酱香型白酒中有极为丰富的风味化合物,这与其复杂的生产工艺和发酵周期密切相关。酱香型白酒由7种不同轮次的基酒陈酿后混合勾调而成,不同轮次基酒的风格特点与口味不尽相同[1]。因此,对轮次基酒风味成分的分析对于解析酱香型白酒复杂风味体系,提高酱香型白酒品质具有重要意义。

酱香型白酒的研究聚焦于挥发性风味成分,对其不挥发化合物的系统研究则相对缺乏。挥发性成分的研究中,Yang等[2]通过GC-FID结合多种机器学习解析轮次酒,发现酯类化合物是不同轮次间的标志化合物,同时在区分等级方面有重要作用;孙优兰等[3]通过HS-SPME/LLME-GC-MS分析并筛选出13种影响轮次酒风味演变的关键醇类与酯类物质。不挥发化合物虽然不呈香气,但通常会影响饮料酒的味觉和口感,长链脂肪酸如肉豆蔻酸和棕榈酸有脂肪味或苦味,糖类化合物会影响酒的甜味或干味,使酒体丰满[4],不挥发有机酸会影响白酒中果味和酸味的呈现和感知[5],与酯类化合物香气构成协同或叠加效应[6],添加了不挥发化合物的重组样品的风味也更接近于真实酒样。此外,长链脂肪酸乙酯也会影响果香的香气持久性[7]。由此可知不挥发化合物会显著影响酒精饮料的风味感知,但关于酱香型白酒中不挥发化合物的研究很少,仅见杨会等[8]使用N,O-双(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺[N,O-bis(trimethylsilyl) trifluoroacetamide,BSTFA]衍生化方法定量了不同香型白酒中27种不挥发有机酸,4种氨基酸和15种多羟基化合物,发现有机酸和氨基酸在酱香型和芝麻香型白酒中含量较高。酱香型白酒的盘勾以轮次酒为基础,但目前尚未见针对轮次酒中不挥发化合物的系统研究,因此开展该方向的靶向分析具有重要意义。衍生化方法可以通过降低化合物的极性来加强其挥发性,结合气相色谱利于更多微量化合物的检测[9],便于实现化合物的靶向精确定量。常见的衍生化试剂有BSTFA和MTBSTFA [N-甲基-N-(叔丁基二甲基硅烷)三氟乙酰胺(N-methyl-N-(tert-butyldimethylsilyl)trifluoroacetamide)],其中BSTFA则更适合空间位阻较大的化合物,对于糖和糖醇的检测效果也比较理想[10]。

本研究拟将衍生化方法与GC-MS相结合,分析同一生产周期的7个轮次酱香型轮次酒中不挥发化合物的精确构成以及量比,研究它们在7个轮次基酒之间的变化规律。通过正交偏最小二乘判别分析(orthogonal partial least squares discriminant analysis,OPLS-DA)建立模型并筛选出轮次之间含量变化显著的差异化合物,分析了它们的变化原因以及可能造成轮次酒味觉差异的部分贡献。通过认识酱香型基酒中不挥发化合物的组成,旨在为优化后续分级以及勾调工艺进而提高和改善酱香白酒的口感和味觉奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

样品:2023年7个轮次酱香型基酒,每轮次3个基酒样品均为年度综合样品,酒精度均在52% vol～54% vol;7个轮次酒醅,每轮次开窖酒醅,由5点取样法混合取得,均由贵州珍酒酿酒有限公司提供。

