水牛乳富含乳蛋白、乳脂肪、矿物质及微量元素,被誉为“奶中之王”[1]。水牛乳营养成分优于奶牛乳,蛋白质、脂肪、总固形物含量约为奶牛乳的1.42、1.94、1.40倍[2]。此外,水牛乳蛋白为完全蛋白,含有人体所需全部必需氨基酸,且不含牛奶中部分致敏蛋白,可能更适合过敏人群[3-7]。

谷氨酰胺转氨酶(transglutaminases,TGase,EC2.3.2.13)属于酰基转移酶[8]。目前广泛应用于工业生产的是微生物谷氨酰胺转氨酶(microbial transglutaminase,mTGase),其作用温度和适用pH值范围较广,并且激活不需要依赖Ca2+。因此,mTGase 是食品加工中常用的蛋白质改性酶[9-10]。

在低脂或者脱脂酸奶制备中,减少脂肪常导致凝胶结构松散、乳清析出增加、口感不够滑顺且营养释放效率降低,这些问题削弱了产品的感官吸引力与消费者接受度。mTGase可催化蛋白质间形成 ε-(γ-谷氨酰)赖氨酰交联键,强化蛋白网络结构,从而有效改善低脂酸奶的质地,减少分水现象[11]。此外,有研究表明在脱脂牛奶酸奶中,mTGase 与蛋白质-谷氨酰胺酶(protein-glutaminase, PG)联合使用,不仅可显著提升酸奶的硬度和黏度,同时能弥补口感粗糙和乳清析出的缺陷,从而提高整体感官接受度[12]。然而,现有研究多集中于普通牛乳体系,针对水牛乳,尤其是其脱脂产品中mTGase的应用机制与效果尚不明确。水牛乳乳蛋白含量高、酪蛋白胶束结构独特,这可能显著影响mTGase的交联行为与最终凝胶特性,目前相关系统研究仍较缺乏,限制了该酶在高端脱脂乳制品中的精准应用。

本研究以脱脂水牛乳为原料,采用 mTGase 对乳蛋白进行交联,再经乳酸菌发酵,制备脱脂水牛乳酸奶。通过测定酸奶的营养和风味指标,结合非靶向代谢组学解析不同处理组酸奶的差异代谢物并预测关键代谢通路,分析肽的功能活性,阐明mTGase在脱脂水牛乳体系中的作用机制。研究旨在为mTGase在特色脱脂乳制品中的应用提供理论依据,并为高蛋白乳源的品质提升提供新思路。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

水牛乳(脂肪质量分数4.44%±0.27%),巴福乐槟榔江水牛良种繁育有限公司;浓缩乳清蛋白粉(蛋白质质量分数80.00%),美国希尔玛配料公司;菊粉,山东冠赢生物科技有限公司;蔗糖,广州福正东海食品有限公司;发酵剂(YO-MIX 883),法国丹尼斯克;mTGase(1 000 U/g),江苏一鸣生物股份有限公司。

1.2 仪器与设备

PEN3型电子鼻,德国AIRSENSE Analytics公司;SA402B型电子舌,日本INSENT公司;GJB1000-60型高压均质机,常州市均质机械有限公司;DHG-9070A型电热鼓风干燥箱,上海一恒科学仪器有限公司;EPED-ESL-10TH型超纯水机,南京易普易达科技发展有限公司;H2-16KR型台式高速冷冻离心机,湖南可成仪器设备有限公司;LDZM-60KCS型立式压力蒸汽灭菌锅,上海申安医疗器械厂;HYP-308型消化炉,上海纤检仪器有限公司;SCIENTZ-18N型真空冷冻干燥机,上海比朗仪器制造有限公司;AX223ZH/E型电子天平,奥豪斯仪器(常州)有限公司,Vanquish Horizon system UHPLC型液相色谱仪,Q-Exactive HF-X型质谱仪,赛默飞世尔科技(中国)有限公司;19091N-133 HP-INNOWax型色谱柱(30 m×250 μm×0.25 μm),安捷伦科技(中国)有限公司;ACQUITY UPLC HSS T3型色谱柱(100 mm×2.1 mm, 1.8 μm),美国沃特世科技有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 脱脂水牛乳酸奶的制备

1)脱脂。将水牛乳置于离心瓶中,使用高速冷冻离心机在4 ℃以4 000 r/min离心15 min,过滤去除上层脂肪,得到脱脂水牛乳脂肪质量分数为0.80%±0.01%。

2)预热调配。在脱脂水牛乳中加入乳清蛋白粉,搅拌溶解,45 ℃下静置水合30 min,预热至60～65 ℃,添加质量分数10%的蔗糖混匀后加入菊粉(菊粉与乳清蛋白的质量比为1∶4,二者总添加量为质量分数2.5%),搅拌溶解。

3)均质、杀菌及冷却。使用高压均质机在22～25 MPa将经预热调配的水牛乳均质5次,然后加热至90 ℃,杀菌10 min。将杀菌后的水牛乳置于冰水浴中迅速冷却至45 ℃。

4)接种、添加mTGase。将170 U/L的mTGase与发酵剂(接种量为0.05 g/L)同时添加至水牛乳中,充分搅拌使其溶解,记为mTGase。对照组不添加mTGase。

5)发酵与冷藏。使用商用酸奶发酵机42 ℃下发酵8 h后,于4 ℃冷藏24 h即得到成品。

1.3.2 脱脂水牛乳酸奶营养指标及乳酸菌数的测定

依据GB 5009.3—2016中直接干燥法测定水分含量,依据GB 5009.6—2025中碱水解法测定脂肪含量,依据GB 5009.5—2025中凯氏定氮法测定蛋白质含量,依据GB 4789.35—2023测定乳酸菌数。

