例为1∶2时,2′-FL产量达到最高;随着ATP增加、GTP降低,2′-FL产量逐渐下降,表明多酶级联体系对GTP的需求更高,因此确定ATP与GTP的浓度比例为1∶2为较佳添加量。由图10(e)可知,Mg2+对糖基活化酶及转移酶的活力具有显著的激活作用。在Mg2+浓度为1.0～5.0 mmol/L时,2′-FL产量随Mg2+浓度升高快速提升,Mg2+浓度为5.0 mmol/L时产量达到峰值;当Mg2+浓度继续升高时,产物产量逐步下降,表明过高的金属离子浓度会对酶促反应产生抑制。本研究确定了多酶级联体系合成2′-FL的较优反应条件:反应温度37℃,酶质量浓度1.0 mg/mL,岩藻糖与乳糖浓度比例1∶2,ATP与GTP浓度比例为1∶2,MgCl2浓度为5.0 mmol/L。

图10 多酶级联催化合成2′-FL条件的优化

Fig.10 Optimization of conditions for synthesis of 2′-FL via multi-enzyme cascade catalysis

2.3.3 基于能量循环再生的2′-FL多酶催化合成结果

岩藻糖的活化需要辅因子提供能量,而FKP催化合成GDP-岩藻糖的过程需消耗等物质的量的ATP与GTP。辅因子价格昂贵,故考虑在反应体系中引入辅因子能量循环再生模块,减少辅因子的投入[29]。多聚磷酸激酶PPK2可催化多聚磷酸盐生成无机磷酸,同步驱动ATP与GTP两种辅因子的循环再生,且底物廉价易获取,是形成GDP-岩藻糖能量再生的良好选择[30]。基于此,本研究选取Corynebacterium glutamicum来源的PPK2进行异源表达,并对分子伴侣进行适配性筛选,实验结果如图11所示。由图11可知,5种分子伴侣均能有效提升PPK2的可溶性表达水平,其中,PPK2与pG-Tf2的共表达组合可溶性表达效果最优,因此确定该组合用于后续能量循环体系的构建。

图(a)中,M为蛋白Marker,1～7为PPK2分别与pG-Tf2、pG-KJE8、pTf16、pKJE7和pGro7五个分子伴侣共表达后的发酵上清液,8～12为细胞破碎液上清液。

图11 PPK2与分子伴侣共表达结果

Fig.11 Co-expression results of PPK2 with molecular chaperones

为突破单批次反应的产量限制,在单因素优化确定关键参数及建立辅因子能量再生模块的基础上,进一步采用分批补料策略进行2′-FL的合成。10 mL反应体系下,分别在反应进行至2 h和4 h时,额外补加终质量浓度为1 mg/mL的H.m-FucT-FKP-PPK2混合酶液及10 mmol/L乳糖底物,实验结果如图12所示。由图12可知,在分批补料条件下,0～10 h期间2′-FL产量持续增加;12 h后,产量不再增加,此时2′-FL最大产量提高至3.40 g/L。

“→”表示批次补料时机。

图12 辅因子循环再生强化合成2′-FL结果

Fig.12 Cascade synthesis of 2′-FL with cofactor recycle

本研究基于多酶级联催化体系制备得到2′-FL,产量达到3.40 g/L。与已报道的微生物发酵法相比[31-33],酶催化法在产量上仍存在明显差距。然而,多酶级联催化合成2′-FL反应体系简洁,不受细胞代谢网络干扰,更有利于FucT等关键酶的快速筛选与催化性能的验证优化。研究表明,通过提升FucT的催化性能可显著提高2′-FL的合成效率[33-35]。因此,围绕FucT开展酶挖掘与性能优化,对于推动2′-FL合成效率提升具有重要意义。本研究通过筛选获得H.m-FucT并显著提高了其可溶表达水平,希望可为其在多酶催化体系及后续微生物发酵体系中的应用提供潜在的优良酶源。