标准品与试剂:80个标准品[包括乳酸、十六烷酸(棕榈酸)、2-羟基异己酸、油酸、亚油酸、2-羟基丁酸、2-羟基戊酸、2-羟基己酸、3-羟基丁酸、羟基乙酸(乙醇酸)、甘油酸、3-羟基丙酸、2-乙基-3-羟基丁酸、2-羟基-2-甲基丁酸、2-羟基-3-甲基丁酸、2-羟基-3-甲基戊酸、4-羟基-2-甲基丁酸、柠檬酸、富马酸(反丁烯二酸)、马来酸(顺丁烯二酸)、苹果酸、琥珀酸(丁二酸)、十二烷酸(月桂酸)、十四烷酸(肉豆蔻酸)、十五烷酸、草酸(乙二酸)、丙二酸、壬二酸、酒石酸、2-呋喃甲酸、哌啶酸、丙氨酸、亮氨酸、焦谷氨酸、苏氨酸、谷氨酸、色氨酸、天冬氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、酪氨酸、蛋氨酸(甲硫氨酸)、丝氨酸、赖氨酸、3-苯基乳酸、苯甲酸、苯甲醇、苯乙醇、苯乙酸、苯丙酸、2,3-丁二醇、1,2-丙二醇、1,3-丙二醇、1,4-丁二醇、2,5-己二醇、3-甲基-1,3-丁二醇、甘油、阿东糖醇、阿拉伯糖醇、赤藓糖醇、半乳糖醇、肌醇、甘露醇、鲨肌醇、苏糖醇、木糖醇、阿拉伯糖、果糖、半乳糖、核糖、木糖、葡萄糖、甘露糖、麦芽糖、蔗糖、海藻糖、乙醇胺、琥珀酸单乙酯、硼酸、3-羟基吡啶]。BSTFA[含体积分数为1%的三甲基氯硅烷(TMCS)]、吡啶(pyridine)、水杨苷[D-(-)-salicin],色谱纯,美国Sigma-Aldrich有限公司。无水乙醇,分析纯,上海麦克林生化科技股份有限公司。

酸性蛋白酶试剂盒、中性蛋白酶试剂盒,上海百生跃生物科技有限公司。

1.2 仪器与设备

7890A-5975C型气质联用仪,美国Agilent公司;氮吹仪,上海安谱实验科技股份有限公司;旋转蒸发仪,德国Buchi公司。

1.3 实验方法

1.3.1 白酒样品的前处理方法

参照杨会等[8]的方法,取20 mL酒样于50 mL旋转蒸发瓶中,加入50 μL水杨苷水溶液(质量浓度为10 mg/L)作为内标化合物,温度40 ℃,绝对压强4 500 Pa,转速60 r/min,旋转蒸发至1 mL,取100 μL转移到2 mL样品瓶中,在高纯氮气流下吹干。

因乳酸、十六烷酸、2,3-丁二醇和1,2-丙二醇在酒样中浓度较高,检测这4种不挥发化合物时,酒样无须浓缩。只需直接量取200 μL酒样置于2 mL进样小瓶中,加入50 μL水杨苷水溶液(质量浓度为10 mg/L)内标化合物,随后在室温下以温和氮气吹干,以待衍生化处理。

1.3.2 BSTFA衍生化

吹干后的样品中依次加入100 μL BSTFA(含体积分数为1%的TMCS)和50 μL吡啶,摇匀后70 ℃反应3 h,24 h内进行GC-MS分析。

1.3.3 GC-MS分析

使用HP-5MS色谱柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm);进样口温度280 ℃,不分流进样;氦气以1 mL/min的流速流动;升温程序为65 ℃维持2 min,6 ℃/min升温至300 ℃,保持10 min;EI电离源,离子源温度:300 ℃。电子能量70 eV,扫描范围65～650。

1.3.4 不挥发化合物定量方法

根据对同一生产周期的7个不同轮次酱香型基酒样品的不挥发性成分的定性结果,对可购买标准品的化合物采用内标法定量,其余成分仅进行半定量分析。

标准曲线的绘制:以46% vol酒精水溶液配制各种标准品的混合溶液,2倍梯度稀释后进行衍生化操作和进样分析,方法同酒样。

以各个标准品与水杨苷的峰面积之比为横坐标、各个标准品与水杨苷的浓度之比为纵坐标,分别建立标准曲线。

检测限和定量限的确定标准分别为信噪比等于3和10时所对应的最低浓度值。各项分析实验均进行3次,且独立重复。日内精密度通过测定1 mg/L浓度水平下各化合物的3次平行样品获得(单日内完成)。日间精密度则通过连续3天分别进行日内精密度测试来确定。所有分析过程均为三次重复。为评估方法准确性,开展了实际酒样的加标回收实验。