1.3.3 脱脂水牛乳酸奶风味的测定

气味测定:使用电子鼻的直接顶空进样法检测。将样品密封于离心管,设置传感器自清洗时长100 s、样品准备时长5 s、进样流速400 mL/min、分析采样时长100 s后进行检测。

滋味测定:使用电子舌进行检测。样品经10倍稀释、离心并过滤后获得待测滤液。检测前,传感器需经清洗液和参比液依次清洗并归零。测试时,先味值测试时间为30 s,随后进行回味测试30 s。

1.3.4 脱脂水牛乳酸奶游离脂肪酸的测定

样品中脂肪酸的测定参照GB 5009.168—2016《食品安全国家标准 食品中脂肪酸的测定》进行。

1)样品前处理:称取0.5 g样品于洁净容器中,加入3 mL正己烷,并加入0.8 mol/L NaOH-甲醇溶液密封处理。在超声波清洗仪中超声2 h,随后静置30 min。将混合液置于高速离心机中,以3 000 r/min离心10 min,再次静置30 min,待分层后取上清液。所得溶液经0.45 μm微孔滤膜过滤,作为待测溶液。

2)气相色谱条件:采用色谱柱进行分离,载气为高纯氦气(99.99%),流速恒定在1 mL/min。进样口温度设定为280 ℃,分流比为20∶50。程序升温过程为初始温度50 ℃并维持3 min,随后以8 ℃/min的速率升温至210 ℃并保持23 min,最后以1 ℃/min的速率升至225 ℃后保留7 min。

3)质谱条件:MSD检测参数设置为离子源温度230 ℃,四极杆温度150 ℃,进样口温度280 ℃,柱流量1 mL/min,最高耐温400 ℃,柱温初始 50 ℃。采用质量选择检测器进行定性与定量分析。

1.3.5 脱脂水牛乳酸奶游离氨基酸的测定

参照GB 5009.124—2016,采用氨基酸自动分析仪完成酸奶中游离氨基酸的测定。称取约30 mg酸奶样品置于20 mL洁净安瓿瓶中,加入10 mL 6 mol/L盐酸溶液,经超声振荡溶解后喷火封口,于110 ℃烘箱中酸水解23 h。水解液冷却后过滤,滤液转移至石英坩埚中,70 ℃水浴蒸干,残渣用3 mL稀释液溶解,经0.45 μm滤膜过滤后得待测溶液。仪器分析采用离子交换色谱-茚三酮柱后衍生法,使用阳离子交换柱(4.6 mm×60 mm),柱温57 ℃,检测器温度135 ℃;缓冲液流速为0.45 mL/min,茚三酮试剂流速0.25 mL/min;检测波长分别设为570 nm(第一通道)和440 nm(第二通道),进样量20 μL,总分析时间约130 min。

1.3.6 脱脂水牛乳酸奶代谢物的检测

准确称取(200±5) mg样品置于2 mL离心管中,加入6 mm研磨珠及800 μL含内标的提取液(甲醇与水体积比为4∶1)。样品首先在-10 ℃、50 Hz条件下冷冻研磨6min,随后于5 ℃、40 kHz下超声提取30 min,再置于-20 ℃静置30 min。之后在4 ℃、12 000 r/min条件下离心15 min,取上清液转移至带内插管的进样小瓶中以备检测;同时从每个样品中取20 μL上清液混合制备质控样本。上机检测采用质谱联用系统。柱温40 ℃,进样量3 μL;流动相A为含体积分数0.1%甲酸的体积分数5%的乙腈水溶液,流动相B为含体积分数0.1%甲酸的乙腈-异丙醇-水混合液(体积比为47.5∶47.5∶5.0)。质谱分析采用电喷雾电离源,正、负离子模式采集,质量扫描范围m/z为70～1 050,主要参数包括鞘气流速50 arb,辅助气流速13 arb,加热器温度425 ℃,毛细管温度325 ℃,正离子模式喷雾电压3 500 V,负离子模式喷雾电压-3 500 V,S-Lens电压50,阶梯碰撞能20%/40%/60%,Full MS分辨率60 000,MS2分辨率7 500。质控样本由所有待测样本提取液等体积混合制备,其体积与单个样本相同,处理及检测流程与分析样本一致,每检测5～15个样本后插入一个质控样本,以监控整个分析过程的稳定性。

1.3.7 肽理化性质及功能活性的预测

1)分子质量、亲水性及净电荷量计算网站:https:∥www.allpeptide.com/。

2)生物活性评分网站:PeptideRanker(http:∥bioware.ucd.ie/～compass/ biowareweb/Server_ pages/ peptideranker.php)。

3)肽毒性预测网站:ToxinPred(http:∥crdd.osdd.net/raghava/toxinpred/)。

1.4 数据处理

使用Microsoft Office Excel 2019对数据进行整理, Progenesis QI v3.0软件对代谢组学数据进行处理,Graphpad prism 8.0、Origin 2018绘图;使用Design expert10.0进行响应面试验设计分析,使用 Metabo Analyst 5.0软件进行主成分分析(principal component analysis,PCA)和正交偏最小二乘法判别分析(orthogonal partial least squares-discriminant analysis,OPLS-DA);使用IBM SPSS Statistics 24.0对数据进行统计学分析。所有实验进行3次重复,结果以平均值±标准偏差表示。

2 结果与分析

2.1 mTGase处理对脱脂水牛乳酸奶营养成分及乳酸菌数的影响

对脱脂水牛乳酸奶的水分、脂肪和蛋白质含量及乳酸菌数进行测定,结果如表1所示。2组水牛乳脱脂酸奶的水分、脂肪、蛋白质含量均无显著差异(P>0.05),虽然mTGase组乳酸菌数低于对照组,但是两者之间也无显著差异(P>0.05),说明添加 mTGase 后对脱脂水牛乳酸奶的营养成分及乳酸菌的存活率没有影响。这与Dinkci等[13]的研究结果一致,他们在制作以牛奶为原料的酸奶时添加mTGase,发现mTGase的添加对酸奶的总固体、脂肪、蛋白质等化学成分无明显影响,并且对乳酸菌的存活率也无明显影响。