3 结 论

本研究围绕2′-FL生物合成的核心限速酶FucT,系统开展了酶挖掘、可溶表达优化及多酶级联催化体系构建。筛选获得来源于Helicobacter mustelae的H.m-FucT,并通过分子伴侣共表达促溶策略改善H.m-FucT表达,使H.m-FucT可溶性蛋白表达量提升了6倍。在此基础上,构建了由H.m-FucT、双功能酶FKP与多聚磷酸激酶PPK2组成的体外多酶级联催化体系,利用单因素优化实验获得了较优反应条件,即反应温度为37 ℃、酶质量浓度为1.0 mg/mL、岩藻糖与乳糖的浓度比为1∶2、ATP与GTP浓度比为1∶2、Mg2+浓度为5.0 mmol/L。进一步通过反应能量循环与分批补料,制备得到了2′-FL,产量达到3.40 g/L。本研究从酶的挖掘、可溶表达优化到多酶体系构建,形成了完整的技术链条,希望为2′-FL的绿色合成提供新的工具酶及工艺支撑。未来可进一步通过酶的分子改造与反应过程优化提高FucT的催化性能,并应用于2′-FL合成细胞工厂构建,进而提升2′-FL的产量与生产效率。

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Research on Mining and Expression of α-1,2-Fucosyltransferase and Its Catalytic Synthesis for 2′-Fucosyllactose

Li Tiantian1, Wei Wei2, Mao Hongwei1, Jiang Min1, Gong Jinsong1, Su Chang1, Xu Zhenghong3, Shi Jinsong1, Li Heng1,*

(1.School of Life Science and Health Engineering Jiangnan University/Key Laboratory of Carbohydrate Chemistry and Biotechnology, Ministry of Education, Wuxi 214122, China;2.School of Bioengineering, Jiangnan University, Wuxi 214122, China;3.College of Biomass Science and Engineering, Sichuan University, Chengdu 610065, China)

Abstract： 2′-Fucosyllactose (2′-FL), one of the most commercially valuable human milk oligosaccharides, relies on an efficient α-1,2-fucosyltransferase (FucT) for its biosynthesis. However, existing FucT commonly suffer from low heterologous expression levels, poor solubility, and insufficient catalytic activity, which constitute critical bottlenecks restricting the large-scale synthesis of 2′-FL. In this study, an FucT from Helicobacter pylori (H.p-FucT) was used as a probe to mine novel FucT genes from the genomes of Helicobacter species. Through homologous sequence alignment and phylogenetic analysis, three candidate FucT-encoding genes were identified. These three candidate genes, along with the template gene, were recombinantly expressed, and their soluble expression levels and catalytic activities were comprehensively compared. Among them, the FucT from Helicobacter mustelae (H.m-FucT) was selected for further enhancement of soluble expression via molecular chaperone co-expression. Five molecular chaperone co-expression systems were constructed, among which pKJE7 exhibited the most pronounced solubilizing effect, increasing the soluble expression level of H.m-FucT by approximately 6-fold compared with the control group without co-expression. Subsequently, a bifunctional enzyme FKP and polyphosphate kinase PPK2 were co-expressed to establish an in vitro multi-enzyme cascade catalytic system encompassing fucose activation, transglycosylation, and cofactor recycling. Through single-factor optimization combined with a fed-batch strategy, 2′-FL was produced, reaching a titer of 3.40 g/L. This study aimed to expand the sources of FucT and enhance its soluble expression level, with the goal of providing enzyme resources and technical support for the efficient synthesis of 2′-FL and other fucosylated human milk oligosaccharides.

Keywords： fucosyltransferase; molecular chaperone; solubility-enhancing expression; 2′-fucosyllactose; enzymatic synthesis

doi：10.12301/spxb202600202

文章编号：2095-6002(2026)04-0107-13

引用格式：李甜甜,位薇,茅洪维,等. α-1,2-岩藻糖基转移酶的挖掘、表达及催化合成2′-岩藻糖基乳糖研究[J]. 食品科学技术学报,2026,44(4):107-119.

Li Tiantian, Wei Wei, Mao Hongwei, et al. Research on mining and expression of α-1,2-fucosyltransferase and its catalytic synthesis for 2′-fucosyllactose[J]. Journal of Food Science and Technology, 2026,44(4):107-119.

中图分类号： TS201.3

文献标志码： A

收稿日期： 2026-04-19

基金项目： 国家自然科学基金资助项目(22278181)。

Foundation： National Natural Science Foundation of China (22278181).

第一作者： 李甜甜,女,硕士研究生,研究方向为生物制药。

*通信作者： 李 恒,女,副教授,博士,主要从事营养化学品生物制造与评价方面的研究。E-mail: liheng@jiangnan.edu.cn。

(责任编辑：叶红波)