1.3.5 酒醅酶活力分析

由酸性蛋白酶试剂盒和中性蛋白酶试剂盒分别测定。

1.3.6 感官评价方法

成立由10名研究生组成的感官评价小组,均为本研究室白酒风味化学研究方向且具有 2 年以上的感官实验基础,掌握评价方法。实验前针对酒样的味觉特征确定描述词(酸味、甜味、苦味、涩味),在品评时分别对各属性强度进行评分。评分采用0至5分制,其中0分代表未感知到该味觉,5分代表所感知到的味觉强度最高,最终结果基于评分计算得出。

1.4 数据处理

使用SIMCA 14.1软件进行OPLS-DA。使用Origin 2022软件绘制柱状图、雷达图等。使用IBM SPSS Statistics 22进行单因素方差分析(ANOVA)。

2 结果与分析

2.1 不同轮次酱香型基酒中不挥发化合物分析结果

在同一生产周期的7个不同轮次酱香型基酒样品中共检出85种不挥发性成分,其中80种通过标准品进行定量分析,80种化合物的标准曲线见附录附表1,其精确定量结果见附录附表2;5种化合物半定量分析结果见附录附表3。

表1 不同轮次酒醅蛋白酶活性

Tab.1 Protease activity of fermented grains from different rounds nmol/(min·mg)

种类酶活性第一轮次第二轮次第三轮次第四轮次第五轮次第六轮次第七轮次酸性蛋白酶活性18.44±2.9821.22±3.4536.12±5.1241.21±5.8545.11±3.5128.47±2.4830.58±4.66中性蛋白酶活性47.59±9.4764.15±15.93174.21±33.69265.13±46.02254.21±36.93141.63±22.5135.43±32.61

80种不挥发性化合物共包含30种有机酸、14种氨基酸、6种芳香族化合物、7种醇、9种糖醇、10种糖以及4种其他化合物,其中2-羟基戊酸、2-羟基-3-甲基戊酸、硼酸、乙醇胺、苏糖醇、3-羟基吡啶和哌啶酸为首次在白酒中发现。对不同轮次酱香型基酒中不挥发化合物组分进行比较,结果见图1。由图1可知,不挥发化合物总量随轮次增加先升高后降低,在第四轮次达到峰值,其中有机酸占比最高,不同轮次基酒中占所有不挥发化合物的74%～89%;醇类次之,占11%～25%;其余化合物含量相加不到总量的1%。

图1 不同轮次酱香型基酒中不挥发化合物组分比较

Fig.1 Non-volatile compounds comparison of soy-sauce aroma and flavor type raw liquors from different rounds

2.1.1 有机酸含量变化

30种有机酸中共有16种羟基酸、7种二羧酸、6种长链脂肪酸、1种杂环酸(糠酸)。有机酸含量随轮次的变化见图2。由图2可知,随着轮次的增加,羟基酸和二羧酸的含量均先上升后下降,长链脂肪酸的含量不断下降,而糠酸的含量不断升高。

每种化合物的柱状图从左至右分别表示从第一轮次到第七轮次。

图2 不同轮次酱香型基酒中有机酸化合物含量的变化

Fig.2 Organic acids variation in soy-sauce aroma and flavor type raw liquors from different rounds