表1 脱脂水牛乳酸奶营养指标及乳酸菌数

Tab.1 Nutritional indicators and lactic acid bacteria of skimmed buffalo milk yogurt

组别w(水分)/%w(脂肪)/%w(蛋白质)/%乳酸菌数/(CFU/g)对照组78.46±0.19a0.33±0.02a5.91±0.17a1.42×109amTGase组78.59±0.38a0.30±0.03a5.88±0.24a1.32×109a

2.2 mTGase处理对脱脂水牛乳酸奶气味与滋味的影响

2.2.1 脱脂水牛乳酸奶气味分析

电子鼻通过仿生嗅觉分析技术能够快速、灵敏、无损地对样品的挥发性气味信息进行综合评价[14]。2组脱脂水牛乳酸奶气味测定结果见图1。由图1(a)可知,2组样品距离较远,这表明2组脱脂水牛乳酸奶的挥发性气味物质有所差异。第一主成分贡献率为97.8%,第二主成分贡献率为2.2%,累计贡献率为100%,说明这2个主成分可以解释100%的变量,可以反映2组脱脂水牛乳酸奶挥发性气味物质的主要信息。由图1(b)可知,2组样品在W3C(氨、芳香分子)、W1W(含硫化合物)、W2W(芳烃化合物、硫的有机化合物)、W3S(烷烃类和脂肪族)这几个传感器上的响应值有所差异;经mTGase交联处理后,指示脱脂水牛乳酸奶中芳烃化合物和烷烃相同小写字母表示同列数据差异不显著(P>0.05)。

W1C:芳烃化合物;W5S:氮氧化合物;W3C;氨、芳香分子;W6S:氢化物;W5C:烯烃、芳香族,极性分子;W1S:烷烃类;W1W:含硫化合物;W2S:醇类,部分芳香族化合物;W2W:芳烃化合物、硫的有机化合物;W3S:烷烃类和脂肪族。

图1 脱脂水牛乳酸奶气味分析结果

Fig.1 Analysis results of skimmed buffalo milk yogurt order

类及脂肪族化合物含量的传感器响应值分别增加了10.31%和10.38%,而指示含硫化合物含量的传感器响应值降低了9.63%,这表明,mTGase 调控了脱脂水牛乳酸奶风味物质的分布。mTGase处理选择性增加了疏水性风味化合物的保留,并促进不良含硫化物的掩蔽或转化,最终推动整体风味特征向更为柔和、协调的方向发展。

2.2.2 脱脂水牛乳酸奶滋味分析

电子舌可以将电脉冲转化成味觉信号并测量酸奶的滋味,消除感官评价中的主观性[15]。使用6个传感器对2组脱脂水牛乳酸奶的滋味进行检测,结果如图2所示。由图2可知,2组脱脂水牛乳酸奶样品的酸味、涩味、鲜味、咸味没有太大差异,但苦味和苦味回味分别增加了6.72%和10.92%,而甜味降低了15.84%,说明mTGase交联处理改变了脱脂水牛乳酸奶的风味,与感官评价结果[16]一致。这主要归因于mTGase催化形成的致密蛋白网络,一方面,其可能暴露或产生了更多疏水性苦味氨基酸和肽,并增强了其在口腔中的持续释放,导致苦味及回味显著提升;另一方面,该网络结构也可能通过物理包埋或空间位阻作用,部分掩蔽了糖类物质的呈味位点,从而导致甜味感知下降。综上所述,mTGase在改良质构的同时,也会通过物理化学途径特异性调控脱脂水牛乳酸奶的滋味平衡。

图2 脱脂水牛乳酸奶电子舌雷达图

Fig.2 Electronic tongue radar of skimmed buffalo milk yogurt

2.3 mTGase处理对脱脂水牛乳酸奶游离脂肪酸的影响

脂肪降解对酸奶风味的形成起关键作用。游离脂肪酸(free fatty acids,FFA) 主要包含了短链脂肪酸(short-chain fatty acid,SCFA) 、中链脂肪酸(me-dium-chain fatty acid,MCFA) 、长链脂肪酸(long-chain fattyacid,LCFA)等,这些FFA是构成产品滋味和形成产品风味的关键物质。

2.3.1 FFA含量分析

2组脱脂水牛乳酸奶中游离脂肪酸含量见表2。对照组的FFA共有23种,mTGase组共有22种,相较对照组少了1种LCFA,二十一碳酸。2组的LCFA在组内的含量均最多,MCFA次之,SCFA最低;mTGase组的LCFA和MCFA含量相较于对照组更高,SCFA含量低于对照组。