在所有酸中,乳酸含量最高,其次是棕榈酸,这两种酸的含量远高于其他酸,再次是2-羟基异己酸。在不同轮次基酒中乳酸含量占整个不挥发有机酸的62%～89%。乳酸的含量从第一轮次酒的704.95 mg/L上升到第四轮次酒的2 544.94 mg/L,随后略有下降,但仍保持在较高水平(约1 500 mg/L)。棕榈酸的含量次之,从第一轮次酒的474.84 mg/L持续下降到第七轮次酒的124.00 mg/L。 棕榈酸来自植物籽粒的脂肪,它是高粱中含量最高的脂肪酸,从发酵第三轮开始不再添加高粱,添加的高温大曲中棕榈酸的含量仅为100 μg/g左右[11],随着酿造轮次的增加,其含量也逐渐减少。其余酸中,2-羟基异己酸含量从第一轮次酒的1 377.74 μg/L上升到第四轮次酒的4 259.65 μg/L,再下降到第七轮次酒的2 574.67 μg/L,与其他常见酸呈现涩味和鲜味不同,它具有甜味。羟基酸的主要来源是氨基酸,如2-羟基丁酸主要由苏氨酸在多种酶的催化下产生[12],而2-羟基异己酸主要源自亮氨酸[4]。目前并未见到有关新发现的2-羟基戊酸和2-羟基-3-甲基戊酸这两种羟基酸的相关生物来源。柠檬酸、琥珀酸和苹果酸等三羧酸循环相关的酸均在第三、四、五轮次含量较高,说明此时发酵旺盛,酶系代谢活跃,因此羟基酸的含量均在中间轮次较高。另外,糠酸比较特别,其含量从第一轮次酒的543.16 μg/L一直上升到第七轮次酒的2 121.13 μg/L,共上升1 577.97 μg/L。这一规律与其前体物质糠醛在轮次基酒中的变化规律一致[3],蒸馏时,戊糖在酸性和高温条件下转化成糠醛[13],同时,糠醛也会以空气或氧气为氧化剂转化为糠酸[14],在酱香型白酒的酿造过程中,独特的“多轮次蒸煮”工艺使原料中的戊糖在酸性高温条件下反复经历反应,不断地产生糠醛,这一过程可能是造成糠醛及其氧化产物糠酸在后续轮次中持续生成并逐渐积累的关键机制。

2.1.2 氨基酸含量变化

14种氨基酸含量随轮次的变化见图3。由图3可知,14种氨基酸含量均随轮次增加先升高后降低,其总量较低,在第四轮次达到峰值(3.48 mg/L),仅为有机酸的0.16%。本研究测定了不同轮次酒醅中蛋白酶活性,测定结果见表1。由表1可知,酸性蛋白酶在第五轮次时活性最高,而中性蛋白酶在第四轮次时活性最高,与氨基酸的变化规律一致。

每种化合物的柱状图从左至右分别表示从第一轮次到第七轮次。

图3 不同轮次酱香型基酒中氨基酸化合物含量的变化

Fig.3 Amino acids variation in soy-sauce aroma and flavor type raw liquors from different rounds

氨基酸中谷氨酸的含量最高,脯氨酸的含量次之,其次是天冬氨酸,分别在第四轮次酒中达到峰值892.63 μg/L、802.32 μg/L、389.42 μg/L。酿造原料高粱和小麦蛋白质中这三类氨基酸的占比同样较大,其中谷氨酸的含量占比最大(约20%)。新发现的哌啶酸根据其结构推测是赖氨酸环化后羧基化产生的,但尚未发现相关研究证实这一点。对不同香型成品酒游离氨基酸的比较中发现[15],酱香型白酒中检测到的氨基酸种类最多。

2.1.3 芳香族化合物含量变化

6种芳香族化合物含量随轮次的变化见图4。由图4可知,这6种化合物的含量均随轮次增加先升高后降低,且在后续轮次中均保持较高水平。

每种化合物的柱状图从左至右分别表示从第一轮次到第七轮次。

图4 不同轮次酱香型基酒中芳香族化合物含量的变化

Fig.4 Aromatic compounds variation in soy-sauce aroma and flavor type raw liquors from different rounds

芳香族化合物中,苯乙酸的含量最高,苯乙醇的含量次之,再次是苯甲醇。三者均在前三轮次酒中缓慢增加,分别在第四轮次酒中陡增到3 398.32、3 123.23、2 888.87 μg/L,在第五轮次酒达到最大值4 549.31、3 772.65、3 035.41 μg/L后下降,并且在后四轮次酒中一直保持着较高的含量。苯丙氨酸是苯乙醇的主要前体,并能衍生出多种芳香族化合物[16-18],芳香族化合物的含量变化趋势也与本研究中苯丙氨酸的一致。

2.1.4 醇类化合物含量变化

醇类化合物含量随轮次的变化见图5。由图5可知,不挥发化合物中醇类的总含量仅次于有机酸,约占总不挥发化合物的11%～25%,且含量均在中间轮次较高。

每种化合物的柱状图从左至右分别表示从第一轮次到第七轮次。

图5 不同轮次酱香型基酒中醇类化合物含量的变化

Fig.5 Alcohols variation in soy sauce aroma and flavor type raw liquors from different rounds

2,3-丁二醇含量最高,1,2-丙二醇的含量次之,二者含量(均超过几十mg/L)远高于其他醇类。2,3-丁二醇的含量在所有不挥发化合物中仅次于乳酸,从第一轮次酒的142.52 mg/L开始持续上升,在第三、四、五轮次酒中均保持在较高的水平(约500 mg/L),然后下降到第七轮次酒的399.23 mg/L。 它与糖代谢密切相关,中间轮次其含量高,说明乙酰乳酸合成酶、乙酰乳酸还原酶等酶活性高,微生物代谢旺盛[19]。它是酒类中少数呈香的多元醇,有黄油,水果香,呈甜味。1,2-丙二醇在第三轮次酒达到峰值90.16 mg/L,之后缓慢下降到第七轮次酒的57.06 mg/L。1,2-丙二醇主要通过以下两种微生物转化生成:厌氧条件下,乳酸菌、大肠杆菌等可通过甲基乙二醛途径再经丙酮醛还原酶作用将葡萄糖生成1,2-丙二醇;嗜酸乳杆菌可将甘油加氢还原为1,2-丙二醇[20-21]。甘油含量最低,在第三轮次酒中达到最高水平的2 039.61 μg/L,甘油产生途径的关键酶基因GPD1基因在高渗条件下高效表达[22-23]。这3种醇类物质均与糖代谢密切相关,轮次生产中发酵旺盛时期(第三、四、五轮次酒),2,3-丁二醇、1,2-丙二醇和甘油的含量更高。

2.1.5 糖醇类化合物含量变化

糖醇类化合物含量随轮次的变化见图6。由图6可知,不挥发化合物中糖醇的含量极低,总量在第三轮次时就达到峰值1 613.01 μg/L,也仅占所有不挥发化合物的0.07%。

每种化合物的柱状图从左至右分别表示从第一轮次到第七轮次。

图6 不同轮次酱香型基酒中糖醇类化合物含量的变化

Fig.6 Alditols variation in soy-sauce aroma and flavor type raw liquors from different rounds

糖醇中赤藓糖醇的含量最高,阿拉伯糖醇次之,分别从第一轮次酒的193.70、128.41 μg/L逐渐升高到第三轮次酒的508.04、390.73 μg/L,之后迅速下降,在第七轮次酒时仅有65.80和106.22 μg/L。 再次是甘露醇,其含量在第二、三、四轮次酒中比较接近(约380 μg/L),在其他轮次中均明显较少(约240 μg/L)。关于基酒中糖醇的研究较少,仅在芝麻香型和老白干香型中少量存在[24]。糖醇的来源一般有2种:一种是通过相应的糖的还原,另一种是通过其他多元醇合成[25-26]。新发现的苏糖醇并未明确其生物来源,但在解脂耶氏酵母的研究中发现,来源于Scheffersomyces stipitis CBS6054的木糖醇脱氢酶或许能将赤藓糖醇转化为苏糖醇[27]。糖醇可以作为渗透压保护剂,代谢物含量较高时,酵母会产生相应的糖醇来应对高渗环境刺激[28]。酱香白酒生产过程中第三轮次底物发酵旺盛,整体处于高渗环境,因此此时糖醇的含量也为最高。

2.1.6 糖类化合物含量变化

糖类化合物含量随轮次的变化见图7。由图7可知,糖类在蒸馏过程中通过物料夹带进入酒中,总含量仅占不挥发化合物的0.03%～0.08%。随着轮次数的增加,二糖(除海藻糖以外)从开始就持续被水解,海藻糖与单糖的含量先升高后降低。

每种化合物的柱状图从左至右分别表示从第一轮次到第七轮次。

图7 不同轮次酱香型基酒中糖类化合物含量的变化

Fig.7 Sugars variation in soy-sauce aroma and flavor type raw liquors from different rounds