表2 脱脂水牛乳酸奶游离脂肪酸含量

Tab.2 Contents of free fatty acids in skimmed buffalo milk yogurt

序号FFAw/%对照组mTGase组1丁酸(C4∶0)2.637±0.136a2.265±0.017b2己酸(C6∶0)1.454±0.082a1.360±0.010b3辛酸(C8∶0)0.837±0.031a0.800±0.007a4癸酸(C10∶0)1.745±0.049a1.709±0.007b5月桂酸(C12∶0)2.333±0.044a2.265±0.021a6十三烷酸(C13∶0)0.126±0.007a0.137±0.006a7豆蔻酸(C14∶0)10.903±0.089a10.762±0.027a8肉豆蔻酸烯酸(C14∶1)0.637±0.027a0.629±0.024a9十五烷酸(C15∶0)1.464±0.017a1.463±0.022a10棕榈酸(C16∶0)36.731±0.157a36.554±0.043a11棕榈油酸(C16∶1)2.337±0.012a2.345±0.012a12十七烷酸(C17∶0)0.824±0.050a0.790±0.017a13硬脂酸(C18∶0)11.496±0.119b11.710±0.008a14油酸(C18∶1)22.403±0.117b22.933±0.089a15亚油酸(C18∶2)2.597±0.0230b2.690±0.020a16花生酸(C20∶0)0.251±0.009a0.236±0.007a17二十碳烯酸(C20∶1)0.294±0.030a0.303±0.011a18亚麻酸(C18∶3)0.259±0.014b0.286±0.009a19二十一碳酸(C21∶0)0.044±0.015a0±0b20山嵛酸(C22∶0)0.092±0.010a0.109±0.007a21(Z)-8,11,14-二十碳三烯酸(C20∶3)0.164±0.006b0.188±0.010a22二十碳四烯酸(C20∶4)0.230±0.012b0.265±0.023a23二十四烷酸(C24∶0)0.140±0.02b0.202±0.001a

不同小写字母表示同行数据差异显著(P<0.05)。

酸奶中的FFA主要来源于乳脂,并在发酵过程中通过乳酸菌的酶促反应释放出来。适量的游离脂肪酸有助于提升酸奶的风味,赋予其更丰富的口感和香气,其中SFFA,如丁酸和乙酸,对风味形成尤为关键[17]。SCFA和MCFA具有典型风味特征,而LFFA虽不直接贡献酸味,但能增强酸奶的顺滑感和润滑度,且具备较高的营养价值,尤其表现出潜在的心血管保护作用,如降低低密度脂蛋白胆固醇水平并改善血脂状况[18]。2组脱脂水牛乳酸奶中共同检出19种LCFA,其中棕榈酸和油酸含量较高。棕榈酸可作为天然饱和高级脂肪酸为机体供能;油酸作为一种广泛存在于动植物油脂中的单不饱和脂肪酸,有助于降低胆固醇和三酰甘油水平,进而降低心血管疾病风险[19]。不饱和脂肪酸在维持细胞正常生理功能、降低胆固醇及改善血液循环等方面也具有积极作用[20]。2组脱脂水牛乳酸奶中共检测到8种不饱和脂肪酸,且mTGase组含量高于对照组。进一步对比分析表明,mTGase处理导致二十一碳酸未检出,可能反映酶对特定长链脂肪酸释放的调控作用。2组脱脂水牛乳酸奶不同FFA含量由高到低均为LCFA、MCFA、SCFA,说明乳脂水解以长链脂肪酸释放为主,这有助于赋予酸奶醇厚口感与润滑质构;mTGase组更高的LCFA与MCFA含量,可增强其质地细腻度与风味饱满度,而较低的SCFA则可减轻过度刺激的酸味,使风味更趋平衡。从不饱和脂肪酸含量更高也可推测,mTGase处理可能在改善脂肪释放模式的同时,提升了脱脂水牛乳酸奶的功能性潜力,对酸奶的质构、风味协调性与健康效益均产生了积极影响。

2.3.2 FFA差异分析

2组脱脂水牛乳酸奶的游离脂肪酸差异见图3。在图3(a)中,PC1的贡献率为74.8%,PC2为15.8%,两者累计贡献率达90.6%,超过80%的阈值,说明这2个主成分能够代表绝大部分变量信息,基本涵盖2组脱脂水牛乳酸奶FFA的主要差异,且组间差异显著。图3(b)表明,对照组的关键差异组分包括丁酸、己酸、肉豆蔻酸烯酸等;而mTGase组则以油酸、硬脂酸等为主要贡献物质。通过PLS-DA分析筛选出VIP得分大于1的6种重要风味物质[图3(c)],分别为硬脂酸、丁酸、油酸、棕榈酸、豆蔻酸和亚油酸。在mTGase组中硬脂酸、油酸和亚油酸含量相对较高,而对照组中丁酸、豆蔻酸和棕榈酸含量相对较高。油酸与亚油酸作为重要的单不饱和与多不饱和脂肪酸,不仅能够增强体系润滑感,其已知的降低低密度脂蛋白胆固醇及抗炎作用也赋予了产品潜在的健康益处[21]。mTGase处理定向调控了脂肪酸的释放模式,mTGase组中LCFA含量高;而对照组丁酸等SCFA含量更高,后者可能贡献了更强烈的酸味与典型发酵风味。这种脂肪酸组成的差异系统性地改变了脱脂水牛乳酸奶的风味轮廓,同时也印证了mTGase处理对脱脂水牛乳酸奶品质的改良作用。

图3 脱脂水牛乳酸奶游离脂肪酸差异

Fig.3 Difference of free fatty acids of skimmed buffalo milk yogurt

2.4 mTGase处理对脱脂水牛乳酸奶游离氨基酸的影响

酸奶的风味和质地特性(酸度、香气、滑顺度、稠度、颗粒感等)不仅取决于乳酸菌发酵产生的有机酸与代谢产物,也与蛋白质水解释放出的游离氨基酸(free amino acids, FAA)密切相关。FAA能够直接或间接参与风味分子(醛、酮、酸类、含硫或挥发性氨基酸衍生物等)的形成,为酸奶提供鲜味、苦味或香甜调性。同时,蛋白质的水解与氨基酸释放也会影响蛋白质网络的结构,改变凝胶的强度、持水性及口感滑爽性[22]。研究游离氨基酸含量与酸奶在不同发酵条件、菌株、储藏时间下的质地与感官变动之间的关系,有助于优化加工工艺,提高产品风味一致性与消费者接受度[23]。此外,检测酸奶的游离氨基酸也可评估其营养价值,因为某些必需氨基酸的释放可提高蛋白质的利用率。