二糖中麦芽糖的含量最高,蔗糖次之,再次是海藻糖。随着轮次的增加,麦芽糖和蔗糖被持续分解,含量分别从第一轮次酒的244.56和182.06 μg/L降低至第六轮次酒和第五轮次酒的低于检测限。海藻糖较为特殊,其含量从第一轮次酒开始持续升高,在第五轮次酒时达到峰值(80.34 μg/L)之后下降至第七轮次酒的42.26 μg/L。海藻糖在细胞中作为渗透保护剂和代谢调节剂[29],在中间轮次高渗环境含量会升高。单糖中葡萄糖的含量最高,木糖次之,分别从开始的427.42和199.51 μg/L上升到第三轮次酒的933.65和778.39 μg/L,然后作为底物被消耗,降低至第七轮次酒的179.38和168.71 μg/L。蔗糖和麦芽糖会分解成葡萄糖和果糖,原料中的木质素和半纤维素会分解成木糖和甘露糖。因此单糖的含量会先升高,之后作为底物被消耗,含量会再下降。

2.1.7 其他化合物含量变化

其他化合物(包括硼酸、乙醇胺、3-羟基吡啶和琥珀酸单乙酯)的含量变化见图8。琥珀酸单乙酯和乙醇胺的含量均随轮次增加先升高后降低。生物体内游离乙醇胺的主要来源是含乙醇胺的磷脂(主要是磷脂酰乙醇胺,PE),其主要由甘油、磷酸、脂肪酸和乙醇胺4部分组成[30]。3-羟基吡啶含量在轮次间较为稳定,根据衍生时使用的溶剂吡啶推断其由吡啶在衍生过程中氧化生成,之后设计空白实验发现空白样中3-羟基吡啶含量也在200 μg/L左右,验证了这一推测。硼酸含量无明显变化规律,考虑到其来源主要为矿石和卤水,推测其可能源于酿造用水或储酒容器中。

每种化合物的柱状图从左至右分别表示从第一轮次到第七轮次。

图8 不同轮次酱香型基酒中其他化合物含量的变化

Fig.8 Other compounds variation in soy-sauce aroma and flavor type raw liquors from different rounds

2.2 不同轮次酱香型基酒中差异化合物的筛选和分析

2.2.1 差异化合物的筛选

以7个轮次中的不挥发化合物建立的OPLS-DA模型见图9。模型中和均大于0.5,表明模型可以有效解释数据和组间差异,拥有较高的拟合和解释能力;Q2大于0.5,表明模型对新样本有良好的预测能力。样本表现出良好的独立性以及拟合效果。同时,经过200次置换检验,Q2回归线截距为-0.752,显著小于零,R2为0.298,小于0.4,说明模型不存在过拟合,模型验证有效。以VIP≥1和P<0.05为标准筛选不同轮次基酒之间的差异化合物,共筛选出8种关键差异化合物,分别为2,3-丁二醇、棕榈酸、苏氨酸、苹果酸、甘油、亚油酸、2-羟基丁酸和糠酸。

图9 OPLS-DA识别不同轮次基酒的关键差异化合物

Fig.9 Identification of key differential compounds of soy-sauce aroma and flavor type raw liquors from different rounds based on OPLS-DA

2.2.2 差异化合物的分析

8种差异化合物中,亚油酸和棕榈酸来自植物油脂,是高粱中重要的脂肪酸,其含量明显随轮次增加下降,且在第三轮次酒之后降幅超过50%。棕榈酸和亚油酸的纯品没有气味,在水溶液中也不呈味[31],一般并不直接影响白酒的风味。2,3-丁二醇、苹果酸、甘油等化合物与糖代谢密切相关,2-羟基丁酸是苏氨酸的代谢产物,二者的含量与生物氮代谢强度显著关联,在轮次酿造中第三、四、五轮次发酵旺盛,此时这5种物质的含量均显著较高。甘油、2,3-丁二醇、苏氨酸呈甜味,2-羟基丁酸具有酸味,苹果酸具有强烈的酸味,带有轻微的苦味和刺激性[31]。此外,苏氨酸是某些吡嗪类化合物的生物合成前体[32],这些吡嗪化合物是酱香白酒中特有的化合物,在酱香风味的呈现方面起着重要作用[33]。糠酸源于戊糖在酸性高温环境下水解,经过多轮反复蒸煮,糠酸的含量也进而随轮次增加逐渐升高,其在酒精水溶液中呈皱感涩味[31]。这些相对较高含量的化合物在轮次间显著变化也许会引起对应的口感和味觉变化。

2.3 不同轮次酱香型基酒的感官评价结果

为探究7个轮次酱香白酒的口感差异,基于感官评价所得数据构建口感轮廓图(见图10)。结果表明,第一、二轮次基酒酸味较为突出,第三、四、五轮次基酒甜味的呈现更加明显,而第六、七轮次的苦味和涩味特征会更加突出。结合2.1节和2.2节的研究,我们推测以甘油和2,3-丁二醇为主的醇类和苏氨酸可能对于甜味的贡献较大,涩味口感的呈现可能与含量一直随轮次升高的糠酸有关。此外,Luo等[34]的研究表明,糠醛在酒精水溶液中具有明显的苦味,其含量在第一到第七轮次的不断增加或许会增强感官人员对苦味的感知。

图10 酱香型基酒口感特征轮廓

Fig.10 Taste profile of soy-sauce aroma and flavor type raw liquors

2.4 酱香型基酒中不挥发化合物代谢通路分析

对所定量的80种化合物进行的代谢通路分析见图11,注释的38条代谢通路中,30条属于新陈代谢,之后进行富集分析,其中富集程度最高的5条通路分别为半乳糖代谢,与半乳糖、葡萄糖、甘油和肌醇等代谢物相关,半乳糖通过半乳糖激酶(GALK)、半乳糖-1-磷酸尿苷酰转移酶(GALT) 和尿苷二磷酸半乳糖表异构酶(GALE) 三步酶促反应,最终转化为1-磷酸葡萄糖(进而变为6-磷酸葡萄糖),进入糖酵解途径。肌醇、甘油是半乳糖自然存在形式中的载体;丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢,与这3种氨基酸以及柠檬酸、富马酸和琥珀酸等代谢物相关,3种氨基酸分别对应糖代谢的3个关键节点,通过转氨酶实现双向调控;淀粉与蔗糖代谢,与葡萄糖、蔗糖和海藻糖等糖代谢相关;丁酸盐代谢,主要包括3-羟基丁酸、谷氨酸和琥珀酸等成分,通过“GABA支路”直接连接的谷氨酸和琥珀酸以“琥珀酸半醛”作为代谢节点与丁酸盐代谢支路形成交集;苯丙氨酸代谢,主要包括苯丙氨酸、苯乙酸和酪氨酸等成分,苯丙氨酸通过羟化反应转化为酪氨酸或通过转氨/脱羧流向苯乙酸。

图11 酱香型基酒不挥发化合物KEGG通路富集分析

Fig.11 KEGG pathway enrichment analysis of soy-sauce aroma and flavor type raw liquors

3 结 论

采用BSTFA衍生化法结合GC-MS对7个轮次基酒进行分析,靶向精确定量了80种不挥发化合物。长链脂肪酸和海藻糖以外的二糖来自原料,含量随轮次增加不断降低,糠酸经由多轮高温蒸煮形成,含量不断增加。其余化合物包括短链和中链脂肪酸、海藻糖、单糖、芳香族化合物、醇类和糖醇含量先增加后减少,分别在第三、四、五轮次酒中达到峰值。通过OPLS-DA建立模型筛选出8种关键化合物:甘油、2,3-丁二醇、苏氨酸、2-羟基丁酸、苹果酸、棕榈酸、亚油酸和糠酸,它们为轮次间变化显著的特征成分,结合味觉感官评价实验推测它们与基酒中甜味和涩味的呈现有关。根据KEGG分析结果推测,相关的代谢通路主要富集在半乳糖、淀粉和几种氨基酸代谢中。本研究首次较为完整地分析了酱香型基酒的不挥发化合物组成特征,总结了不挥发化合物在轮次酿造中的变化规律以及相关代谢途径,同时分析了差异化合物潜在的呈味贡献,有助于解析酱香白酒的化学特征和口感品质的进一步研究。

附录:补充数据

与本文相关的补充数据可以在http:∥dx.doi.org/10.12301/spxb202600056在线版本中找到。

Appendix:supplementary data

Supplementary data associated with this article can be found in the online version, at http:∥dx.doi.org/10.12301/ spxb202600056.