2.4.1 FAA含量分析

2组脱脂水牛乳酸奶的游离氨基酸含量见表3。从脱脂水牛乳酸奶中共检测出16种氨基酸,mTGase组的FAA总含量与对照组具有显著差异(P<0.05)。呈现甜味的氨基酸有Thr、Ser、Gly、Ala和Pro,呈现苦味的氨基酸有Val、Ile、Leu、His和Lys,呈现鲜味的氨基酸有Asp和Glu。与对照组相比,mTGase组显著提高了Cys、Ile和Pro含量,而Ser、Gly和Ala这些甜味氨基酸含量显著下降。Cys含量由对照组的(2.894±0.026) mg/mL提升至(3.150±0.054) mg/mL;Ile含量显著提高至(1.508±0.063) mg/mL。Cys是合成谷胱甘肽(GSH)的关键前体,而GSH是细胞内重要的抗氧化剂,能清除自由基,减轻氧化应激对细胞线粒体的损伤,维持能量代谢平衡,同时增强谷胱甘肽解毒功能,减少肝细胞损伤[24]。这说明mTGase处理的脱脂水牛乳酸奶可能具备更强的抗氧化潜力,有助于提升产品的保健价值与贮藏稳定性。Ile的增加使得mTGase组脱脂水牛乳酸奶的苦味和苦味回味变得更加明显,与滋味测定结果一致。这使得mTGase处理后的脱脂水牛乳酸奶在一定程度上平衡了由高含量游离脂肪酸带来的丰润口感,避免了风味过于甜腻。从产品开发角度看,苦味和苦味回味,能够提升脱脂水牛乳酸奶风味的层次感与复杂性,使其区别于传统酸奶的单一风味取向,更具独特性。

表3 脱脂水牛乳酸奶游离氨基酸含量

Tab.3 Contents of free amino acids of skimmed buffalo lactate milk

序号FAAρ/(mg/mL)对照组mTGase组1天冬氨酸(Asp,鲜味、酸味)6.668±0.099a5.377±0.143b2谷氨酸(Glu,鲜味、酸味)2.952±0.110a2.869±0.102a3脯氨酸(Pro,甜味)2.983±0.019b3.314±0.116a4丝氨酸(Ser,甜味)∗2.557±0.033a2.239±0.083b5甘氨酸(Gly,甜味)∗1.818±0.070a1.553±0.030b6苏氨酸(Thr,甜味)∗∗0.680±0.009a0.654±0.025a7丙氨酸(Ala,甜味)1.814±0.045a1.518±0.008b8组氨酸(His,苦味)∗∗∗2.982±0.115a2.561±0.024b9异亮氨酸(Ile,苦味)∗∗1.151±0.012b1.508±0.063a10缬氨酸(Val,苦味)∗∗1.500±0.010a1.437±0.025b11赖氨酸(Lys,苦味)∗∗0.835±0.008a0.777±0.014b12亮氨酸(Leu,苦味)∗0.822±0.014a0.838±0.005a13酪氨酸(Tyr,芳香味)∗0.868±0.021a0.837±0.023a14苯丙氨酸(Phe)∗∗1.298±0.053a1.294±0.016a15甲硫氨酸(Met)∗∗4.641±0.137a4.805±0.155a16半胱氨酸(Cys)∗2.894±0.026b3.150±0.054a

*表示半必需氨基酸; **表示必需氨基酸; ***表示婴儿必需氨基酸。不同字母表示同行数据差异显著(P<0.05) 。

2.4.2 FAA差异分析

2组脱脂水牛乳酸奶的游离氨基酸差异情况见图4。由图 4(a)可知,PC1贡献率为 84.9% ,PC2贡献率为6.9% ,PC1 和 PC2 之和为 91.8% ,基本可以反映2组脱脂水牛乳酸奶 FAA 的大部分信息。mTGase组样品分布在横坐标的正半轴,而对照组分布在负半轴,说明2组脱脂水牛乳酸奶间差异显著。图 4 (b) 中,mTGase组的主要贡献物是Cys、Ile、Pro和Met,对照组的主要贡献物是His、Gly、Ser和Asp等,这一差异说明mTGase处理显著改变了脱脂水牛乳酸奶游离氨基酸的组成模式,酶处理组中苦味相关氨基酸,如Ile与Met占比更高,可能与蛋白质交联及后续酶解过程中肽键选择性断裂有关。通过PLS-DA筛选出 6个重要风味物质,如图4(c)所示,分别为Asp、His、Ser、Ala、Ile和Gly。mTGase组中苦味氨基酸Ile贡献突出,而对照组中甜味与鲜味氨基酸(Gly、Ala、Ser、Asp)相对占优,这从风味物质构成角度解释了感官评价中酶处理组苦味增强、甜味略降低的结果。mTGase处理通过影响游离氨基酸谱,尤其是提升苦味氨基酸比例,直接调控了脱脂水牛乳酸奶的滋味特性。