参考文献：

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Analysis of Non-Volatile Compounds in Soy-Sauce Aroma and Flavor Type Raw Liquors Based on BSTFA Derivatization

Gao Zihang1, Fan Wenlai1,3,*, Xu Yan1,3, Tang Shaopei2,3, Li Tingting2,3

(1. Lab of Brewing Microbiology and Applied Enzymology/Key Laboratory of Industrial Biotechnology of Ministry of Education (Jiangnan University), School of Biotechnology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China;2. Guizhou Technology Innovation Center of Jiangxiangxing Baijiu, Zunyi 563000, China;3. Baijiu Fermentation Technology Research Center of Jiangnan University-Kweichow Zhen Distillery Co., Ltd., Wuxi 214122, China)

Abstract： Non-volatile compounds (NVCs) are important for the taste and mouthful of Baijiu, but few studies were carried out on NVCs up to now. The soy-sauce aroma and flavor type raw liquors (SSRLs) from 7 different rounds in the same production cycle were detected using N,O-bis-(trimethylsilyl)trifluoroacetamide (BSTFA) derivatization combined with GC-MS, and 80 kinds of NVCs were targetedly and precisely quantified. As the number of the rounds increased, the contents of long-chain fatty acids and disaccharides other than trehalose that derived from the raw materials in SSRLs decreased, while the content of furoic acid was the opposite. The contents of short and medium chain fatty acids, trehalose, monosaccharides, aromatic compounds, alcohols and alditols increased first and then decreased. Alditols reached their peak in the 3rd round SSRL, while the rest peaked in the 4th or the 5th round SSRL. 8 NVCs with high content and significant variation were screened by OPLS-DA, including 2,3-butanediol, palmitic acid, threonine, malic acid, glycerol, linoleic acid, 2-hydroxybutyric acid, and furoic acid. It was speculated that they were related to the presentation of sweetness and astringency in the different rounds of SSRLs. Pathway analysis suggested that the metabolisms of these NVCs were mainly concentrated in galactose, starch, and several amino acid metabolic pathways. The study clarified the composition and proportion of non-volatile compounds in sauce-flavor Baijiu, aiming to provide a theoretical reference for an in-depth understanding of its complex taste profile.

Keywords： soy-sauce aroma and flavor type raw liquor; non-volatile compounds; N,O-bis-(trimethylsilyl)trifluoroacetamide derivatization; different rounds; targeted quantification

doi：10.12301/spxb202600056

文章编号：2095-6002(2026)04-0070-12

引用格式：郜子航,范文来,徐岩,等. 基于BSTFA衍生化法的酱香型轮次酒不挥发化合物分析[J]. 食品科学技术学报,2026,44(4):70-81.

Gao Zihang, Fan Wenlai, Xu Yan, et al. Analysis of non-volatile compounds in soy sauce aroma and flavor type raw liquors based on BSTFA derivatization[J]. Journal of Food Science and Technology, 2026,44(4):70-81.

中图分类号： TS261.7

文献标志码： A

收稿日期： 2026-01-30

基金项目： 国家重点研发计划项目(2022YFD2101201);黔科合平台项目[JSZX(2025)002]。

Foundation： National Key R&D Program of China(2022YFD2101201); Guizhou Provincial Science and Technology Projects[JSZX(2025)002].

第一作者： 郜子航,男,硕士研究生,研究方向为酒类风味化学。

*通信作者： 范文来,男,研究员,主要从事酿酒工程和酒类风味化学方面的研究。E-mail: wenlai.fan@163.com。

(责任编辑：李 宁)