图4 脱脂水牛乳酸奶游离氨基酸差异

Fig.4 Difference of free amino acids of skimmed buffalo milk yogurt

2.5 基于非靶向代谢组学的脱脂水牛乳酸奶代谢物分析

2.5.1 代谢物鉴定分析2组脱脂水牛乳酸奶的代谢物鉴定结果见图5。以质控(QC)样本中代谢物峰面积的相对标准偏差(RSD)评估数据稳定性,将RSD<0.3视为检测结果可靠。对2组脱脂水牛乳酸奶样本进行主成分分析(PCA),以评估组间代谢差异及组内变异程度,结果见图5(a)。主成分PC1和PC2的贡献率分别为42.00%和12.10%,累计贡献率为54.10%,能够反映样本大部分代谢物信息。对照组与mTGase组样本点分布距离较远,表明两者代谢物组成及丰度存在明显差异;同时各组样本点内部聚集程度高,说明组内重复性好、平行性较优。质控样本点集中分布,也表明检测仪器运行稳定,数据可靠性强。正交偏最小二乘法判别分析(OPLS-DA)是代谢组学研究中常用的有监督模式识别方法,可以去除与组分无关的信息,以更好区分组间差异[20]。通过OPLS-DA筛选2组脱脂水牛乳酸奶样品的差异代谢物,结果见图5(b)。对照组和mTGase组样本点分别位于得分图两侧,距离较远,并且没有明显离群点,表明2组脱脂水牛乳酸奶样品代谢物组间差异明显,组内平行较好。为了验证OPLS-DA模型是否准确可靠,本研究借助OPLS-DA置换检验中的决定系数R2Y和预测系数Q2对模型拟合效果进行评估,其中R2Y为模型对Y矩阵的解释能力,Q2为模型的预测能力,两者越接近1,模型越可靠稳定[25]。图5(c)为OPLS-DA置换检验分析,其中R2Y为1.0,Q2为0.997,两者均接近于1,表明该模型稳定可靠,预测能力好。

图5 脱脂水牛乳酸奶代谢物鉴定结果

Fig.5 Metabolite identification results of skimmed buffalo milk yogurt

2.5.2 差异代谢物筛选分析

代谢组学数据量大且维度高,因此采用单变量统计分析结合多元统计分析来筛选2组水牛乳脱脂酸奶的差异代谢物,结果见图6。本研究以OPLS-DA模型中的变量投影重要度(variable importance in the projection,VIP)、FC以及P值为筛选条件,以VIP>1、|FC|>1、P<0.05为标准进行组间差异代谢物筛选,绘制火山图。由图6(a)可知,横坐标为代谢物在2组脱脂水牛乳酸奶样本间表达差异的倍数变化对数值,纵坐标为代谢物表达量变化差异的统计学检验对数值,纵坐标值越高表明代谢物差异越显著。2组脱脂水牛乳酸奶样品中,共鉴定到281种差异代谢物,其中显著上调的有157种,显著下调的有124种。选取差异代谢物中丰度排名前30的代谢物进行聚类分析,结果如图6(b)所示。左侧为代谢物聚类的树状图,右侧为代谢物的名称,分支距离越近反映代谢物表达量越接近;热图颜色梯度表征代谢物的相对丰度,其中红色代表上调代谢物,蓝色代表下调代谢物。由聚类分析可以看出,2组脱脂水牛乳酸奶样品各自聚为一类,且样品组间差异明显,组内重复性较好。mTGase组脱脂水牛乳酸奶的代谢物中有1类上调(氨基酸和肽类),4类下调(3,4-二羟基苯乙醇-4-二葡萄糖苷、茄碱、1-氨基-2-甲基蒽醌和有机酸类)。结果表明,mTGase交联处理显著重塑了脱脂水牛乳酸奶的代谢物谱。氨基酸及肽类的普遍上调可能与酶处理促进蛋白质交联与降解的作用相关,这为脱脂水牛乳酸奶中苦味形成及潜在功能肽的生成提供了物质基础。而多类次级代谢产物,如酚苷、生物碱及部分有机酸的下调,则可能反映了发酵过程中微生物代谢通路的改变,或与交联后基质对代谢产物形成的物理微环境调控有关。

图6 脱脂水牛乳酸奶差异代谢物筛选

Fig.6 Screening of different metabolites of skimmed buffalo milk yogurt

2.5.3 差异代谢物VIP值分析

进一步以VIP>1、P<0.05为标准筛选VIP值排名前30的组间差异代谢物,结果见图7、表4。mTGase处理的脱脂水牛乳酸奶中,苏氨酸-丙氨酸-缬氨酸、异亮氨酸-异亮氨酸-天冬酰胺、异亮氨酸-亮氨酸、丝氨酸-谷氨酸-异亮氨酸、谷氨酸-异亮氨酸-缬氨酸、异亮氨酸-脯氨酸-缬氨酸、丙氨酸-苏氨酸-亮氨酸等二肽与三肽类物质的含量显著上调。这些肽类物质的积累,表明mTGase处理可能促进了蛋白质的定向水解与转化。现有研究提示,部分短肽,如含有异亮氨酸、缬氨酸和亮氨酸等残基的肽段在体外实验中显示出潜在的生物活性,例如具有血管紧张素转化酶抑制活性、降血压潜能[26-28]。尽管这些发现为食物源活性肽的研究提供了线索,但其在人体内的实际功效、有效剂量及生物利用度仍需通过后续研究进一步验证。因此,mTGase处理引发的短肽变化,说明了其在调控脱脂水牛乳酸奶蛋白质水解产物组成方面的作用,并为后续深入探索酸奶潜在营养功能提供了新的物质基础与分析方向。

图7 脱脂水牛乳酸奶的差异代谢物VIP分析

Fig.7 Analysis of VIP values of differential metabolites of skimmed buffalo milk yogurt

表4 上调的二肽、三肽序列理化性质及功能活性

Tab.4 Physicochemical properties and functional activities of up-regulated dipeptide and tripeptide sequences

氨基酸序列分子质量/Da亲水/疏水性净电荷数a生物活性评分值毒性评价苏氨酸-亮氨酸-谷氨酰胺361.18亲水-0.020.0474851无毒苏氨酸-丙氨酸-缬氨酸289.16疏水0.970.0404449无毒脯氨酸-亮氨酸-苏氨酸329.2疏水0.970.367192无毒精氨酸-谷氨酰胺-亮氨酸416.24亲水0.980.126352无毒异亮氨酸-苏氨酸232.14疏水0.970.0755293无毒脯氨酸-缬氨酸214.13疏水0.970.20792无毒亮氨酸-谷氨酰胺-酪氨酸388.2亲水-0.020.0533944无毒异亮氨酸-亮氨酸244.18疏水0.970.392515无毒谷氨酸-异亮氨酸-缬氨酸359.21疏水-0.020.0375422无毒异亮氨酸-脯氨酸-缬氨酸327.22疏水0.970.245694无毒丙氨酸-苏氨酸-亮氨酸303.18疏水0.970.1492无毒异亮氨酸-异亮氨酸-天冬酰胺358.22疏水0.970.176643无毒天冬酰胺-缬氨酸213.12疏水0.970.0417009无毒苏氨酸-异亮氨酸-丙氨酸303.18疏水0.970.0865824无毒丝氨酸-谷氨酸-异亮氨酸347.17亲水-0.020.0668787无毒

a.净电荷数测定条件为pH=7。

2.5.4 差异代谢物KEGG注释及KEGG富集通路分析

将2组脱脂水牛乳酸奶中鉴定到的差异性代谢物与KEGG 通路数据库进行比对,明确主要差异代谢物的代谢通路,并对其进行注释与分类,结果如图8。由图8(a)可知,纵坐标为KEGG代谢通路的二级分类,横坐标为注释到该通路下的代谢物个数。依据代谢物的生物学作用,代谢物的功能类别主要分为代谢(metabolism)、环境信息处理(environmental information processing)、生物体系统(organismal systems)和人类疾病(human diseases),其中,代谢类通路的差异代谢物数量占比最高,表明 mTGase 处理主要影响了与脱脂水牛乳酸奶发酵及品质形成密切相关的核心代谢过程。在代谢通路中,差异代谢物主要富集在9条代谢途径,分别为萜类和聚酮类代谢、碳水化合物代谢、其他氨基酸代谢、外源生物的降解和代谢、辅酶和维生素的代谢、脂质代谢、化学结构转化图谱、氨基酸代谢和其他次级代谢物的生物合成;其中,氨基酸代谢、脂质代谢和碳水化合物代谢占主导地位,这一结果与2.4节中游离氨基酸谱的变化相互印证。酸奶中的氨基酸作为重要前体,可与糖类发生美拉德反应,生成呋喃类物质,这类物质赋予酸奶独特的风味,可提升酸奶的品质[29-30]。而脂质是各种代谢产物不可缺少的成分,在许多生物过程中起着关键作用。乳脂肪中含有固醇、磷脂类和游离脂肪酸等物质[31-32],其中脂肪酸水解和微生物代谢产生的脂,对酸奶的风味具有一定影响[33]。例如,Christie 等[34]发现在不同乳制品中磷脂的相对组成差异很小,但绝对含量明显不同,且磷脂在发酵过程中会自动氧化生成醛、酮等小分子挥发性风味物质,这一过程是酸奶整体风味,特别是潜在脂香与醇厚感的重要组成部分。此外,碳水化合物是合成风味物质,包括烃、芳烃、醛、酮、酯、酸、醇、烯及烯醇以及杂环化合物等的前体或中间物质,对于酸奶的气味及滋味的形成具有较大影响[35]。具体而言,乳糖的酵解产物以及参与美拉德反应的还原糖,是形成酸奶特征性酸味及众多关键香气化合物的基础。综上所述,mTGase处理的脱脂水牛乳酸奶在气味和滋味上发生的改变,主要是氨基酸代谢、碳水化合物转化与脂质代谢三类代谢路径协同变化的结果,这从代谢通路层面系统解释了其风味特征的形成机制。

图8 脱脂水牛乳酸奶差异代谢物KEGG通路注释及富集分析

Fig.8 KEGG pathway annotation and enrichment analysis of differential metabolites of skimmed buffalo milk yogurt

为进一步筛选调控脱脂水牛乳酸奶代谢变化的关键通路,本研究对2组脱脂水牛乳酸奶中的差异代谢物的代谢通路进行富集分析。图8(b)为2组脱脂水牛乳酸奶的差异代谢物KEGG通路富集分析,横坐标表示通路中代谢物的相对重要性,气泡的大小代表相对重要性的大小。由图8(b)可知,2组脱脂水牛乳酸奶的差异代谢物主要的5个富集通路分别为赖氨酸降解,缬氨酸、赖氨酸和异亮氨酸的生物合成,生物素代谢,缬氨酸、赖氨酸、异亮氨酸的降解及托烷、哌啶、吡啶的生物合成。其中最重要的是氨基酸代谢通路,对比KEGG注释发现, mTGase处理显著上调的氨基酸主要是异亮氨酸等游离氨基酸,以及天冬酰胺-缬氨酸、异亮氨酸-苏氨酸、精氨酸-谷氨酰胺等二肽类物质,与游离氨基酸的分析结果相似。二肽类物质的积累,使得mTGase组脱脂水牛乳酸奶苦味氨基酸暴露增加,进而在感官评价中表现为苦味及苦味回味的增强。mTGase处理主要对脱脂水牛乳酸奶的氨基酸代谢通路产生影响,这可能是由于mTGase的交联作用使水牛乳蛋白中氨基酸组成发生改变,进一步影响氨基酸代谢。但是各代谢通路并非独立运作,而是通过代谢物共享与转化形成协同网络[36]。氨基酸代谢,如缬氨酸、亮氨酸的降解不仅改变游离氨基酸谱,还可通过生成乙酰辅酶A等中间产物,为脂质代谢提供前体,进而影响脂肪酸组成及其氧化衍生物的种类与含量[37];同时,赖氨酸、苯丙氨酸也是美拉德反应的关键底物,与碳水化合物代谢产生的还原糖共同作用,促进吡嗪、呋喃等特征性香气化合物的形成[38]。因此,mTGase处理虽然主要富集于氨基酸代谢通路,但其效应可通过代谢网络传递至脂质与碳水化合物代谢,最终通过多通路协同调控,共同形成mTGase组脱脂水牛乳酸奶在风味、滋味与感官品质上的整体特征。

3 结 论

本研究分析了mTGase交联处理对脱脂水牛乳酸奶品质的影响及其调控机制。结果表明,mTGase处理虽未显著改变脱脂水牛乳酸奶的基础营养指标,但通过催化蛋白质交联有效改善了产品品质。mTGase组苦味与苦味回味有所增加,气味则无显著影响。同时,mTGase通过促进不饱和游离脂肪酸的生成,不仅有助于增强脱脂水牛乳酸奶的心血管健康相关功能活性,也显著提升了口感的润滑性与连续性。非靶向代谢组学与游离脂肪酸分析进一步揭示,品质变化主要源于2条代谢通路的调控:一是氨基酸代谢通路中部分苦味氨基酸Ile的上调,虽带来轻微苦味,但伴随产生更多具有潜在健康益处的二肽与三肽;二是脂质代谢通路中不饱和脂肪酸比例的提升,不仅有益于功能活性,也是其细腻口感形成的原因。因此,mTGase在改善脱脂水牛乳酸奶质构与口感的同时,也通过代谢重组赋予其更丰富的健康潜能。本研究从品质形成与代谢调控两个层面,系统阐明了mTGase在脱脂水牛乳体系中的作用,旨在为高端乳制品创新应用提供理论依据,也为水牛乳的高值化开发提供新方向。

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Analysis of Nutrition and Flavor Characteristics of mTGase-Treated Skimmed Buffalo Milk Yogurt Based on Untargeted Metabolomics

FAN Yaozhu1, YANG Guoguo1, GU Zhili2, A Zhifen2, SUN Yayun2, FAN Jiangping1,HUANG Aixiang1, WANG Xuefeng1,*

(1.College of Food Science and Technology, Yunnan Agricultural University, Kunming 650201, China; 2.Yunnan Yunce Quality Testing Co., Ltd., Kunming 650501, China)

Abstract： Buffalo milk has garnered significant attention due to its high nutritional value. However, its high-fat content limits its application in modern healthy diets. A novel skimmed buffalo milk yogurt was prepared using microbial transglutaminase (mTGase) cross-linking technology combined with lactic acid bacteria fermentation. The results showed that there was no significant difference (P>0.05) in the contents of protein, fat, and other nutritional components between the mTGase-treated skimmed buffalo milk yogurt and the control group. Electronic nose and electronic tongue analyses indicated that in the mTGase-treated yogurt, the contents of aromatic compounds and alkanes and aliphatic compounds increased by 10.31% and 10.38%, respectively, while sulfur-containing compounds decreased by 9.63%. Bitterness and bitter aftertaste increased by 6.72% and 10.92%, respectively, whereas sweetness decreased by 15.84%. Analysis of free fatty acids (FFA) revealed that mTGase treatment increased the content of unsaturated FFAs, which may enhance cardiovascular health-related functional activity. Additionally, the increase in long-chain FFAs contributed to a smoother texture. Analysis of free amino acid composition showed significant changes in the amino acid profile of the yogurt. The content of cysteine (Cys), which is beneficial to health, increased from (2.894±0.026) mg/mL in the control group to (3.150±0.054) mg/mL in the mTGase-treated group. However, the content of isoleucine (Ile) significantly increased to (1.508±0.063) mg/mL, imparting a certain bitterness to the yogurt. Untargeted metabolomics results showed that mTGase treatment primarily altered amino acid metabolic pathways, leading to the upregulation of some bitter free amino acids, thereby increasing the bitterness of the yogurt. Nevertheless, mTGase cross-linking also promoted the formation of more dipeptides and tripeptides, enhancing the potential cardiovascular health-related functional activity of the yogurt. Furthermore, the changes in the odor and taste of the yogurt after mTGase treatment might be related to alterations in amino acids, lipids, and carbohydrates. This study aimed to provide a theoretical basis for the development of skimmed buffalo milk yogurt and to reveal the potential application value of mTGase in improving the flavor and nutritional functionality of yogurt.

Keywords： buffalo milk; skimmed yogurt; microbial transglutaminase; untargeted metabolomics; flavor characteristics

doi：10.12301/spxb202500493

文章编号：2095-6002(2026)03-0098-14

引用格式：范尧珠,杨果果,顾志利,等.基于非靶向代谢组学的mTGase脱脂水牛乳酸奶营养及风味特性分析[J]. 食品科学技术学报,2026,44(3):98-111.

FAN Yaozhu, YANG Guoguo, GU Zhili, et al. Analysis of nutrition and flavor characteristics of mTGase-treated skimmed buffalo milk yogurt based on untargeted metabolomics[J]. Journal of Food Science and Technology, 2026,44(3):98-111.

中图分类号： TS252.1

文献标志码： A

收稿日期： 2025-10-10

基金项目： 国家自然科学基金地区项目(32360562);云南省“兴滇英才支持计划”青年人才专项基金(2025—2029);云南省高校服务重点产业科技项目(FWCY-ZD2024008)。

Foundation: National Natural Science Foundation of China (32360562); Yunnan Funding of Young Talents Project of Support Plan for Talents of Xingdian (2025—2029); Yunnan Provincial Universities Service Key Industries Science and Technology Project (FWCY-ZD2024008).

第一作者： 范尧珠,女,博士研究生,研究方向为食品科学与工程。

*通信作者： 王雪峰,男,教授,博士,主要从事食品蛋白质资源利用与畜产品加工方面的研究。

(责任编辑：张逸群)